专利名称：牛轮状病毒重组vp6蛋白抗原及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种牛轮状病毒重组蛋白抗原及其制备方法。
背景技术：
牛轮状病毒(Bovine Rotavirus, BRA)又称犊牛腹泻病毒(Calf diarrhea virus),属于呼肠孤病毒科(及eov/W^^)轮状病毒属(i otov/n/力。牛轮状病毒主要 感染1 7日龄的犊牛，可引起犊牛消化道机能紊乱，临床上以呕吐、腹泻、脱 水和酸碱平衡紊乱为特征，感染牛常发生死亡，病死率可达50%。由于牛轮状 病毒具有流行广、发病率高、危害大的特点，现己发展成为一种世界性疾病。
牛轮状病毒的传统诊断方法常根据流行病学和临床表现作为初步诊断的 依据。但由于牛的轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)常常混合感染，且在流行病学和症状上很难区别，因此必须依靠病毒 分离和血清学实验才能最后确诊。
1968年美国Nebraska州Mebus等人用电镜从新生犊牛腹泻粪便中检测到 了轮状病毒，证明为新生犊牛腹泻的病原，并命名为NCDV株(Nebmska calf diarrhea Virus, NCDV)。随后，欧、美各国以及澳大利业、新西兰和日本等都 发现了轮状病毒引起的犊牛腹泻。此外，人们逐渐发现，将近一半的新生犊牛 腹泻与轮状病毒感染有关。
快速准确的疫病诊断是防治犊牛轮状病毒腹泻的重要前提。而目前我国还 没有一套行之有效的防治办法。在临床诊断上对可疑病料进行病毒分离与鉴定 是本病最为直接的诊断方法，但分离病毒需一定的条件和相当长的时间，因此， 目前病毒分离诊断方法存在着费时、费力又不能快速诊断的弊端。采用分子生 物学的RT-PCR方法是诊断犊牛轮状病毒腹泻目前常应用的方法，具有特异性 强及灵敏度高的优点；但该方法需要病毒核酸提取，反转录过程及PCR反应 等，过程繁琐，同时又需要昂贵的分子生物学试剂及相应的仪器设备等。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前对犊牛轮状病毒腹泻没有行之有效的防治
办法，且采用病毒分离的诊断方法存在着费时、费力又不能快速诊断的弊端，
以及采用分子生物学的RT-PCR方法过程繁琐、又需要昂贵的分子生物学试剂 及相应的仪器设备等问题，而提供的一种牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原及其 制备方法。
本发明牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原由重组载体质粒pProEXHTa转化的 大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达；其中重组载体质粒pProEXHTa中基因克隆 有牛轮状病毒NCDV株VP6基因。
本发明上述牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原按以下步骤制备 一、提取牛 轮状病毒NCDV株病毒核酸，然后以牛轮状病毒NCDV株VP6基因的下游引 物P2进行病毒基因组cDNA的合成，再用牛轮状病毒NCDV株VP6基因的 上游引物Pl和下游引物P2进行VP6基因的PCR扩增；二、将扩增得到的 VP6基因亚克隆至pMD18-T载体中，再经5awffl和5WI双酶切后克隆到原核 表达载体质粒pProEXHTa中，获得重组质粒pPro-VP6;三、用重组质粒 pPro-VP6转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌pPro-VP6/Rosetta(DE3);四、 重组VP6蛋白抗原的诱导表达；五、纯化，即得到牛轮状病毒重组VP6蛋白 抗原。
本发明为血清学方法诊断犊牛轮状病毒腹泻提供了诊断抗原，经实验证明 本发明牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原具有极强的特异性和准确性，能被抗血 清所识别。因此，使用本发明牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原、采用荧光抗体 试验和酶联免疫吸附等血清学试验就可以克服病毒分离和RT-PCR法存在的问 题，具有诊断方法省时、省力、快速的优点，而且不需要昂贵的分子生物学试 剂及相应的仪器设备。
本发明以大肠杆菌作为传递抗原的载体进行牛轮状病毒重组VP6蛋白， 设计了以编码牛轮状病毒主要结构蛋白VP6蛋白基因片断为耙基因，构建了 表达牛轮状病毒VP6蛋白的重组原核表达系统，克服了抗原排毒、散毒的潜 在危险。
同时本发明牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原为防治犊牛轮状病毒腹浑奠定 了物质基础。
本发明表达牛轮状病毒VP6蛋白重组大肠杆菌pPro-VP6/Rosetta(DE3)属
于埃希氏菌属(&c/zen'c^a)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保 藏地址是武汉大学，保藏日期为2008年09月02日，保藏号为CCTCC M 208124。
图l是具体实施方式
八中PCR鉴定结果图；图2是具体实施方式
八中步 骤四诱导表达的蛋白进行SDS-PAGE鉴定结果图；图3是具体实施方式
八产 物Western-blot鉴定结果图。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原由重组载体 质粒pProEXHTa转化的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达；其中重组载体质粒 pProEXHTa中基因克隆有牛轮状病毒NCDV株VP6基因。
本实施方式牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原蛋白分子质量约为50ku，并能 激发较强的免疫应答。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是牛轮状病毒 重组VP6蛋白抗原完整的开放读码框的基因序列如SEQ ID NO: 1所示。其 它与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原按以下步骤 制备 一、提取牛轮状病毒NCDV株病毒核酸，然后以牛轮状病毒NCDV株 VP6基因的下游引物P2进行病毒基因组cDNA的合成，再用牛轮状病毒NCDV 株VP6基因的上游引物Pl和下游引物P2进行VP6基因的PCR扩增；二、将 扩增得到的VP6基因亚克隆至pMD18-T载体中，再经BamHI和Sa/I双酶切 后克隆到原核表达载体质粒pProEXHTa中，获得重组质粒pPro-VP6;三、用 重组质粒pPro-VP6转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌 pPro-VP6/Rosetta(DE3);四、重组VP6蛋白抗原的诱导表达；五、纯化，即得 到牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得， 若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使
用操作手册。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤一中牛 轮状病毒NCDV株VP6基因的上、下游引物的基因序列为
上游引物PI: 5，-GGATCCTTGGCTTTTAAACGAAGTCTT-3，，
下游引物P2: 5'-GTCGACAATACCTAGACGCATCCTT-3'。其它步骤及参 数与实施方式三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤一中 VP6基因的扩增PCR反应体系为25(iL:水14.5jxL、 cDNA2.5^iL、 10XBuffer 2.5pL、 dNTP 4.0pL、 10OD引物上游1.0|xL、 10OD引物下游I.OjiL和rTaq 酶0.25^L; PCR反应条件:95。C预变性5 min， 94。C变性30s、 48'C退火30s、 72。C延伸50s、 30个循环，72'C延伸5min。其它步骤及参数与实施方式三相 同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤四重组 VP6蛋白抗原的诱导表达按以下步骤进行a、将重组菌pPro-VP6/Rosetta(DE3) 接种于氨苄青霉素浓度为100ng/mL的LB液体培养基，置于37'C环境中振荡 摇床培养过夜；b、将10mL过夜培养液接种于500mL氨苄青霉素浓度为 100pg/mL的LB液体培养基中，置于37。C、振荡摇床环境中培养至OD外o值 达0.5; c、再加入浓度为lmol/L的异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至LB 液体培养基中异丙基-P-D-硫代半乳糖苷的终浓度为0.6 mmol/L，然后置于37 。C、振荡摇床环境中继续培养至OD590值达1.0。其它步骤及参数与实施方式 三相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤五纯化 按以下步骤进行a、将N产-NTA凝胶介质加入层析柱，然后用去离子水洗柱, 再用Buffer A溶液洗柱；b、步骤四诱导表达后的培养液在10000g/min的条件 下离心20min，弃去上清液，沉淀菌体用Buffer A溶液溶解、室温环境搅拌lh， 再在4'C条件下继续搅拌过夜；c、在4。C、 20000g/min的条件下离心40min， 取上清液以0.5mL/min的流速加入到Ni-NTA层析柱中，用Buffer B以 0.5mL/min的流速洗涤层析柱，收集洗脱液，即完成纯化。其它步骤及参数与 实施方式三相同。
本实施方式Buffer A溶液能够裂解菌体，溶解沉淀。
具体实施方式
八本实施方式牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原按以下步骤 制备 一、提取牛轮状病毒NCDV株病毒核酸，然后以牛轮状病毒NCDV株 VP6基因的下游引物P2进行病毒基因组cDNA的合成，再用牛轮状病毒NCDV 株VP6基因的上游引物Pl和下游引物P2进行VP6基因的PCR扩增；二、将 扩增得到的VP6基因亚克隆至pMD18-T载体中，再经5amffl和Sa/I双酶切 后克隆到原核表达载体质粒pProEXHTa中，获得重组质粒pPro-VP6;三、用 重组质粒pPro-VP6转化大肠杆菌Rosetta(DE3)， 得到重组菌 pPro-VP6/Rosetta(DE3);四、重组VP6蛋白抗原的诱导表达；五、纯化，即得 到牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原；其中步骤一中牛轮状病毒NCDV株VP6基 因的上、下游引物的基因序列为
上游引物Pl: 5，-GGATCCTTGGCTTTTAAACGAAGTCTT-3，，
下游引物P2: 5'画GTCGACAATACCTAGACGCATCCTT-3，；
步骤一中VP6基因的扩增PCR反应体系为25^L:水14.5mL、cDNA2.5^iL、 10XBuffer2.5^iL、 dNTP4.0nL、 10OD引物上游1.0pL、 10OD引物下游l.O^L 和rTaq酶0.25pL; PCR反应条件95°C预变性5 min， 94。C变性30s、 48°C 退火30s、 72。C延伸50s、 30个循环，72。C延伸5min;
步骤四重组VP6蛋白抗原的诱导表达按以下步骤进行a、将重组菌 pPro-VP6/Rosetta(DE3)接种于氨苄青霉素浓度为lOO^ig/mL的LB液体培养 基，置于37'C环境中振荡摇床培养过夜；b、将10mL过夜培养液接种于500rnL 氨苄青霉素浓度为10(Hig/mL的LB液体培养基中，置于37。C、振荡摇床环境 中培养至0059()值达0.5; c、再加入浓度为lmol/L的异丙基-P-D-硫代半乳糖 苷(IPTG)至LB液体培养基中异丙基-p-D-硫代半乳糖苷的终浓度为0.6 mmol/L，然后置于37。C、振荡摇床环境中继续培养至00590值达1.0;
步骤五纯化按以下步骤进行a、将N产-NTA凝胶介质加入层析柱，然后 用去离子水洗柱，再用Buffer A溶液洗柱；b、步骤四诱导表达后的培养液在 10000g/min的条件下离心20min，弃去上清液，沉淀菌体用Buffer A溶液溶解、 室温环境搅拌lh，再在4。C条件下继续搅拌过夜；c、在4。C、 20000g/min的 条件下离心40min，取上清液以0.5mL/min的流速加入到Ni-NTA层析柱中，
用Buffer B以0.5mL/min的流速洗涤层析柱，收集洗脱液，即完成纯化。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得， 若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使 用操作手册。
本实施方式步骤二中经5amffl和Sa/1双酶切的VP6基因片段(约1.3kb) 与经S"wffl和^SWT双酶切的质粒pProEXHTa片段连接；然后通过步骤三转化 大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达。进行阳性重组质粒单酶切、双酶切和PCR 鉴定，鉴定结果如图1所示；图1中"1"泳道标样为PCR扩增获得的VP6 基因片段(大小约1300bp)， "2"泳道标样为质粒pProEXHTa经BamHI单酶 切获得的基因片段(大小约3900bp),"3"泳道标样为质粒pProEXHTa经BawHI 和5WI双酶切获得的基因片段(大小分别约2600bp和1300bp)， "4"和"8" 泳道标样为Marker, "5"泳道标样为以重组质粒pPro-VP6为模板、Pl和P2 为引物PCR扩增获得的基因片段(大小约1300bp)——本实施方式目的基因 片段，"6"泳道标样为重组质粒pPro-VP6经BamHI单酶切获得的基因片段 (大小约6100bp)， "7"泳道标样为重组质粒pPro-VP6经5amffl和Sa/I双 酶切获得的基因片段(大小分别约4800bp和1300bp)。鉴定结果说明VP6基 因已插入到表达载体质粒中，成功获得阳性重组菌pPro-VP6/ Rosetta(DE3)菌 株。
对本实施方式步骤四诱导表达的蛋白进行SDS-PAGE鉴定，鉴定结果如 图2所示；图2中"1"泳道标样为标准蛋白分子量(97kD-14kD)， "2"泳道 标样为未经IPTG诱导的pPro-VP6/Rosetta(DE3)菌体蛋白，"3"泳道标样为 经IPTG诱导lh的pPro-VP6/ Rosetta(DE3)菌体蛋白，"4"泳道标样为经IPTG 诱导3h的pPro-VP6/ Rosetta(DE3)菌体蛋白，"5"泳道标样为经IPTG诱导 5h的pPro-VP6/Rosetta(DE3)菌体蛋白，图2中箭头所示蛋白带约51 kD。
将本实施方式步骤五纯化后的产物经SDS-PAGE电泳后转印NC膜，再分 别与鼠源抗NCDV高免血清和羊抗鼠IgG/HRP作用，Western-blot鉴定对比实 验结果如图3所示；图3中"1"泳道标样为未经IPTG诱导的 pPro-VP6/Rosetta(DE3)菌体蛋白，"2 "泳道标样为经IPTG诱导的 pPro-VP6/Rosetta(DE3)菌体蛋白，"3"泳道标样为IPTG诱导的含质粒
pProEXHTa的菌体蛋白；实验结果是"1"和"3"泳道都未出现预期的反应 带，"2"泳道在预期位置(分子量50KD左右)出现明显的反应带，实验结 果说明目的蛋白获得了有效表达，表达的蛋白能被抗血清所识别，本实施方式 获得的重组抗原具有良好的抗原反应性。
采用病毒分离诊断和分子生物学RT-PCR多重诊断方法进行验证，结果证 明本实施方式获得的牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原对牛轮状病毒引发的犊牛 轮状病毒腹泻的诊断准确率高达90%以上。
序列表
〈110〉东北农业大学
<120>牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原及其制备方法
<勝3
〈210> 1 <211> 1269 <212> ■
<213>牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)
<400> 1
atggatgtcctgtactccttgtc犯犯actcttaaagatgaattgtcgaa60
ggcacattatactcc犯tgtaagtgatctaattcaac犯ttt犯tc犯atgat肪ttact120
atg犯tgg幼atgagttccei犯Ctgg鄉3attggtaatctaccgatteigaaattggaat180
tttgattttggattacttggcta^ttt3gatgctaactacgtcgaaacg240
gcccgcaatacaattgattattttgtagattttgtagataatgtatgtatggacgeiaatg300
gttagagaattgg犯ttgcaccacaatcagattcacttag360
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aacttgcagcgtg城ttac蹄tggcttccattagaagcatgcttgtc朋1200
6Lgctaaccacttggtatccgactttggtgagtatgtagctacgtcaagctgtttgaactc函
tgtaagtaa 1269
<210> 2 〈211> 27 <212> DNA <213>人工序列
〈220>
〈223>牛轮状病毒NCDV株VP6基因的上游引物P1。 〈400〉 2
ggatccttgg cttttaaacg aagtctt 27
<210〉 3 〈211〉 25 〈212> DNA <213〉人工序列
〈220〉
<223〉牛轮状病毒NCDV株VP6基因的下游引物P2。 〈400〉 3
gtcgacaata cctagacgca tcctt 2权利要求
1.牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原，其特征在于牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原由重组载体质粒pProEXHTa转化的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达；其中重组载体质粒pProEXHTa中基因克隆有牛轮状病毒NCDV株VP6基因。
2、 根据权利要求1所述的牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原，其特征在于牛 轮状病毒重组VP6蛋白抗原完整的开放读码框的基因序列如下所示ATGGATGTCCTGTACTCCTTGTCAAAAACTCTTAAAGATGCTAGAGA CAAAATTGTCGAAGGCACATTATACTCCAATGTAAGTGATCTAATTCAAC AATTTAATCAAATGATAATTACTATGAATGGAAATGAGTTCCAAACTGGA GGAATTGGTAATCTACCGATTAGAAATTGGAATTTTGATTTTGGATTACTT GGAACAACTCTACTAAATTTAGATGCTAACTACGTCGAAACGGCCCGCAA TACAATTGATTATTTTGTAGATTTTGTAGATAATGTATGTATGGACGAAATG GTTAGAGAATCACAAAGAAATGGAATTGCACCACAATCAGATTCACTTA GAAAGTTATCAGGCATTAAATTTAAAAGAATAAATTTTGACAATTCATCA GAATACATAGAGAACTGGAATTTGCAAAATAGAAGACAAAGaACGGGTT TTACATTTCATAAACCAAACATTTTcCCTTATTCAGCTTCATTCACGTTGAA CAGATCACAACCGGCTCATGATAACTTGATGGGTACGATGTGGCTCAATG CGGGATCAGAAATTCAGGTCGCTGGATTCGACTACTCATGTGCAATAAAC GCGCCAGCTAATACGCAACAATTTGAGCATATTGTACAGCTTCGAAGGGT GTTGACTACAGCTACAATAACTCTTTTACCAGATGCAGAAAGATTTAGTT TTCCAAGAGTGATTAATTCAGCTGACGGAGCGACTACATGGTACTTCAAT CCAGTGATTCTTAGACCAAATAACGTTGAAATAGAGTTTCTACTAAACGG GCAGATAATAAATACTTACCAAGCAaGATTTGGAACGATCATAGCTAGAA ATTTTGATACAATTAGATTGTCATTTCAGTTGATGAGACCACCAAATATGAGTGTATTTACAGTGGCTTCCATTAGAAGCATGCTTGTCAAATGAGGACCA AGCTAACCACTTGGTATCCGACTTTGGTGAGTATGTAGCTACGTCAAGCT GTTTG AACTCTGTAAGTAA 。
3、 如权利要求1所述牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原的制备方法，其特征 在于牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原按以下步骤制备 一、提取牛轮状病毒 NCDV株病毒核酸，然后以牛轮状病毒NCDV株VP6基因的下游引物P2进 行病毒基因组cDNA的合成，再用牛轮状病毒NCDV株VP6基因的上游引物 P1和下游引物P2进行VP6基因的PCR扩增；二、将扩增得到的VP6基因亚 克隆至pMD18-T载体中，再经5awHI和&/I双酶切后克隆到原核表达载体质 粒pProEXHTa中，获得重组质粒pPro-VP6;三、用重组质粒pPro-VP6转化 大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌pPro-VP6/Rosetta(DE3);四、重组VP6 蛋白抗原的诱导表达；五、纯化，即得到牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原。
4、 根据权利要求3所述的牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原的制备方法，其 特征在于步骤一中牛轮状病毒NCDV株VP6基因的上、下游引物的基因序列 为上游引物PI: 5，-GGATCCTTGGCTTTTAAACGAAGTCTT-3，， 下游引物P2: 5'-GTCGACAATACCTAGACGCATCCTT國3'。
5、 根据权利要求3所述的牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原的制备方法，其 特征在于步骤一中VP6基因的扩增PCR反应体系为25^L:水14.5pL、 cDNA 2.5(oL、 10 X Buffer 2.5pL、 dNTP4.0^L、 10OD引物上游1.0^iL、 10OD引物下 游1.0(jL和rTaq酶0.25^iL;PCR反应条件95。C预变性5 min, 94*€变性30s、 48。C退火30s、 72。C延伸50s、 30个循环，72。C延伸5min。
6、 根据权利要求3所述的牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原的制备方法，其 特征在于步骤四重组VP6蛋白抗原的诱导表达按以下步骤进行a、将重组菌 pPro-VP6/Rosetta(DE3)接种于氨苄青霉素浓度为lOOpg/mL的LB液体培养 基，置于37'C环境中振荡摇床培养过夜；b、将10mL过夜培养液接种于500rnL 氨苄青霉素浓度为10(Hig/mL的LB液体培养基中，置于37。C、振荡摇床环境 中培养至0059。值达0.5; c、再加入浓度为lmol/L的异丙基-p-D-硫代半乳糖 苷至LB液体培养基中异丙基-P-D-硫代半乳糖苷的终浓度为0.6 mmol/L，然后置于37°C、振荡摇床环境中继续培养至ODs卯值达1.0。
7、根据权利要求3所述的牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原的制备方法，其 特征在于步骤五纯化按以下步骤进行a、将N产-NTA凝胶介质加入层析柱， 然后用去离子水洗柱，再用Buffer A溶液洗柱；b、步骤四诱导表达后的培养 液在10000g/min的条件下离心20min，弃去上清液，沉淀菌体用Buffer A溶 液溶解、室温环境搅拌lh，再在4X:条件下继续搅拌过夜；c、在4°C、20000g/min 的条件下离心40min，取上清液以0.5mL/min的流速加入到Ni-NTA层析柱中， 用Buffer B以0.5mL/min的流速洗涤层析柱，收集洗脱液，即完成纯化。
全文摘要
牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原及其制备方法，它涉及一种牛轮状病毒重组蛋白抗原及其制备方法。它解决了目前对犊牛轮状病毒腹泻的诊断方法存在着费时、费力又不能快速诊断的弊端，以及过程繁琐、又需要昂贵的分子生物学试剂及相应的仪器设备的问题。牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原由重组载体质粒转化的大肠杆菌表达。制备方法一、VP6基因的PCR扩增；二、获得重组质粒；三、获得重组菌；四、重组VP6蛋白抗原的诱导表达；五、纯化。本发明为血清学方法诊断犊牛轮状病毒腹泻提供了诊断抗原，具有极强的特异性和准确性。使用本发明牛轮状病毒重组VP6蛋白抗原、采用荧光抗体试验和酶联免疫吸附等血清学试验具有诊断方法省时、省力、快速的优点，且不需要昂贵的试剂及设备。
文档编号C07K14/005GK101367870SQ20081013727
公开日2009年2月18日 申请日期2008年10月9日 优先权日2008年10月9日
发明者唐丽杰, 李一经, 葛俊伟, 马广鹏 申请人:东北农业大学