专利名称：：一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题，据统计全球盐碱土约有10亿公顷，占世界陆地面积近7.6%。我国是一个发展中的农业大国，全国盐碱土约有0.2亿多公顷占全国耕地面积的1/3。盐分胁迫能显著的抑制植物的生长，甚至导致植物的死亡。在长期的进化过程中，不同植物形成了不同的机制来适应盐分的胁迫，同时其抗盐能力也各不相同。大多数农作物都对盐分非常敏感，而盐生植物虽然能在高盐条件下生存，但它们的经济价值往往非常有限，提高作物的抗盐能力已经成为我国农业生产和科研中的重要内容。植物对盐分的抗性是一个多基因控制的复杂性状。盐分对植物的影响涉及到植物体内的各个方面和代谢过程。包括离子毒害，渗透胁迫和氧化胁迫以及光合作用。因此，对抗盐、耐盐相关基因及其蛋白的研究具有重要的意义。Apse等(ApseMP，AharonGS，SneddenWA，"a/.，SalttoleranceconferredbyoverexpressionofavacuolarNa+/H+antiporterinArabidopsis.Science，1999，285:1256-1258)对转AWKO基因的拟南芥植株进行了分析，过量表达Na+ZH+逆向转运蛋白的转基因拟南芥植株在200mmol/LNaCl中能正常生长发育。免疫印迹表明，从转化植株叶片提纯液泡比从野生型提纯具有更多的v4M^/X7的产物，液泡上Na+ZH+逆向转运蛋白活力增强。Fukuda等(FukudaA,NakamuraA"TaginA.,etal.Function,intracellularlocalizationandtheimportanceinsalttoleranceofavacuolarNa+/H+antiporterfromrice.Plant&CellPhysiology,2004,45:146)将液泡膜逆向转运蛋白基因CWW^7转入到水稻中过量表达也可以提高转基因植株的耐盐性。将拟南芥的基因转入番茄中，过量表达液泡Na+ZH+逆向转运蛋白的转基因番茄在200mmol/LNaCl胁迫下能够正常生长、开花和结实，尽管叶片中Na+浓度高，但番茄果实中Na+浓度很低(ZhangHX,BlumwardE,Transgenicsalt-toleranttomatoplantsaccumulatesaltinfoliagebutnotinfruit.NatureBiotechnology,2001,19:765~768)。Shi等(ShiH,Byeong-haL,"OverexpressionofaplasmamembraneNa+/H+antiportergeneimprovesalttoleranceinArabidopsisthaliana.NatureBiotechnology,2002,1-5)将拟南芥质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因SOW转入到拟南芥中，转基因植株可以在150mMNaCl胁迫下开花结实，并且提高了转基因植株在盐胁迫下的SOS1的转录水平。
发明内容本发明的目的是提供一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的植物耐盐蛋白，名称为GmNHX2，来源于大豆属大豆(G/yc/wmax(Linn.)Merr)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQIDJV2.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQIDW.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐盐功能的蛋白质。其中，序列表中的序列2由534个氨基酸残基组成。GmNHX2为一类>^+氾+逆向转运蛋白基因，主要功能是在胁迫下调整植物体内的离子平衡。疏水性分析结果表明，在GmNHX2的N-端是高度疏水性的并预测到IO跨膜结构域，具有序列表中序列2的氨基端的第25—432位氨基酸残基序列；在GmNHX2的C-端有一小段高度亲水性的尾巴，具有序列表中序列2的氨基端的第433—534位氨基酸残基序列，预测其位于细胞质内。GmNHX2与番茄的Na+ZH+逆向转运蛋白具有高度的氨基酸序列相似性，序列一致性为80%，序列相似性为880/。。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。为了使(a)中的GmNHX2便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。表l.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的GmNHX2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的GmNHX2的编码基因可通过将序列表中SEQIDJY2:l的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。为了便于蛋白的分泌表达，还可在所述GmNHX2的氨基末端添加上信号肽序列。上述植物耐盐蛋白的编码基因(GmAWX2)也属于本发明的保护范围。上述植物耐盐蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中SEQIDW:l的5，端的第117至1718位核苷酸；2)序列表中SEQIDW:1的核苷酸序列；3)编码序列表中SEQIDJVf2:2蛋白质序列的多核苷酸；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQIDWs:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件可为在O.lxSSPE(或O.lxSSC)，0.1。/。SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜。其中，序列表中的SEQIDW:1由2152个脱氧核苷酸组成，自序列1的5'端的第117至1718位核苷酸为GmAWZ2的编码序列,序列表中序列1编码序列表中序列2的氨基酸残基序列。含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。实验表明，该蛋白具有很高的耐盐性，将该蛋白的编码基因转入植物中，可提高植物的耐盐性。本发明蛋白和其编码基因通过调节植物体内的Na+离子平衡以提高植物的耐盐性，具有很高的应用价值。图1为过表达GmNHX2基因的拟南芥转基因植株(转pBI121-GmNHX2拟南芥)的耐盐性鉴定(处理的NaCl浓度为200mM)。具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例l、植物耐盐蛋白及其编码基因的获得分析大豆品种绥农14的叶片为材料构建的cDNA文库中获得的ESTs，发现一个EST与Na+ZH+逆向转运蛋白类基因有很高的同源性。用RT-PCR和3'RACE从盐处理6h的文丰7号(统一编号ZDD02611;中国国家种质资源库)中获得该基因的全长cDNA序列，具体方法为用200mMNaCl溶液浸泡萌发后生长2周的大豆品种文丰7号的幼苗的根部6小时，收获叶片提取RNA并反转录成cDNA第一链，cDNA第一链合成按ReverseTranscriptionSystemKit(Promega)试剂盒说明书进行，以该cDNA为模板，用引物N21F(5'-CAGTTGTGTTGAGGGACACA-3')和N21R(5'-GCACTCGACAAAAGGTAGCC-3')进行PCR扩增。PCR反应体系为10xBuffer2.5nl，dNTP2.5mM，N21F5pM，N21R5pM，cDNA20ng,Taq酶1U，加去离子水至25pl。PCR反应程序先94。C5min;然后94°C30S，60°C30s，72°Clmin，扩增35个循环；最后72。C延伸8min。PCR扩增得到650bp左右的EST片段。由于获得的EST片段不含有完整的编码区，含有完整的编码区的cDNA用3'RACE的方法获得。3'RACE的cDNA第一链合成的方法为，用200mMNaCl溶液浸泡萌发后生长2周的大豆品种文丰7号的幼苗的根部6小时，收获叶片提取RNA并反转录成cDNA第一链，3'RACE的cDNA第一链合成按ReverseTranscriptionSystemKit(Promega)试剂盒说明书进行，但用3CDS:5嗎-ggatcctaatacgactcactagcttmttttttmt(a/g/c)-3'引物替代了试剂盒中的Oligo(dT)16引物。根据获得的EST序列设计两条基因特异性引物GSP1:5'-CAGGGCGTGGTTCAATTTTCACG-3'和GSP2:5'-CAGGGCGTGGTTCAATTTTCACG-3';接头弓l物为3RAC:5'-ggatcctaatacgacteactagc-3'。以3'RACEcDNA为模板，以GSP1和3RAC引物进行第一轮PCR扩增，再以1^1第一轮PCR产物为模板，以GSP2和3RAC为引物进行第二轮PCR扩增。3，RACE的反应体系10xLABuffer(Takara)2.5pl，10mMdNTP0.5|al，GSP1或GSP20.5|iiM,3RAC0.5jaM，第一链cDNA(20ng)或第一轮PCR产物0.5|al，LATaq1U(Takara)，加水至终体积25jal。PCR反应程序94°C预变性3min;94°C30s，72°C2min30s扩增5个循环；94°C30s，70。C30s，72。C2min30s扩增5个循环；94。C30s，68°C30s，72。C2min30S扩增27个循环。结果表明上述3'RACEPCR扩增得到2047bp的cDNA片段，将RT-PCR和3'RACE得到的片段组装拼接获得长度为2152bp的全长cDNA命名为GmM/X2。经过测序表明，C7miVEY2长2152bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列，自序列1的5，端的第117至1718位核苷酸为GmiV/a2的编码序列，编码一条长534个氨基酸的蛋白GmNHX2，该蛋白GmNHX2的序列是序列表中序列2的氨基酸残基序列。疏水性分析结果表明，在GmNHX2的N-端是高度疏水性的并预测到10跨膜结构域，具有序列表中序列2的氨基端的第25—432位氨基酸残基序列；在GmNHX2的C-端有一小段高度亲水性的尾巴，具有序列表中序列2的氨基端的第433—534位氨基酸残基序列，预测其位于细胞质内。GmNHX2与番琉的Na+ZH+逆向转运蛋白具有高度的氨基酸序列相似性，序列一致性为80%,序列相似性为88%。实施例2、植物耐盐蛋白及其编码基因的功能验证1、在拟南芥中过表达载体的构建将Gm7WiY2的ORF克隆到pBI121载体并置于35S启动子控制下。具体方法为根据上述GmA^Z2cDNA序列设计引物，序列如下所示BamN2:5，-GCCGGATCCATGGCCTCGGAATTAGAAATTTC-3，(下划线标注的是5ami/I酶识别位点)；SacN2:5'-GCGGAGCTCTCATGATGAATAGTGGTTCTGGC-3'(下划线标注的是SacI酶识别位点)。用200mMNaCl溶液浸泡萌发后生长2周的大豆品种文丰7号的幼苗的根部6小时，取叶片提取RNA并反转录得到cDNA，作为模板，以BamN2和SacN2为引物进行PCR扩增。PCR扩增得到1605bp的片段，测序表明，该片段具有自序列1的5'端的第117至1718位核苷酸序列(GmNHX2的ORF)。将扩增得到的片段用5"mEI和&cI双酶切，将得到的片段插入到pBI121载体的5"mZ/I和SacI酶识别位点之间，得到重组载体。将该重组载体进行酶切和测序鉴定。将经过测序表明含有GmNHX2的ORF的重组载体命名为pBI121-GmNHX2。2、转pBI121-GmNHX2拟南芥的获得用农杆菌介导法获得转pBI121-GmNHX2拟南芥，具体方法为将重组载体pBI121-GmNHX2转入农杆菌菌株GV3101获得重组菌，将该重组菌利用PCR方法验证。利用以根癌农杆菌介导的蘸花法转化(CloughSJBentAF，Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacteriura-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana,ThePlantJournal,1998/16/P735-743.[4])，通过鉴定正确的含有pBI121-GmNHX2的重组农杆菌菌株GV3101，将pBI121-GmNHX2转入拟南芥(Columbia生态型)获得T。代转pBI121-GmNHX2拟南芥。将获得的To代转pBI121-GmNHX2拟南芥种子种植在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选，获得阳性植株，将获得的阳性植株逐代在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选获得纯合体的转基因株系。筛选获得的纯合的株系用RT-PCR验证，验证方法提取12个正常条件下生长的转pBI121-GmNHX2拟南芥株系和野生型(Columbia生态型)的RNA并反转录成第一链cDNA，以该cDNA为模板，用引物N25F:5'-GCAGGTGTTGGAGTTGGATT隱3'，N25R:5'-TGACCAGCTATGTTGCTCCA-3'进行PCR扩增，转入了pBI121-GmNHX2的阳性转基因拟南芥应扩增得到410bp的片段。结果表明获得12个RT-PCR鉴定阳性的转pBI121-GmNHX2拟南芥株系，选择其中三个株系(Ll、L4和L6)作为其耐盐性鉴定的材料。3、转pBI121-GmNHX2拟南芥的耐盐性鉴定将野生型拟南芥(Columbia生态型)和转pBI121-GmNHX2拟南芥的3个株系(Ll、L4和L6)的种子均匀的播种于MS培养基上，于4。C放置3天后，转移至培养室于22°C，16h光照/8h黑暗条件下生长1周后，移入含有200mMNaCl的MS固体培养基上，继续在该温度和光照条件下进行胁迫处理7天。盐处理7天后保持大于75%的绿色叶片面积的植株计为存活，存活率为存活的植株数占处理的总植株数的百分数。实验重复三次，每次每个株系至少60粒种子。结果如图1所示，结果表明在200mM处理下，野生型和转pBI121-GmNHX2拟南芥的生长和根长都受到抑制，但转pBI121-GmNHX2拟南芥的生长表现要明显好于野生型，转pBI121-GmNHX2拟南芥能维持绿色的叶片并继续生长，而野生型植株则逐渐白化死亡。过表达GmNHX2基因的拟南芥植株(转pBI121-GmNHX2拟南芥)株系L1、L4和L6在200mMNaCl处理下，转基因植株的存活率分别为46.34%、70.59%%、65.06%,而野生型的存活率为24.36%，表明GmNHX2基因在拟南芥中过表达可以提高转基因植株的耐盐性。图1中，wt表示野生型；Ll、L4和L6表示3个独立的转pBI121-GmNHX2拟南芥株系。<160〉2<210〉1<211>2152<212>DNA〈213〉大豆属大豆(G/戸'"e顧x(Linn.)Merr)<400〉1cagttgtgttgagggacacatcattctcttctgattcgcgaagaactcaacgatcccaac60ccaatcgcgiatcggaagcaatcgatcagtcaattgcttccggc肌gg卿acaataatgg120cctcggaattagaaatttctccggcggscgctcgcaaggctcccggcaaggagcagcaag180ccgccggcgtcggaatcctcctgcagatcatgstgttggtcttgtccttcgtcctcggcc240acgtcctccgccgcaagaaggtttacatcattcccgaagccagtgcttctcttctcatag300ggttaattgttggtatactagcaaacatttcagacaccgagactaatatcagggcgtggt360tcaattttcacgaggagtttttcttcctgttcctgctacctcctatcatatttcagtctg420ggttcagtctcgcacctaaaccctttttctcaaattttggagcaeittgtcacatttgcta480tattcggtaccttcattgcttcaattgtaacgggtatcttggtttatcttgg"tggcttgc540tctttctgatgtataggctaccttttgtcgsgtgcctgatgtttggtgctcttatatcag600ctactgatcctgttactgttttgtccatatttcaggaactgggcac卿tgcc站tctat6603tgCCttggtttttggag肌tctgttttga8tgatgcca_tggcaatttctttgtacagga720caatgtcatcagttagagctgatccatctggacaaaatttattcatggtggttgttcgat780ttttggagacttttgtagggtcaatgtctgcaggtgttgg3gttgg3tttatatctgctt840tgctgttt犯gt3tgC鄉3ttggatattg8LC犯CCttC8gaacttggsgagttgtcttt900ttgtccttttcccatatttctcgtacatgcttgctg肌ggccttggtctgtctggtattg960tatcaatcctgttcacaggaatagtcatgaatattccaat11atcacaaa1020gttctcaacgatttgcctctgcttttttcgagttaatatcatctttagctgaaacatttg1080tatttstatacatgggctttgatattgctatgg3gC犯C3t3gCtggtC3catgttggat1140ttatattcttctccattatattcattggMttgcaagggcagcaaatgtcttctcatgtg1200cttatttggtcaatctggtcaggcccactcatcgaaagataccttcaaaacatcagaagg1260cactttggt3teigtggacttcg鄉恥caatggcttttgcgcttgctttgcaatcaattc1320atgatcttccgggC3g3Ct3tctttactgcaactactgca3tagttgttt1380tgacggtattgctgattggtggttcaacaggtagcatgctggaagctctagatgttgtag1440gtggagataatgatagccctttggcttcagttggtaccatcacaaatttcgatggaaaca1500atggtta_ta/ttgctcctcattac33cg犯gaatcatcttctgggaaca肌15606igctaaetag21attccacaagactgctgcatcttttacggcattagataaaaactacctga1620ccccattctttacaagtcaaaatgg卿tgaagatgatgaagccgagccttttacttcca1680ca卿tcggg3tttC3tggCcagaaccactattcatcatgattcgttcca1740tgaatgcttt"tttgtacateiatttccgtcageitagctcgtaggaattggcac肌tacagg1800aatctaatttacctcctacattccaagttgtacgatagagaatctcatgtcaagtctcat1860tagtttggacaacaccatgtctggcagagatagcattccatgcagttgatacatgcctct1920gccatgaagttggaggtttataattggatctcaccataceiatcacacacgtatttttaag1980ttgacatttatacgggttttcttacttagtctagttcaggtgaattctgaaaattctggc2040tcacttcatcattgtgacagtgaaattatacccctcaaiSLSLtgaetttcaatcatggaaaac2100tgtatctcaaaataaatgcatcatggactatggctgagtccttatacaggeg2152〈210〉2<211>534<212>PRT〈213〉大豆属大豆(G7少c/"em"x(Linn.)Merr)〈400〉2MetAlaSer1GlyLysGluGlulieSerProAlaAspAlaArgLysAlaPro15lieMetGluLeu5GinGinAlaAlaGly20LeuSerPheValAla10GlylieLeuLeuMetLeuVal35ValTyrlielieProGlu50ValGlylieLeuAla65TrpPheAsnLeu40AlaSerAlaSer55AsnlieSerAspThr70GluGluPhePheVal25GlyHisValLeuPheHisGluGluPhePhePhe8590lieliePheGinSerGlyPheSerLeuAla100105AlalieValThrPheAlalieAsnPheGly115SerlieValThrGlylie130Leu135Phe120ValTyrLeuArg45lieGin30ArgGlyLeuLeu60GluThrAsnlie75LeuPheLeuLeuProLysPheGlyGlyGly140ProPhe110PheLysLysLeulieArgAla80ProPro95PheSerlieAlaThr125LeuLeuPheLeuMetTyrArgLeuProPheValGluCysLeuMetPheGlyAla145SerAlaThrAspPhe150ValThrValLeuThrAspAspAlaAlaMet195SerAsn180AlaPro165LeuTyrAlaLeuMet155liePheGinGluSer170PheGlyGluSerVal185ArgThrMetSerLeulie160LeuGly175LeuAsnAspPro210ThrPhe225AlaLeuLeuPhelieSerLeuTyr200PheMetValValVal190ValArgAlaGlyGinAsnGlyValGlySerLeu215SerAlaGlyValSer205ArgPheLeuGluMet230TyrAlaGlyLeuLys245LeuPheValLeuGly235lieVal220ValGlyPheLeuGluSerCys260LeuGlyLeuSerAsp250ProTyrPheSerAlaGluGly275MetLysHisTyrPhe265lieValSerlielieSer240AspAsnLeuGinAsn255MetLeulieVal290ArgPheAlaSerAla305PheValPhelieGly280TyrSerAsnLeuTyr270PheThrGlyThr295PheGluLeulieLeu285GinSerSerGinPhe310MetGlyPheAspSer300SerLeuAlaTrpSerAlaArgArgPro370TyrSer385HisAla355ThrTyr325GlyPheliePheSer315AlaMetGluGinVal340AlaAsnValPhelie330SerlieliePhePhe345CysAlaTyrLeuGluThr320HisSer335GlylieHisArgLysArgGlyLeuArgSer360ProSerLysHislie350AsnLeuValGly390lie375AlaMetAlaPheVal365LysAlaLeuTrpAla395Gin380LeuAlaLeuGinSer400lieHisAspLeuProGluGlyHisGlyGinThrliePheThrAlaThr405410415ThrAlalieValValLeuThrValLeuLeulieGlyGlySerThrGly420425430SerMetLeuGluAlaLeuAspValValGlyGlyAspAsnAspSerPro435440445LeuAlaSerValGlyThrlieThrAsnPheAspGlyAsnAsnGlyTyr450455460lieAlaProHisTyrAsnGluGluSerSerSerGlyAsnLyslieLys465470475480MetLysLeuLysGluPheHisLysThrAlaAlaSerPheThrAlaLeu485490495AspLysAsnTyrLeuThrProPhePheThrSerGinAsnGlyAspGlu500505510AspAspGluAlaGluProPheThrSerThrArgSerGlyPheHisGly515520525GinAsnHisTyrSerSer530权利要求1、一种植物耐盐蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQID№.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQID№.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐盐功能的蛋白质。2、权利要求l所述的植物耐盐蛋白的编码基因。3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述植物耐盐蛋白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一.-1)自序列表中SEQIDW2:l的5，端的第117至1718位核苷酸；2)序列表中SEQIDJV2:1的核苷酸序列；3)编码序列表中SEQIDW2:2蛋白质序列的多核苷酸；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQIDW:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。4、含有权利要求2或3所述的植物耐盐蛋白的编码基因的重组表达载体。5、含有权利要求2或3所述的植物耐盐蛋白的编码基因的转基因细胞系。6、含有权利要求2或3所述的植物耐盐蛋白的编码基因的宿主菌。7、权利要求1所述的植物耐盐蛋白的编码基因在提高植物耐盐性中的应用。8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物为水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、马铃薯、油菜、甘薯、绿豆、红小豆、橡胶、香蕉、西红柿、黄瓜、苜蓿或拟南芥。全文摘要本发明公开了一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用。该植物耐盐蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQID№.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQID№.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐盐功能的蛋白质。实验表明，该蛋白具有很高的耐盐性，将该蛋白的编码基因转入植物中，可提高植物的耐盐性。文档编号C07K14/415GK101386645SQ20081022531公开日2009年3月18日申请日期2008年10月29日优先权日2008年10月29日发明者关荣霞,刘章雄,周国安,常汝镇,张丽娟,李向华,李英慧,王克晶,邱丽娟,金龙国申请人:中国农业科学院作物科学研究所