专利名称：一种新型γ-醇溶蛋白基因的核酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及到一种新型小麦Y-醇溶蛋白基 因的核酸序列，以及基于该序列通过染色体工程或转基因方法改良小麦品质的应 用。
背景技术：
与其它谷物相比，小麦在人类的食谱中扮演着重要的角色，人们利用小麦面 粉的特性已烹制出各种各样的食物。小麦面粉的营养和加工品质主要由种子储藏 蛋白决定，它们是人体摄取蛋白质的主要来源之一。种子储藏蛋白主要由谷蛋白 和醇溶蛋白组成，醇溶蛋白大约占储藏蛋白的40-50%。分子生物学研究表明根 据一级结构的差异可将醇溶蛋白分为a， Y和co三种类型。研究发现二倍体、四 倍体和六倍体小麦及近缘的山羊草物种中均有这三种蛋白。
Y-醇溶蛋白基因位于1号染色体的G//-7区域，它们在小麦基因组中紧密连 锁，并聚集成簇。Y-醇溶蛋白的一级结构(图l)包括一个19个残基的信号肽， N末端，长度变异很大的重复区，包含六个半胱氨酸残基的非重复区，谷氨酰胺 富集区和一个包含两个半胱氨酸残基的C末端区。
多肽的一级结构决定蛋白质的性质，储藏蛋白的结构对面团的流变力和食品 加工的许多方面起着重要作用。种子储藏蛋白的两大特征对面粉品质起决定作 用(1)形成分子内和分子间二硫键的半胱氨酸的数目和分布情况；(2)重复区 的特征。重复区中高密度的谷氨酰胺意味着有大量可形成氢键的-OH,这很大程 度上决定着蛋白质弹性。Y-醇溶蛋白包含八个保守的半胱氨酸残基，它们两两之 间形成分子内二硫键。另外大约l/4的Y-醇溶蛋白包含奇数个半胱氨酸。这些醇 溶蛋白在形成分子内二硫键后还有一个自由的-SH可参与形成分子间二硫键。当 只有一个半胱氨酸残基以供形成分子间二硫键时，储藏蛋白聚合物的链状延伸将 在该蛋白处终止，这种结构将降低面粉品质。当有至少两个半胱氨酸残基以供形成分子间二硫键时，聚合物的将顺利延伸，有利于形成高强度的面团。
醇溶蛋白与面粉品质的关系目前争议很大，不同学者通过品质测验分别得出 负相关、正相关甚至没有关系的结论。之所以如此，很大程度上是因为醇溶蛋白 组成非，复杂且不容易纯化，因此很有必要在分子水平上进一步深入研究醇溶蛋 白。
本发明呈现的醇溶蛋白基因与已报道的所有基因有明显不同，是优异基因 资源。本发明通过本发明人长期反复的对小麦醇溶蛋白编码基因的详细研究，首
次成功的获得了一种新型Y-醇溶蛋白基因。迄今为止，还没有相关的报道在国内 外出版物上发表过。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新型Y-醇溶蛋白的编码基因序列和氨基酸序列。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下
本发明以圆维7」、麦AS2255 (7Hricww fwrg/(iww subsp. ,wrg/(iw加)，总DNA为 模板，根据NCBI数据库(http:〃www,ncbi.nlm.nih.gov)中已知丫-醇溶蛋白编码 基因保守片段设计引物，利用PCR和分子克隆技术分离Y-醇溶蛋白基因，然后 将获得的基因序列与NCBI上的Y-醇溶蛋白基因序列进行多重比对并分析它们在 一级结构上的异同，结果表明我们克隆到一个新型y-醇溶蛋白基因，命名为
一种新型Y-醇溶蛋白的编码基因序列(G//-"g",其核酸序列如下
1 ATGAAGACCT TACTCATCCT AACAATCCTT GCGATGGCAG
41 TAACCATCGG CACCGCCAAT ATGCAGGTCG ACCCTAGCGG
81 CCAAGTACAA TGGCCACAAC AACAACCAGT CCCGCTCCCT
121 CAGCAACCAT TCTCCCAGAA ACCACAACAA ACATTTCCCC
161 AACCCCAACA AACATTCCCA TTCCCCCATC AACCACAACA
201 ACAATTTCCC CAGCCTCAAC AACCACAACA ACAATTTCTC
241 CAGCCCCAAC AACCACAACA ACCATATCCC CAGCAACCAC
281 AACAACCATT CCCCCAGACT CAACAACCCC AACAACTATT
321 TCCCCAGTCC CAGCAACCAC AACAACCATA TCCCCAGCAA
3 61 CCACAACAAC CATTGTCCCA GACTCAACAA CCCCAACAAC 401 CAGCTCAATT GGAGGCGATC AGGTCATTGG TGTTGCAAAC 441 TCTTCCAACC ATGTGTAACG TGTATGTCCC ACCTGAGTGC
4 81 TCTATCATCA AGGCACCATT TGCCAGCATA GTCACCGGAA521 TTGGTGGTCA ATGA
以上序列为小麦Y-醇溶蛋白的编码基因序列(G/z、g7)，运用点突变的方法 可对结构进行改造，得到小麦Y-醇溶蛋白的编码基因序列(G/!、g"的衍生序列， 该衍生序列包括新分离的具有与以上所述结构同样基本结构的基因序列及使用 体外DNA操作技术通过碱基的置换、插入、缺失获得的该基因序列的各种变构 体。
根据小麦Y-醇溶蛋白的编码基因序列(G//-和通用密码子信息，得到 其推导的氨基酸序列，该序列如下
1 MKTLLILTIL AMAVT工GTAN MQVDPSGQVQ WPQQQPVPLP
41 QQPFSQKPQQ TFPQPQQTFP FPHQPQQQFP QPQQPQQQF!L 81 QPQQPQQPYP QQPQQPFPQT QQPQQLFTQS QQPQQPYPQQ
121 PQQPLSQTQQ PQQPAQLEAI RSLVLQTLPT MCNVYVPPEC 161 S工IKAPFASI VTG工GGQ
本发明的有益效果为
通过构建G/f-"g7的原核或酵母表达载体，利用本领域共知的研究方法将
分别导入大肠杆菌和酵母中，然后纯化该基因编码的蛋白并将其添加到 面粉中改变面团的品质指标。这一结果表明，该新型Y-醇溶蛋白基因的表达产物 能以分子间二硫键相互连接形成高分子量的聚合物，这是优质储藏蛋白基因非常 重要的一个特征。而拥有该特征的基因通过转基因技术或者染色体工程的方法导 入小麦，能够培育出品质更好的小麦品种，这已是行业广泛公知的技术。
本发明的测序结果表明G/f-是不同于已经公布的所有Y-醇溶蛋白基因
的新的基因类型。与其它已知Y-醇溶蛋白基因相比，它缺少非重复区和谷氨酰胺
富集区及6个半胱氨酸残基(图2和图3)。体外表达分析表明G//-的两个半 胱氨酸均可参与形成分子间二硫键(图4)。这该序列特征显示该基因的独特之 处和导致优质的因素。
图l:普通Y-醇溶蛋白模式结构。信号肽、N末端、重复区、非重复区、谷
胺酰胺富集区和C-末端分别表示各个结构域；S指代半胱氨酸，中间的连线表示
二硫键。
图2:新型Y-醇溶蛋白模式结构。信号肽、N末端、重复区和C-末端分别表示各个结构域，s指代半胱氨酸。
图3: G/f- g7与普通Y-醇溶蛋白氨基酸序列多重比对。星号指示半胱氨酸位置。
图4: G/f-^7体外表达结果。从做到右依次是蛋白分子量标准、G/"ng/ (溶 液A,含有还原剂DTT)和G/i-wgJ (溶液B,没有还原剂)。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡 依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例l:
1、 提取基因组DNA
采用CTAB法提取圆锥小麦AS2255的基因组DNA，提取步骤如下
(1) 取2克新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65X:的2xCTAB提取液(2。/。 CTAB、 1.4MNaCl、 0.1 MTris-HCl PH8.0、 0.1M EDTAPH8.0,临用前加2% p-巯基乙醇)15ml混匀；
(2) 65'C水浴30-45分钟,其间轻摇混匀。冷却至室温后加等体积的氯仿异戊醇 (24: 1),轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10分钟。
(3) 取上清液，加等体积异丙醇，冰浴2小时沉淀DNA;
(4) 勾出DNA，用70%酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH8.0 的l XTE溶液中。加入RNA酶至终浓度IOO pgAxl;
(5) IOOV恒定电压下，1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测DNA浓度及质量。
2、 根据已知相关序列的保守区域设计了以下引物
F: 5'墨CTTC AC AC A ACTAGAGC AC AAG -3' R: 5，陽GATGAATCAGCTAAGCAACGATG-3'
3、 PCR扩增
反应体系如下DNA 100-150ng
dNTPs 100|_iM
引物Pi 5pmol
引物P2 5pmol ragp/i"聚合酶 1U10xPCR缓冲液
1.5mM
ddH20
加至终体积25^L
PCR反应程序(1) 94 °C
4分钟
(2) 94°C
45秒
(3) 57 °C
1分钟
(4) 72°C
70秒
重复(2) — (4) 35次
(5) 72°C
10分钟
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research, U.S.A.)中进行。扩增产物 在1%琼脂糖凝胶上分离，130V恒定电压电泳30分钟。
4、 PCR产物回收和纯化
使用r/朋取"的胶回收试剂盒，所有操作均按照说明书进行。
5、 连接和转化
使用7Mam的连接试剂盒将回收产物连接到PMD-18T载体，反应体系如下 PMD-18T载体 0.5 pi (约25ng)
Solution I 4.75[jJ 回收PCR产物 加至终反应体积10nl
16T:连接io小时
转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞的制备
(1 )取在无抗生素平板上生长良好的DH5a单菌落，接种于2 pl LB液体培养基中；
(2) 取50(^l活化过夜的菌液于50ml LB液体培养基中，37'C振荡培养至 OD600=0.3;
(3) 将菌液倒入50ml离心管中，冰浴放置IO分钟；
(4) 在预冷至4。C的离心机中，4000ipm离心10分钟后去掉上清液，收集菌体;
(5) 加入20ml冰冷的0.1MCaCl2于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴中30分钟；
(6) 4t:下，4000 rpm离心10分钟后去掉上清液，收集菌体，加入2 ml冰冷的 0.1MCaCl2溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用。转化步骤如下
(1) 将连接产物加入200pl感受态细胞中，充分混匀置于冰上30分钟；
(2) 42i:热击90秒，冰浴150秒后加入预热至37'C的LB液体培养基1000 pl;
(3) 37。C振荡(200rpm)培养45分钟；
(4) 3000rpm离心10分钟收集菌体；
(4) 将菌体均匀涂于含有氨苄青霉素(33 ^g/ml)的LB固体培养基平板上；
(5) 37t;培养箱中培养16小时。 6、阳性克隆的筛选
(1) 挑取培养平板上生长良好的白色单菌落，在含有氨苄青霉素(33pg/rnl)的 LB固体培养基平板上划线，扩大培养(37'C培养12小时)；
(2) 挑取扩大培养后的菌进行PCR扩增，反应体系如下-
DNA
dNTPs 引物Pi
引物P2
r叫咖聚合酶
10xPCR缓冲液
Mg2+
ddH20
少许菌体 lOO^M 5 pmol 5 pmol 1U
1.5mM
加至终体积25pl;
(3) PCR反应程序同前。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上分离，IOOV恒定电压电 泳30分钟，检测有无目的片段。
7、 序列测定与比较分析
随机选取阳性克隆进行测序，序列测定由上海英俊公司完成，测序结果比较分析 釆用NCBI网址中的blast (http:〃www. ncbi.nlm.nib.gov/BLAST/)程序、MEGA 3.1和DNAman 5.2.2软件进行。
8、 G/f-唯7的体外表达
(1)依据所测定的基因序列，设计可扩增整个基因编码区除信号肽区域的PCR 引物，并在与基因N末端保守区结合部位的5'端添加限制性内切酶Mfel位点， 另一引物的5'端添加位点，引物序列如下P3 (Ndel-fo醒rd): ACACATATGAATATGCAGGTCGACCCTAGCG P4 (HindIII墨認rse): TTCAAGCTTGATGAATCAGCTAAGCAACGATG;
(2) 使用PCR方法从质粒中扩增出目的基因片段，回收扩增产物，方法同前;
(3) 对PCR产物和pET-30a质粒载体进行MM和扭ncffll的37。C过夜酶切；
(4) 对酶解后的PCR产物和pET-30a载体进行回收，16° C过夜连接反应 连接体系如下
pET-30a载体 4.35 pl
PCR回收产物 4.35pl
T4连接buffer lm
T4连接酶 350U;
(5) 连接产物转化入DH5oc感受态细胞，在25pg/ml的卡那霉素平板上筛选， 挑选出阳性克隆(使用引物P3和P4，步骤同前面扩菌)，提取质粒(7 "/7^"提 取质粒试剂盒，操作步骤见说明书)，转化入大肠杆菌BL21，在含25|ig/nil的卡 那霉素的平板上涂板；
(6) 取在平板上筛选到的单个菌落在2ml含25吗/ml的卡那霉素的LB液体培 养基中过夜培养；
(7) 第2天将500^x1过夜的菌液加到50ml含25pg/ml的卡那霉素的LB液体培 养基中培养至OD600=0.6-1.0时加入IPTG至O.lmM诱导12小时；
(8) 8000r/min离心IO分钟收集菌体;
(9) 加600^1水混匀菌体，冻融6次，然后加1400W无水乙醇6(TC水浴2小时；
(10) 8000r/min离心IO分钟收集菌体；
(11) 取上清，加2倍体积1.5M NaCl冰浴4小时；
(12) 21000g离心IO分钟，去上清，加500W 70%乙醇使沉淀溶解，再加2倍 体积1.5M NaCi冰浴4小时；
(13) 加lOOOpl水冰浴半小时；
(14) 8000r/mifi离心IO分钟，去上清，加入溶液A或B溶解表达的蛋白；
(15) SDS-PAGE电泳分析
溶液A组成62.5mM Tris-HC1 (pH6.8)， 10% (v/v) glycerol, 2% (w/v) SDS, 0.002% (w/v) bromophenol blue, 1.5% (w/v) DTT;溶液B组成62.5mM Tris-HC1 (pH6.8), 10% (v/v) glycerol, 2% (w/v) SDS, 0.002% (w/v) broraophenol blue 9、 SDS-PAGE分析
分离胶(Resolving gel)缓冲液(2.5L):溶解378g Tris， 25g SDS， 95g硼酸, 加水定容至2.5L，pH值应为8.9。
浓縮胶(Stacking gel)缓冲液1.0 M Tris-HCL, pH6.8,10%(W/V)SDS。
电泳缓冲液将分离胶缓冲液稀释10倍
聚丙烯酰胺凝胶组成
浓縮胶(3%) 分离胶(10%)
40%丙烯酰胺，ml0.3752.5
2%甲叉双丙烯酰胺，ml0.20.52
Resolving gel缓冲液，ml01
Stacking gel缓冲液，ml0.620
10%SDS (WAO， ml0.040
10% (W/V)过硫酸胺，ml0.050.09
TEMED， pi4.2
H20， ml3.75.9
以r"tom蛋白分子量标准作对照，恒压150V电泳，待指示剂走出分离胶后，取 下胶染色15分钟，用水脱震荡脱色至条带清晰后，保存于固定液中，照相保存 SDS-PAGE结果。
染色液组成(1L): 650ml蒸馏水、lg考马斯亮蓝R-250、 250ml异丙醇、 100ml冰醋酸；
脱色液组成(1L): 650 ml蒸馏水、250 ml异丙醇、100 ml冰醋酸； 固定液组成O L): 100 ml冰醋酸、900 ml蒸馏水。序列表.ST25
SEQUENCE LISTING
<110〉四川农业大学
<120> —种新型y-醇溶蛋白基因的核酸序列及其应用 <130> 081129 〈160> 2
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 535
<212〉 腿
<213〉 小麦属(Triticum L.)
<400> 1
aatgaaga^ccttactcatcctaacaatccttgcgatggcagtaaccatcggC3CCgCC3360
tatgcaggtcg己ccctagcggccaagtacaatggccacaacaacaaccagtcccgctccc120
tcagcaaccattctcccagaaaccscaacaaacatttccccaaccccaa^caaacattccc180
attcccccataacaatttccccagcctcaaaacaatttct240
ccsgcccca3c犯ccac犯caaccatatcccceigc犯ccacgiac犯cca^tcccccagac300
ttCCCCdgtCccagcaaccEL360
ccattgtcccagactcaacaccagctcaattggaggcgat420
caggtxattggtgttgcaaactcttccaacg"tgtatg"tcccacctgagtg480
ctctatcatcaaggcaccatttgccagcatagtcaccggaattggtggtcaatga535
<210〉 2
〈211> 177
〈212〉 PRT
<213〉 小麦属(Triticum L.)
<400〉 2
Met Lys Thr 1
Leu
Leu 5
lie Leu Thr lie
Leu Ala Met Ala Val Thr lie 10 15
Gly Thr Ala Asn Met Gin Val Asp Pro Ser Gly Gin Val Gin Trp Pro
20
25
30
Gin Gin Gin Pro Val Pro Leu Pro Gin Gin Pro Phe Ser Gin Lys Pro 35 40 45
Gin Gin Thr Phe Pro Gin Pro Gin Gin Thr Phe Pro Phe Pro His Gin 50 55 60
Pro Gin Gin Gin Phe Pro Gin Pro Gin Gin Pro Gin Gin Gin Phe Leu 65 70 75 80
Gin Pro Gin Gin Pro Gin Gin Pro Tyr Pro Gin Gin Pro Gin Gin Pro 85 90 95
Phe Pro Gin Thr Gin Gin Pro Gin Gin Leu Phe Pro Gin Ser Gin Gin
100
105
110
Pro Gin Gin Pro Tyr Pro Gin Gin Pro Gin Gin Pro Leu Ser Gin Thr 115 120 125
11Gin Gin Pro Gin Gin Pro Ala Gin Leu Glu Ala lie Arg Ser Leu Val 130 135 140
Leu Gin Thr Leu Pro Thr Met Cys Asn Val Tyr Val Pro Pro Glu Cys 145 150 155 160
Ser lie lie Lys Ala Pro Phe Ala Ser lie Val Thr Gly lie Gly Gly 165 170 175
Gin
权利要求
1、一种新型γ-醇溶蛋白基因的核酸序列，其特征在于，所述基因序列为序列表中SEQ ID No.1所示的核酸序列。
2、 一种新型Y-醇溶蛋白基因的的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序 列为序列表中SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。
3、 一种新型Y-醇溶蛋白基因的核酸序列的衍生序列，其特征在于，该衍生 序列为权利要求1所述的基因序列的一个或几个碱基的置换、插入或缺失获得的 该基因序列的变构体。
4、 一种新型Y-醇溶蛋白基因的氨基酸序列的衍生序列，其特征在于，该衍生 序列与权利要求3所述的一种新型Y-醇溶蛋白基因的核酸序列的衍生序列相对 应，为在相应蛋白质的氨基酸序列基础上经过一个或几个氨基酸的一个或几个碱 基的置换、插入或缺失获得的该基因序列的变构体。
全文摘要
本发明公开了一种新型γ-醇溶蛋白基因的核酸序列和氨基酸序列，如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，属于生物基因工程技术领域。该新型基因序列可以通过转基因技术或染色体工程方法导入普通小麦，培育出品质更好的小麦品种。同时可以通过构建原核或酵母表达载体，导入大肠杆菌和酵母中进行表达，纯化该基因编码的蛋白并将其添加到面粉中，具有很高的应用价值。
文档编号C07K14/415GK101544982SQ200810147798
公开日2009年9月30日 申请日期2008年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者祁鹏飞, 郑有良, 陈国跃, 颜泽洪, 魏育明 申请人:四川农业大学