专利名称：一种植物耐逆性蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物耐逆性蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题，据统计全球盐碱土约有10亿公 顷，占世界陆地面积近7.6%。我国是一个发展中的农业大国，全国盐碱土约有0.2 亿多公顷占全国耕地面积的1/3。盐分胁迫能显着的抑制植物的生长，甚至导致植物 的死亡。在长期的进化过程中，不同植物形成了不同的机制来适应盐分的胁迫，同 时其抗盐能力也各不相同。大多数农作物都对盐分非常敏感，而盐生植物虽然能在 高盐条件下生存，但它们的经济价值往往非常有限，提高作物的抗盐能力已经成为 我国农业生产和科研中的重要内容。
植物对盐分的抗性是一个多基因控制的复杂性状。盐分对植物的影响涉及到植 物体内的各个方面和代谢过程。包括离子毒害，渗透胁迫和氧化胁迫以及光合作用。 因此，对抗盐、耐盐相关蛋白及其编码基因的研究具有重要的意义。
蛋白激酶基因是一类在信号传递途径中起重要作用的基因。Saijo等将OsCZ^《7 基因导入水稻，转基因植株中一些胁迫响应基因的诱导表达增强，C^CZ)P《7基因的 表达水平与植株的抗盐和抗旱能力密切相关。拟南芥AtCDPKl和AtCDPK2基因的 表达可以被盐和干旱诱导，但不被低温或高温诱导，推测这两个基因参与了渗透胁 迫信号的转导(Urao et al.， Mol. Gen. Genet.， 1994, 244: 331-340)。研究发现，两种Ca2+ 依赖的蛋白激酶AtCDPKl和AtCDPKla激活胁迫诱导基因HVA1表达(Sheen, Science, 1996,274: 1900-1902)。另一种参与盐胁迫信号传导的拟南芥蛋白激酶基因 AtGSKl编码的蛋白与糖原合成酶激酶GSK3相似。拟南芥突变体互补实验发现， AtGSKl可以恢复盐诱导基因PMR2A的表达，并且该基因在盐和ABA胁迫下上调 表达(Charrier et al.， Plant Physiol, 2002,130: 577-590)。
在真核生物中有一类非常保守的MAPK激酶途径，与盐胁迫造成的氧化胁迫应 答反应有关。已鉴定的与盐胁迫相关的MAPK激酶级联反应中的组分有拟南芥 AtMEKKl、AtMEKl/AtMEK2、AtMPK4、ANPl以及烟草NPKl、AtMPK3禾口 AtMPK6 等(Kovtun et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000， 97:2940-2945; Ichimura et al.， Biochem. Biophys. Res. Commun" 1998, 253: 532-543; Moon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003,100:358-363)。 AtMPK3基因可同时受干旱、高盐或低温的诱导，胁迫条件下
AtMPK3基因5min内就被诱导表达，以后表达持续增加至24h后达到峰值。盐胁迫 可以诱导AtMEKKl的表达，而AtMEKKl又可激活AtMPK4，使植物耐盐性增强。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐逆性蛋白及其编码基因与应用。 本发明所提供的植物耐逆性蛋白，名称为GmPK，大豆属大豆(G/yc/"ema;c (Linn.)Merr)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质
1) 序列表中的SEQIDW.2的氨基酸残基序列；
2) 将序列表中的SEQIDW.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐逆性功能的蛋白质。
其中，序列表中的序列2由352个氨基酸残基组成。GmPK是丝氨酸/苏氨酸类 蛋白激酶，自序列2的氨基端第4-260氨基酸为蛋白激酶催化结构域序列。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸 残基的取代和/或缺失和/或添加。
为了使(a)中的GmPK便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序 列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表l.)际签的序列标签残基序列
Poly-Arg5-6 (通常为5个)RRRRR
Poly-His2-10(通常为6个)HHHH朋
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL
上述(b)中的GmPK可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 到。上述(b)中的GmPK的编码基因可通过将序列表中SEQIDJVT2: 1的DNA序 列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为了便于蛋白的分泌表达，还可在所述GmPK的氨基末端添加上信号肽序列。 上述植物耐逆性蛋白的编码基因(GmPX)也属于本发明的保护范围。 上述植物耐逆性蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一
1) 自序列表中SEQIDW: l的5'端的第351至1406位核苷酸-，
2) 序列表中SEQIDJV2: 1的核苷酸序列；
3) 编码序列表中SEQIDW2: 2蛋白质序列的多核苷酸；
4)在高严谨条件下可与序列表中SEQIDJVfc: 1限定的DNA序列杂交的核苷酸 序列。
上述高严谨条件可为在0.1xSSPE(或O.lxSSC)， 0.1。/。SDS的溶液中，在65°C
下杂交并洗膜。
其中，序列表中的SEQIDW: 1由1531个脱氧核苷酸组成，自5，端的第351 至1406位核苷酸为Gm尸尺的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)，序列表中序 列1编码序列表中序列2的氨基酸残基序列。
含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护 范围。
实验表明，将本发明耐逆性蛋白的编码基因整合到拟南芥基因组中过表达，可 显著提高转基因植株的耐盐性和抗旱性。本发明的基因可用于培育高度耐盐和抗旱 的作物品种，具有很高的应用价值。
图1为过表达GmPK基因的拟南芥转基因植株(转pBI121-GmPK拟南芥)的耐盐 性鉴定(处理的NaCl浓度为200mM)。
图2.转pBI121-GmPK拟南芥的抗旱性鉴定结果。
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。 实施例1、植物耐逆性蛋白及其编码基因的获得
分析大豆品种绥农14的叶片为材料构建的cDNA文库中获得的ESTs,发现一 个渗透胁迫相关的EST，用tblast程序搜索GenBank的数据库，设计一对引物，用 RT-PCR的方法从大豆品种文丰7号(统一编号ZDD02611;中国国家种质资源库 提供)的叶片中克隆到一个植物耐逆性蛋白的cDNA。具体方法为
用200mMNaCl溶液浸泡萌发后生长2周的大豆品种文丰7号的幼苗的根部6 小时，收获叶片提取RNA并反转录成cDNA第一链，以该cDNA为模板，用引物 PK1F (5'-TGCTACGCACACACAAACACA-3')和PK1R (5'曙TATGTCCCATGCGGAAAACTT誦3 ，)进行PCR扩增。
PCR反应体系为lOxBuffer 2.5pl， dNTP 2.5mM， PK1F 5pM, PK1R 5pM, cDNA 20ng,T叫酶1U，加去离子水至25pl。
PCR反应程序先94。C 5min;然后94°C 30S， 60°C 30s， 72°C lmin，扩增
35个循环；最后72。C延伸8min。
PCR扩增得到1.5kb左右的片段，即获得的全长cDNA命名为Gm尸《。经过测 序表明，Gm尸尺长1531bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列，自序列1的5'端的 第351至1406位核苷酸为Gm尸《的编码序列，编码一条长352个氨基酸的蛋白 GmPK， GmPK具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。自序列2的氨基端第4-260 氨基酸为蛋白激酶催化结构域序列。
实施例2、植物耐逆性蛋白及其编码基因的功能验证
1、 在拟南芥中过表达载体的构建
将GmPK的ORF克隆pBI121载体并置于35S启动子控制下，具体方法为
根据上述GmAT/iY2cDNA序列设计引物，序列如下所示Fl: 5，-CGCGTCGACATGGAGAAATACGAGCTCGT-3'(下划线标注的是Sal I酶识别 位点)；Rl: 5'-CTGCTCGAGTTAACTGACATGAAATTCCC-3'(下戈機标注的是 Xhol酶识别位点)。
用200mMNaCl溶液浸泡萌发后生长2周的大豆品种文丰7号的幼苗的根部6 小时，取叶片提取RNA并反转录得到第一链cDNA，以该cDNA为模板，以Fl和 Rl为引物进行PCR扩增。
PCR扩增得到1077bp的片段，测序表明，该片段具有序列1的5'端的第351至 1406位的核苷酸序列。
将扩增得到的片段用Sal I和Xho I双酶切，将得到的片段插入到pBI121载体的 SalI和XhoI酶识别位点之间，得到重组载体。将该重组载体进行酶切和测序鉴定， 将经过测序表明含有GmPK的ORF的重组载体命名为pBI121- GmPK。
2、 转pBI121-GmPK拟南芥的获得
用农杆菌介导法获得转pBI121- GmPK拟南芥，具体方法为将重组载体pBI121-GmPK转入农杆菌菌株GV3101获得重组菌，将该重组菌利用PCR方法验证。利用 以根癌农杆菌介导的蘸花法转化(Clough SJ Bent AF， Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana， The Plant Journal, 1998/16/ P735-743. [4])，通过鉴定正确的含有重组载体 pBI121- GmNHX2的农杆菌菌株GV3101 ，将pBI121- GmNHX2转入拟南芥Columbia 生态型获得Tn代转pBI121- GmPK拟南芥。
将获得的T。代转pBI121- GmPK拟南芥种子种植在含有50mg/L卡那霉素的MS 培养基上筛选，获得阳性植株，将获得的阳性植株逐代在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选获得纯合体的转基因株系。筛选获得的纯合的株系用RT-PCR验 证，提取16个正常条件下生长的pBI121- GmPK拟南芥株系和野生型(Columbia生 态型)的RNA并反转录得到eDNA第一链；以该cDNA为摸板，用引物PK6F: 5 ， -CCAAGGAGCTTGTTGCCATG-3 ， ， PK6R: 5 ，-GATTCTCCTAGCTGGATTTG匿3 ， 进行PCR扩增，整合了 pBI121- GmPK的阳性转基因拟南芥植株应扩增得到671bp 的片段。结果表明获得16个RT-PCR鉴定正确的转？81121-GmPK拟南芥株系，选 择其中三个株系(L6、 L11和L13)作为其耐盐性和耐旱性鉴定的材料。
3、 转pBI121-GmPK拟南芥的耐盐性鉴定
将野生型拟南芥(Columbia生态型)和转pBI121- GmPK拟南芥的3个株系(L6、 L11和L13)的种子均匀的播种于MS培养基上，于4t:放置3天后，转移至培养室 于22°C,16h光照/8h黑暗条件下生长1周后，移入含有200mMNaCl的MS固体培养 基上，继续在该温度和光照条件下进行胁迫处理7天。盐处理7天后保持>75%的绿 色叶片面积的植株计为存活，存活率为存活的植株数占处理的总植株数的百分数。 实验重复三次，每次每个株系至少60粒种子。
结果如图l所示，结果表明，在200mM处理下，野生型和转基因植株的生长 和根长都受到抑制，但转基因植株的生长表现要明显好于野生型，转基因植株能维 持绿色的叶片并继续生长，而野生型植株则逐渐白化死亡。过表达GmPK基因的拟 南芥植株(转pBI121-GmPK拟南芥)株系L6、 Lll和L13在200 mMNaCl处理下， 转基因植株的存活率分别为74.4%、 86.5%、 79.8%，而野生型的存活率为16.1%， 表明GmPK基因在拟南芥中过表达可以提高转基因植株的耐盐性。图1中，wt表示 野生型；L6、 Lll和L13表示3个独立的转pBI121-GmPK拟南芥株系。
4、 转pBI121-GmPK拟南芥的抗旱性鉴定
将野生型(Columbia生态型)和转pBI121-GmPK拟南芥的3个株系(L6、 Lll 和L13)的种子均匀的播种于MS培养基上，于4r放置3天后，转移至培养室于22 'C，16h光照/8h黑暗条件下生长l周后，移栽至土壤中生长l周后，停止浇水18天 后，恢复浇水3天后，叶片恢复绿色并能继续生长的植株计为存活，存活率为存活 的植株数占处理的总植株数的百分数。实验重复三次，每次每个株系30个植株用于 抗旱鉴定。
结果表明，转pBI121-GmPK拟南芥的L6、 Lll和L13株系的存活率分别为 60.45%、 79.31%、 65.78%，而野生型只有16. 67%存活，表明GmPK基因在拟南芥中过 表达可以提高转基因植株的抗旱性。图2中，wt表示野生型；L6、 L11和L13表示 3个独立的转pBI121-GmPK拟南芥株系。
<160〉2
<210〉1
<211>1531
<212>腿
<213〉大丑属大旦(G7yc/"e wax (Linn.) Merr)
<400〉1
tgctacgcacacacaaacacaaac3ca^g3attcttttgtctctttcttatcagtatttt60
cttcccctgcgttaaagttaaagttgcaattcctctgtctgttccttcaattcttcaaat120
cccgaaattgtcatttttaatctcgctgcaaattgcgctcacgattctttgctttccttc180
gaaactctccttctttctctctcataaataaattcgccacctttgtattt240
ttgcgtaactgctctgcaccttattgattcttctctctctctccattctccaactctcca300
tttcgatctgcagctccccgctttcaaagctctgaaatttccgattcggg360
acgagctcgtgaaggat已tagg3tctggg3atttcggtgtggccaggctcatgcgacaca420
ggagcttgttgccatg犯atgggtc織agsttgatgaga480
atgttgcg昭aaccatagaagtcttcggcaccccaatattattcggttca540
agg鄉tggttctgactccaacccatctgggtattgttatggagtstgcggctggtggag600
agctctttgagaggatttgcagtgctggaagattcagcgacgatatt.tct660
tccagcagctcatctcaggeigttsgctsctgtcattccatgc犯atctgtcatcgagact720
tg鄉Ctgg3ttggstggcagcccsgccccacggctcaaaatttgtg已tt780
ttggctattctaagtcatctctgcttcattctgLggcctaagtc認ggtggg8accccgg840
cctacattgcacctgaggttctttcacgtag卿g城gatgga犯gttagcagatgtat900
ggtcctgtggagtgactctttatgtaatgctggtgggagcatacccatttg肌gaccaag960
aaatttcaggaaaac cat c aatcg犯ttatggctgttcaatacaagattc1020
cagactacgttcacatatctcaagactgtagacatcttctatctcgcatttttgtggcaa1080
atccagctaggsg犯tcaccatt犯ggaaatcaagtcccacccatggtttgtaaagaact1140
tgcccagagsgtagctcaagctgcctacta犯ccca^cct1200
tttctcttcagagtatagaggacatcatgaatattgttgagg鄉c頃ggctccacctc1260
cagcatccaggtC3attgg8ggatttggctgggg郷卿1320
c^a^ga^gc ggctgsgactgaagaag3犯ga^gtcaaggaagcac1380
aagcaagtggggaatttCEttgtcag"ttaaaaagtgtttatttttagatagageLgc肌1:tg1440
attcttggtttcctttgcacttagctaagttc^ctaaggtgagtgtgttttgcttgtat1500
gtataaaattaagttttccgC￡ltggg3C3t1531
<210> 2<211〉 352 <212〉 PRT <213>大豆属大豆(
<400〉 2 Met Glu Lys 1
Val Ala
Lys Tyr
lie lie 50
Glu Val 65
Ala Gly
Glu Asp
Tyr Cys
Thr Leu 130 Gly Tyr 145
Gly Thr
Arg
lie
35
Asn
Tyr
Leu
20
Glu
His
Glu 5
Met Arg Arg
Leu Val
Val Leu Thr
Gly Glu
Glu
His 115 Leu
Ala 100 Ser
Leu
85
Arg
Arg
Gly
Ser
Pro
70
Phe
His
His
Leu 55 Thr
Lys
Lys
Lys
40
Arg
Asp
Asp
25
lie
lie
10
Thr
Gly Lys Asp Glu Asn
Ser Gly Asn
His Pro Asn
Glu Leu
Val
45
lie
His Leu Gly Glu Arg lie
Tyr Phe Phe
Met Gin lie
Asp Gly Ser Ser Lys Ser
Pro Ala
Asp Gly Lys
Met Leu
Leu 180 Gly
Tyr 165 Ala
Ala
Ser 150 lie
Asp
Tyr
Pro 135 Leu
Cys 120 Ala
Gin 105 His
Val Trp
Pro
Val 195
Phe Arg Lys Thr lie Asn Arg
Phe 200 lie
Ser 185 Glu
Met
Cys 90 Gin
lie
75
Ser
lie
60
Val
Met
Ala Gly
Leu lie Ser
Arg Asp Leu Pro Arg Leu
Leu His Ser
Ala Pro Glu
Val 170 Cys
Asp
Ala
Arg 155 Leu
Lys 140 Pro
Lys 125 lie
Val
30
Ala
Arg
Glu
Arg
Gly 110 Leu
Phe Gly 15
Ala Met
Arg Glu
Phe Lys
Tyr Ala
80 Phe Ser 95
Val Ser Glu Asn
Cys Asp Phe
Lys Ser Arg Gly Val Thr Gin Glu
Ser
Arg
Leu 190 Pro
Thr Val 160 Glu Tyr 175
Tyr Val Lys Asn
Asp 205
Val Gin Tyr Lys lie Pro
210 215 220
Asp Tyr Val His lie Ser Gin Asp Cys Arg His Leu Leu Ser Arg lie 225 230 235 240
Phe Val Ala Asn Pro Ala Arg Arg lie Thr lie Lys Glu lie Lys Ser
245 250 255
His Pro Trp Phe Val Lys Asn Leu Pro Arg Glu Leu Thr Glu Val Ala
260 265 270
Gin Ala Ala Tyr Tyr Arg Lys Glu Asn Pro Thr Phe Ser Leu Gin Ser
275 280 285
lie Glu Asp lie Met Asn lie Val Glu Glu Ala Lys Ala Pro Pro Pro
290 295 300
Ala Ser Arg Ser lie Gly Gly phe Gly Trp Gly Gly Glu Glu Glu Glu 305 310 315 320
Glu Asp Glu Thr Lys Glu Ala Val Ala Glu Thr Glu Glu Asp Glu Tyr
325 330 335
Glu Lys Arg Val Lys Glu Ala Gin Ala Ser Gly Glu Phe His Val Ser 340 345 350
权利要求
1、一种植物耐逆性蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐逆性功能的蛋白质。
2、 权利要求l所述的植物耐逆性蛋白的编码基因。
3、 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述植物耐逆性蛋白的cDNA 基因具有下述核苷酸序列之一1) 自序列表中SEQIDJV2: 1的5，端的第351至1406位核苷酸；2) 序列表中SEQIDM: 1的核苷酸序列；3) 编码序列表中SEQIDW: 2蛋白质序列的多核苷酸；4) 在高严谨条件下可与序列表中SEQIDW2: 1限定的DNA序列杂交的核苷酸 序列。
4、 含有权利要求2或3所述的植物耐逆性蛋白的编码基因的重组表达载体。
5、 含有权利要求2或3所述的植物耐逆性蛋白的编码基因的转基因细胞系。
6、 含有权利要求2或3所述的植物耐逆性蛋白的编码基因的宿主菌。
7、 权利要求1所述的植物耐逆性蛋白及其编码基因在提高植物耐逆性中的应用。
8、 根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物为水稻、小麦、玉米、 大豆、棉花、马铃薯、油菜、甘薯、绿豆、红小豆、橡胶、香蕉、西红柿、黄瓜、 苜蓿或拟南芥。
9、 根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述耐逆性为耐盐性和/或抗 旱性。
全文摘要
本发明公开了一种植物耐逆性蛋白及其编码基因与应用。该植物耐逆性蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐盐功能的蛋白质。实验表明，该蛋白具有很高的耐盐性和抗旱性，将该蛋白的编码基因转入植物中，可提高植物的耐盐性和抗旱性。
文档编号C07K14/415GK101386646SQ20081022531
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月29日 优先权日2008年10月29日
发明者关荣霞, 刘章雄, 周国安, 常汝镇, 张丽娟, 李向华, 李英慧, 王克晶, 邱丽娟, 金龙国 申请人:中国农业科学院作物科学研究所