专利名称：一种香菇基因组的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种香菇基因组的快速提取方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
香菇是一类具有重要经济价值的食用真菌。我国作为世界香菇生产和贸易第一大国和人 工栽培香薛的发源地，近年来对香话的种群遗传学、系统进化、菌种鉴定等研究越来越多的 应用了分子生物学的方法。由于香菇等食用菌品种繁多，如要开展基于基因组学相关的克隆 未知基因、构建基因组文库、分子标记辅助育种等研究，需要处理的实验样品数量很大，对 提取香菇基因组DNA的方法是否简便快捷、效率高和成本低等都提出了更高的要求。
目前常用的方法如氯化铯离心法、CTAB法、试剂盒法等应用于细菌、动物和植物等的 基因组提取都已比较成熟，但还未有针对香菇等高等食用真菌基因组的商业化提取试剂盒， 相应的提取方法报道也较少1992年吕作舟提出一种食用菌DNA的提取方法，但该法需要 制备原生质体，比较复杂、耗时，而且DNA的提取率较低，蛋白含量高；1994年朱衡等人 用氯化苄法来提取食用菌DNA，该方法提取出的DNA含量高，蛋白含量低，但是多糖的含 量较多，提取出来的DNA需要进一步纯化；1999年王春晖等人用CTAB法提取食用菌的 DNA，并对其加以改进，取得了较好的结果；2000年江玉姬等人利用CTAB法更细致的对 草菇进行了试验；2005年尚晓冬等人利用LETS改进法提取了香范的基因组。但是总体来说， 目前己报道的提取香菇等高等食用真菌基因组的方法都很繁琐，无论是利用酶处理法、冻融 法还是液氮研磨法，提取前都需要数小时甚至一天的长时间准备和处理样品，费时费力，成 本较高，而且液氮研磨过程很容易引起样本间的交叉污染。特别是对于品种多、样本数量大 的香菇基因组的快速提取及检测、分子鉴定以及要求不高的PCR等基因操作，很不经济实 用。因此，需要我们寻找一种操作更为简便快捷、抽提质量高、重复性好、成本低、安全易 行的香菇基因组DNA的快速提取方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种简便快捷、效果稳定的香菇基因组DNA的快速 提取方法。
一种香菇基因组的提取方法，依次经过菌体培养、菌体洗涤、菌体破壁、基因组抽提、 去除RNA、去除蛋白、基因组DNA的沉淀、洗涤和溶解的步骤，其特征在于，菌体破壁步 骤具体操作如下
将经过菌体洗涤处理后的菌丝体重悬于1 2倍体积的缓冲液中，再加入等体积的有机 溶齐U，然后加入占溶液总体积1/3 2/3的酸洗玻璃珠，漩涡剧烈振荡5 8min,每隔1 2min 上下震荡5s，使内容物充分混匀，再加入溶液总体积1/2的有机溶剂，漩涡剧烈振荡10s， 60 7(TC放置5 7min，得菌丝体悬液；
所述的有机溶剂为苯酚与氯仿按体积比1:1混合的溶液；该有机溶剂可有效提高基因组 DNA的提取率，并且经过实验证明该有机溶剂可有效促进细胞壁特别是香菇等高等真菌细 胞壁的破碎裂解；所述的酸洗玻璃珠为直径425 600pm; 所述的剧烈震荡为转速每分钟2500rpm以上。
优选的，所述的缓冲液为200mmol/L的Tris-HCl, 500隱ol/L的NaCl, 25隱ol/L的 EDTA (乙二胺四乙酸)，2。/。的SDS (十二垸基硫酸钠)，pH8.5。 优选的，所述的菌体培养步骤，具体操作如下
挑取适量的香菇菌丝接种于装有PDA液体培养基的摇瓶中或培养基表面贴有玻璃纸的 PDA平板上，25t:培养7 15d，收集菌丝体；
PDA为土豆培养基，配制方法为土豆去皮薄片200g，加水1000mL，煮沸30min,双 层纱布过滤后，外加1 2V。葡萄糖，0.15%的硫酸镁，0.3%的磷酸二氢钾，0.4%的麸皮，补 足水分定容至1000mL， 12rC灭菌30min。
优选的，所述的菌体洗涤步骤，具体操作如下
将菌体培养中收集的菌丝体用蒸馏水、0.05mol/L的EDTA (乙二胺四乙酸)溶液各洗 涤、抽滤一次，收集菌丝体；
抽滤可以采用4层纱布或G2漏斗抽滤的方式或其他常规方式，通过上述步骤，可有效 除去菌丝中的色素等杂质。
优选的，所述的基因组抽提步骤，具体操作如下
将菌体破壁获得的菌丝体悬液中加入0.15 0.3倍体积的7.5mol/L乙酸铵溶液，冰浴l 2min， 4°C， 14000rpm离心lmin，收集上清液；加入0.1 0.15倍体积的3mol/L、 pH值为 4.8的醋酸钠和0.4 0.6倍体积的异丙醇，混匀，冰浴5 8min; 4'C， 14000rpm离心lmin， 弃上清液；
加入乙酸铵溶液是防止在SDS (十二烷基硫酸钠)作用下解聚的核基因组DNA与组蛋 白发生重聚。
优选的，所述的基因组DNA的沉淀步骤可通过加入0.1 0.15倍体积3mol/L、 pH4.8 的醋酸钠和等体积的预冷无水乙醇，在4'C或-2(TC放置10 15min，可见白色絮状的DNA沉 淀，然后4'C， 14000rpm离心1 2min，收集沉淀即可。
上述操作步骤及实验试剂，如无特别说明，均可采用本领域常规操作及市售产品。
本发明的优点
1. 本方法利用酸洗玻璃珠漩涡震荡、苯酚:氯仿抽提相结合的菌丝破壁和提取香薛基因 组DNA的方法，相比己报道的香菇等高等食用真菌及其它各类样品的基因组DNA提取方 法，如传统的利用液氮研磨、酶解破壁、机械+冻融法等，步骤更为简捷快速，省时省力，1 小时内就可以获得高质量的香菇基因组DNA，而且可避免样品之间的交叉污染，特别适于 同歩快速提取品种多、样品数量大的香菇基因组DNA;使用更适合破碎细胞的酸洗玻璃珠 相比以往的石英砂，可减少其对基因组DNA的机械剪切破坏作用和吸附损失，并结合优化 后的抽提和纯化步骤，最终平均每克香菇菌丝可提取lmg以上的基因组DNA，接近一般商 业化试剂盒的提取水平，高于以往文献报道的提取方法(见表一)。
2. 实验证明该法成本低，安全可靠，不需复杂的实验设备，常规的微生物学实验室条 件及商品化试剂就可完成；抽提效率高，对不同品种、固体培养和液体培养后的香菇菌丝体 均适用(见附图一)，提取出的基因组DNA质量好，经分光光度计检测A26o/A，约为1.7 1.9之间(见实施例一、二)，可直接用于酶切、PCR、分子标记等多种分子生物学实验；3. 提取的香菇基因组DNA经限制性内切酶EcoRI酶切前后的图谱(见附图一、图二) 所示提取不同品种的香菇基因组DNA分子量均在40kb以上，条带清楚，且重复性好；经 限制性内切酶EcoRI酶切后条带弥散、分布均匀。前后结果表明提取的基因组DNA较为完 整，可用于限制性内切酶(如Sau 3AI)的部分酶切反应以及与载体DNA (KS质粒等)的 连接反应，构建基因组文库等；
4. 该振荡快速提取基因组DNA的方法应用范围广泛，不仅适用于香菇，也可适用于其 它高等真菌和丝状真菌，提取的基因组DNA纯度高，保存时间长，在-2(TC或-7(TC的条件 下至少可保存半年以上。
图1是采用本方法提取出的香菇基因组DNA的琼脂糖电泳图2是采用本方法提取出的香菇基因组DNA被限制性内切酶EcoRI酶切后的基因组琼 脂电泳图。
其中L1、 L2分别为采用固体培养和液体培养的古香66号香菇品种的DNA条带；L3、 L4分别为固体培养和液体培养的泌阳3号香菇品种的DNA条带；L5、 L6分别为固体培养 和液体培养的申香10号香菇品种的DNA条带。M为分子量Marker Dl5000+2000。
具体实施例方式
以下结合附图和具体实施实例对本发明做进一步的说明，但不作为对本发明实施范围的 限定。
实施例l:
挑取3个不同品种(古香66、泌阳3号、申香10号)的香菇菌丝分别接种于培养基表 面贴有玻璃纸的PDA平板上，25'C条件下培养10d，待菌丝长满平板后，分别收集菌丝体， 提取的基因组DNA及EcoRI酶切结果见附图一、二 (Ll为古香66; L3为泌阳3号；L5为 申香10号)，提取的DNA产量约为l.lmg/每g菌丝左右，分光光度检测A26o/A28o约为1.7 左右。上述三个香菇品种均采用如下步骤如下
1. 菌体培养挑取适量的香菇菌丝接种于培养基表面贴有玻璃纸的PDA平板上，25'C培养 12d，收集菌丝体；PDA为土豆培养基，配制方法为土豆去皮薄片200g，加水1000mL，煮 沸30miji，双层纱布过滤后，夕卜加l。/。葡萄糖，0.15%的硫酸镁，0.3%的磷酸二氢钾，0.4%的 麸皮，固体平板培养基再加1.5%的琼脂，补足水分定容至1000mL， 115'C灭菌30min;
2. 菌体洗涤将收集的菌丝体用蒸馏水、0.05mol/L的EDTA溶液各洗漆、抽滤(用4层纱布 抽滤) 一次，以除去菌丝中的色素等杂质，收集于1.5mL离心管中(约100mg);
3. 菌体破壁:加入250nL抽提缓冲液(200mmol/L的Tris-HCl, 500mmol/L的NaCl， 25mmol/L 的EDTA， 2。/。的SDS， pH8.5),再加入0.4g的玻璃珠(sigma公司生产，直径为500pm)、 250jxL 的有机溶剂(苯酚与氯仿体积比l:l混合)，盖紧盖，漩涡剧烈振荡3000rpm， 6min，再加入 300pL的有机溶剂(苯酚与氯仿体积比l:l混合)，漩涡振荡10s， 65'C放置5min;
4. 基因组的抽提加入15(^L的7.5mol/L乙酸铵溶液，冰浴lmin， 4'C， 14000rpm离心lmin, 收集上清液；将上清转至另一无菌的1.5mL离心管中，加入100nL的3mol/L、 pH值为4.8的醋 酸钠和500nL异丙醇，颠倒混匀，冰浴7min， 4°C， 14000rpm离心lmin，弃上清液；
5. 去除RNA:力口200nL的pH8.0的TE缓冲液溶解沉淀，再加入终浓度为0.1ng/nL的RNAase, 在65'C放置2min;6. 去除蛋白加入200pL的混合液(氯仿与异戊醇体积比24:1混合)，14000rpm离心lmin， 抽提一次；
7. 基因组DNA的沉淀上清转移至另一1.5mL毫升离心管中，加5(VL的3mol/L、 pH4.8的醋 酸钠和40(VL无水乙醇，在-2(TC放置10min， 4°C， 14000rpm离心lmin，收集沉淀；
8. 洗涤力口60(VL、 70%的乙醇，洗涤两次(每次4。C， 14000rpm离心lmin);
9. 溶解待乙醇挥发完全，用IO(VL的TE缓冲液溶解DNA沉淀，-2(TC保存备用。
通过以上方法制得香菇基因组DNA共耗时0J5小时左右。电泳结果如图1中Ll、 L3、 L5的条带所示。
实施例2:
挑取3种不同品种(古香66、泌阳3号、申香10号)的香菇菌丝分别接种于装有10mL的 PDA液体培养基的三角瓶中，摇床转速200rpm， 25°C条件下培养10d，待菌丝球生长均匀较 多时，分别抽滤收集菌丝，提取其基因组DNA及EcoRI酶切结果见附图一、二(L2为古香66; L4为泌阳3号；L6为申香10号)。每克菌丝提取DNA的产量比固体培养略高，约为1.4mg左右，
分光光度检测A26o/A280约为1.8左右。上述三个香菇品种均采用如下步骤如下
1. 菌体培养挑取适量的香菇菌丝接种于装有PDA液体培养基的摇瓶中，25t:培养10d，收 集菌丝体；PDA液体培养基配制方法为土豆去皮薄片200g，加水1000mL，煮沸30min，双 层纱布过滤后，外加2%葡萄糖，0.15%的硫酸镁，0.3%的磷酸二氢钾，0.4%的麸皮，补足水 分定容至1000mL， 115。C灭菌30min;
2. 菌体洗涤将收集的菌丝体用蒸馏水、0.05mol/L的EDTA溶液各洗涤、抽滤(用G2漏斗 抽滤) 一次，收集于1.5mL毫升离心管中(约100mg);
3. 菌体破壁加入250fiL抽提缓冲液(200mmol/L的Tris-HCI， 500mmol/L的NaCl， 25mmol/L 白勺EDTA， 2。/。的SDS， pH8.5)，再加入0.4g的玻璃珠(sigma公司生产，直径为50(Hxm)、 250pL 的有机溶剂(苯酚与氯仿体积比l:l混合)，盖紧盖，漩涡剧烈振荡2700rpm， 8min，再加入 30(HiL的有机溶剂(苯酚与氯仿体积比l:l混合)漩涡振荡10s， 60。C放置7min;
4. 基因组的抽提加入150[AL的7.5mol/L乙酸铵溶液，冰浴lmin， 4°C, 14000rpm离心lmin， 收集上清液；将上清转至另一无菌的1.5mL离心管中，加入15(^L的3mol/L、 pH值为4.8的醋 酸钠和60(VL异丙醇，颠倒混匀，冰浴5min， 4°C， 14000rpm离心lmin，弃上清液；
5. 去除RNA:力口2(KHiL的pH8.0的TE缓冲液溶解沉淀，再加入终浓度为0.1吗&L的RNAase， 在65'C放置2min;
6. 去除蛋白加入20(VL的混合液(氯仿与异戊醇体积比24:1混合)，14000rpm离心lmin， 抽提一次；
7. 基因组DNA的沉淀上清转移至另一1.5mL毫升离心管中，加6(^L的3mol/L、 pH4.8的醋 酸钠和400pL无水乙醇，在4。C放置15min， 4'C， 14000rpm离心lmin，收集沉淀；
8. 洗涤力B60(VL、 70%的乙醇，洗涤两次(每次4。C， 14000卬m离心lmin);
9. 溶解待乙醇挥发完全，用100pL的去离子水溶解DNA沉淀，-7(TC保存备用。
通过以上方法制得香菇基因组DNA共耗时0.9小时左右。电泳结果如图1中L2、 L4、 L6的条带所示。
为了进一步说明本方法相对于其它方法在提取DNA时，耗时少、提取量高的优点，发 明人通过对现有试验方法逐一验证，获得相关数据，并与本发明实施例中的数据进行对照，列表一如下
表一 几种基因组DNA提取方法的比较
提取方法
冻融法(如专利 200810010349.8)
酶解法(如专利研磨法(如专利 02111328.9) 200510072233.3)
本方法
提取过程耗时 (小时/每个样品)
DNA提取率 (mg/每g菌丝)
7 12
0.5 0.7
9 12
3 数小时以上
o.o8 o.:
0.7一
1.1 1.4
由上述对比可知，本发明针对不同品种的香菇样品的基因组DNA不仅提取时间短，而 且提取量高，可有效解决现有技术中提取量少、不稳定且耗时长的缺点。
权利要求
1、一种香菇基因组的提取方法，依次经过菌体培养、菌体洗涤、菌体破壁、基因组抽提、去除RNA、去除蛋白、基因组DNA的沉淀、洗涤和溶解的步骤，其特征在于，菌体破壁步骤具体操作如下将经过菌体洗涤处理后的菌丝体重悬于1～2倍体积的缓冲液中，再加入等体积的有机溶剂，然后加入占溶液总体积1/3～2/3的酸洗玻璃珠，漩涡剧烈振荡5～8min，每隔1～2min上下震荡5s，使内容物充分混匀，再加入溶液总体积1/2的有机溶剂，漩涡剧烈振荡10s，60～70℃放置5～7min，得菌丝体悬液；所述的有机溶剂为苯酚与氯仿按体积比1:1混合；所述的酸洗玻璃珠为直径425～600μm；所述的剧烈震荡为转速每分钟2500rpm以上。
2、 如权利要求1所述的香菇基因组的提取方法，其特征在于，所述的缓冲液为200mmol/L 的Tns-HCl, 500mmol/L的NaCl， 25mmol/L的EDTA (乙二胺四乙酸)，2%的SDS (十二 烷基硫酸钠)，pH8.5。
3、 如权利要求1所述的香菊基因组的提取方法，其特征在于，所述的菌体培养步骤， 具体操作如下挑取适量的香菇菌丝接种于装有PDA液体培养基的摇瓶中或培养基表面贴有玻璃纸的 PDA平板上，25。C培养7 15d，收集菌丝体。
4、 如权利要求1所述的香菇基因组的提取方法，其特征在于，所述的菌体洗涤步骤， 具体操作如下将菌体培养中收集的菌丝体用蒸馏水、0.05mol/L的EDTA (乙二胺四乙酸)溶液各洗 涤、抽滤一次，收集菌丝体。
5、 如权利要求1所述的香菇基因组的提取方法，其特征在于，所述的基因组抽提歩骤， 具体操作如下将菌体破壁获得的菌丝体悬液中加入0.15 0.3倍体积的7.5mol/L乙酸铵溶液，冰浴l 2min， 4°C， 14000rpm离心lmin，收集上清液；加入0.1 0.15倍体积的3mol/L、 pH值为 4.8的醋酸钠和0.4 0.6倍体积的异丙醇，混匀，冰浴5 8min; 4'C， M000rpm离心lmin，弃上清液。
6、 如权利要求1所述的香薛基因组的提取方法，其特征在于，所述的基因组DNA的沉 淀歩骤通过加入0.1 0.15倍体积3mol/L、 pH4.8的醋酸钠和1 2倍体积的预冷无水乙醇， 在4'C或-20'C放置10 15min，当产生白色絮状的DNA沉淀时，在4'C条件下，14000rpm 离心l 2min，收集沉淀即可。
全文摘要
本发明涉及一种香菇基因组的快速提取方法，属于分子生物学技术领域。一种香菇基因组的提取方法，依次经过菌体培养、菌体洗涤、菌体破壁、基因组抽提、去除RNA、去除蛋白、基因组DNA的沉淀、洗涤和溶解的步骤，其特征在于，采用酸洗玻璃珠震荡破壁等特殊步骤，达到简便快捷、效果稳定的快速提取香菇基因组DNA的目的。
文档编号C07H21/00GK101434630SQ200810160348
公开日2009年5月20日 申请日期2008年11月17日 优先权日2008年11月17日
发明者任海霞, 任鹏飞, 强 姚, 宫志远, 玲 曲, 瑾 李 申请人:山东省农业科学院土壤肥料研究所