专利名称：一种在微悬臂梁的金膜上修饰抗体的方法
技术领域：
本发明涉及一种在微悬臂梁的金膜上修饰抗体的方法。
背景技术：
随着原子力显微镜(AFM)和微机电系统(MEMS)的出现，微悬臂梁传感技术 迅速发展成为一种新的传感方法，其原理是当微悬臂梁表面发生生化反应时会产 生表面应力的改变，从而导致微悬臂梁产生弯曲变形，结合光学或电学方法监测这 种变形，就可以知道整个生化反应进行过程的信息。通过依靠免疫特异性识别建立 的微悬臂梁免疫传感技术与传统的酶联免疫吸附测定技术(ELISA)相比，该项技 术在检测时无需对待测样品进行标记，消除了可能由标记产生的附加影响，且灵敏 度高，可实现实时、并行的监测整个生化反应的发生过程，从而得到更丰富的生物 信息，容易实现大尺度、高通量、平行阵列测量的显著优势，特别适用于难于标记 的示踪物，如荧光素或示踪同位素的被检测靶分子。近年来，微悬臂梁免疫传感技 术在癌症检测、DNA杂交和转录因子等方面都得到了广泛的应用。
微悬臂梁免疫传感技术应用的关键，是如何将灵敏度高、特异性强的抗体有效 的结合到微悬臂梁的金膜上并尽量保持抗体的活性。关于将抗体固定到微悬臂梁上 对微悬臂梁进行修饰的方法，国内外文献报道的方法主要是通过具有双功能基团的 巯基化试剂进行的，主要方法有以下两类第一类方法是先将巯基化试剂结合到微 悬臂梁上，然后活化巯基化试剂上的羧基或氨基，使之与抗体上的氨基或羧基结合； 第二类方法是先将抗体进行巯基化，然后再结合到微悬臂梁的金膜上。无论是先将 巯基化试剂结合到微悬臂梁上，还是先用巯基化试剂将抗体巯基化，两种方法均需 要增加一定的反应步骤。前者需要将结合在微悬臂梁上的巯基化试剂的另一功能团 (-C00H或-NH2)进行活化以便跟抗体结合，后者往往需要加入二硫苏糖醇(DTT) 还原出自由巯基。这些增加的步骤会影响抗体固定的稳定性与一致性，引起抗原抗 体识别结果的重复性较差等现象。
发明内容
本发明的目的是提供一种在微悬臂梁的金膜上修饰抗体的方法。 本发明所提供的在微悬臂梁的金膜上修饰抗体的方法，是将带有金膜的微悬臂梁投入到金黄色葡萄球菌A蛋白溶液中，得到结合有金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬
臂梁；再将所述结合有金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁投入到抗体溶液中，将抗
体修饰到微悬臂梁的金膜上。
上述方法中，所述微悬臂梁和所述金黄色葡萄球菌A蛋白溶液的反应条件为，
30 — 37. 5。C反应0. 5 — 2. 0h，优选为37。C反应lh。
所述结合有金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁和所述抗体的反应条件为，30 —
37. 5。C反应1.0 — 3.0h，优选为37。C反应2h。
在实际应用中，所述抗体可为鼠、兔等动物源的多克隆抗体、单克隆抗体等，
如抗克伦特罗单克隆抗体。
利用上述任一方法制备的修饰有抗体的微悬臂梁也属于本发明的保护范围。 本发明的另一个目的是提供金黄色葡萄球菌A蛋白的一种新用途。 本发明所提供的金黄色葡萄球菌A蛋白的新用途是其在制备修饰有抗体的微悬
臂梁中的应用。
鉴于微悬臂梁免疫传感技术对抗体固定的重要性及巯基化试剂参与抗体固定 的复杂性，本发明先将金黄色葡萄球菌A蛋白固定到微悬臂梁上，然后通过金黄色 葡萄球菌A蛋白上活化的氨基与抗体结合，将抗体修饰到微悬臂梁的金膜上。结果 表明，本发明所提供的微悬臂梁金膜的抗体修饰方法与现有的方法相比具有反应步 骤少、操作时间短、避免因巯基化反应对抗体活性的损失等优点，并且为所有鼠源 或兔源抗体在悬臂梁上的固定提供了 一种通用的方法。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明的微悬臂梁金膜的抗体修饰方法做进一步说明， 但不限制本发明。
实施例1、将抗体修饰到微悬臂梁的金膜上
1、通过金黄色葡萄球菌A蛋白将微悬臂梁与抗体结合
将洗净并晾干的镀有金膜的微悬臂梁(购自美国IBM公司)投入到浓度为10 mg/L的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)(购自美国Sigma公司)溶液中，37"C温育 lh，得到结合上金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁。
将上述结合上金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁用包被缓冲液清洗后投入到浓 度为10mg/L的抗克伦特罗单克隆抗体(购自美国USBiological公司)溶液中，37 。C温育2 h，即将抗克伦特罗单克隆抗体修饰到微悬臂梁的金膜上。2、抗克伦特罗单克隆抗体与微悬臂梁金膜的结合情况检测
(1) 封闭取两根上述步骤1获得的修饰有抗克伦特罗单克隆抗体的微悬臂
梁，PBS清洗后用氮气吹干，然后浸入到lOOy L质量百分含量为5。/。的BSA溶液(用 PBS溶解)中，37。C封闭30 min;
(2) 清洗用镊子小心取出微悬臂梁，用洗涤液冲洗数次，氮气吹干；
(3) 竞争将氮气吹干后的微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中(做好标 记，抑制孔与非抑制孔)，抑制孔加入50 y L经样品稀释液(含有终浓度为0. 1 mol/L pH 7. 5的PBS、 0. 1%体积百分含量的吐温-20和0. 1%质量百分含量的明胶)稀释的 浓度为100 mg/L的克伦特罗溶液(购自美国Sigma公司)，非抑制孔加入50uL 样品稀释液作为对照；然后再分别加入浓度为1.0 mg/L的克伦特罗辣根过氧化物 酶联结物(购自美国Sigma公司)，37。C温育竞争30 min;
(4) 清洗用镊子小心取出上述抑制孔与非抑制孔中的微悬臂梁，用洗涤液 冲洗数次，氮气吹干；
(5) 显色将氮气吹干后的两根微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中，每 孔加入100yL显色溶液(TMB底物使用液与底物缓冲液按1: 9的体积比混匀，每 10mL上述混合液中加入4.0 mg过氧化脲)，室温显色；
(7)终止15min后，每孔加入50 u L终止液终止反应，取出微悬臂梁，450 nm波长处分别读取OD值。
实验设三次重复，结果表明，抑制孔和非抑制孔的450 nm波长下的吸光度值 分别为0. 217和1. 316，说明抗克伦特罗单克隆抗体能有效结合到微悬臂梁的SPA 金膜上。
实施例2、将抗体修饰到微悬臂梁的金膜上
1、 通过金黄色葡萄球菌A蛋白将微悬臂梁与抗体结合
将洗净并晾干的镀有金膜的微悬臂梁(购自美国IBM公司)投入到浓度为10 mg/L的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)(购自美国Sigma公司)溶液中，37. 5。C温育 2 h，得到结合上金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁。
将上述结合上金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁用包被缓冲液清洗后投入到浓 度为10 mg/L的抗克伦特罗单克隆抗体(购自美国USBiological公司)溶液中， 37.5。C温育3 h，即将抗克伦特罗单克隆抗体修饰到微悬臂梁的金膜上。
2、 抗克伦特罗单克隆抗体与微悬臂梁金膜的结合情况检测(1) 封闭取两根上述步骤1获得的修饰有抗克伦特罗单克隆抗体的微悬臂
梁，PBS清洗后用氮气吹干，然后浸入到100uL质量百分含量为5y。的BSA溶液(用 PBS溶解)中，37。C封闭30 min;
(2) 清洗用镊子小心取出微悬臂梁，用洗涤液冲洗数次，氮气吹干；
(3) 竞争将氮气吹干后的微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中(做好标
记，抑制孔与非抑制孔)，抑制孔加入50 y L经样品稀释液(含有终浓度为0. lmol/L pH 7. 5的PBS、 0. 1%体积百分含量的吐温-20和0. 1%质量百分含量的明胶)稀释的 浓度为100 mg/L的克伦特罗溶液(购自美国Sigma公司)，非抑制孔加入50nL 样品稀释液作为对照；然后再分别加入浓度为1.0 mg/L的克伦特罗辣根过氧化物 酶联结物(购自美国Sigma公司)，37。C温育竞争30 min;
(4) 清洗用镊子小心取出上述抑制孔与非抑制孔中的微悬臂梁，用洗涤液 冲洗数次，氮气吹干；
(5) 显色将氮气吹干后的两根微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中，每 孔加入100wL显色溶液(TMB底物使用液与底物缓冲液按1: 9的体积比混匀，每 10 mL上述混合液中加入4.0 mg过氧化脲)，室温显色；
(7)终止15min后，每孔加入50w L终止液终止反应，取出微悬臂梁，450 nm波长处分别读取OD值。
实验设三次重复，结果表明，抑制孔和非抑制孔的450 nm波长下的吸光度值 分别为0. 185和1. 208，说明抗克伦特罗单克隆抗体能有效结合到微悬臂梁的SPA 金膜上。
实施例3、将抗体修饰到微悬臂梁的金膜上
1、 通过金黄色葡萄球菌A蛋白将微悬臂梁与抗体结合
将洗净并晾干的镀有金膜的微悬臂梁(购自美国IBM公司)投入到浓度为10 rag/L的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)(购自美国Sigma公司)溶液中，3(TC温育 0.5h，得到结合上金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁。
将上述结合上金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁用包被缓冲液清洗后投入到浓 度为10mg/L的抗克伦特罗单克隆抗体(购自美国USBiological公司)溶液中，30 。C温育lh，即将抗克伦特罗单克隆抗体修饰到微悬臂梁的金膜上。
2、 抗克伦特罗单克隆抗体与微悬臂梁金膜的结合情况检测
(1)封闭取两根上述步骤1获得的修饰有抗克伦特罗单克隆抗体的微悬臂梁，PBS清洗后用氮气吹干，然后浸入到100 u L质量百分含量为5%的BSA溶液(用 PBS溶解)中，37。C封闭30 min;
(2) 清洗用镊子小心取出微悬臂梁，用洗涤液冲洗数次，氮气吹干；
(3) 竞争将氮气吹干后的微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中(做好标 记，抑制孔与非抑制孔)，抑制孔加入50 " L经样品稀释液(含有终浓度为0. 1 mol/L pH 7. 5的PBS、 0. 1%体积百分含量的吐温-20和0. 1%质量百分含量的明胶)稀释的 浓度为100 mg/L的克伦特罗溶液(购自美国Sigma公司)，非抑制孔加入50uL 样品稀释液作为对照；然后再分别加入浓度为1.0 mg/L的克伦特罗辣根过氧化物 酶联结物(购自美国Sigraa公司)，37。C温育竞争30 niin;
(4) 清洗用镊子小心取出上述抑制孔与非抑制孔中的微悬臂梁，用洗涤液 冲洗数次，氮气吹干；
(5) 显色将氮气吹干后的两根微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中，每 孔加入100uL显色溶液(TMB底物使用液与底物缓冲液按1:9的体积比混匀，每 10 mL上述混合液中加入4.0 mg过氧化脲)，室温显色；
(7)终止15min后，每孔加入50y L终止液终止反应，取出微悬臂梁，450 nm波长处分别读取OD值。
实验设三次重复，结果表明，抑制孔和非抑制孔的450 nm波长下的吸光度值 分别为0. 169和1. 173，说明抗克伦特罗单克隆抗体能有效结合到微悬臂梁的SPA 金膜上。
权利要求
1、一种在微悬臂梁的金膜上修饰抗体的方法，是将带有金膜的微悬臂梁投入到金黄色葡萄球菌A蛋白溶液中，得到结合有金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁；再将所述结合有金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁投入到抗体溶液中，将抗体修饰到微悬臂梁的金膜上。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述带有金膜的微悬臂梁和所述金黄色葡萄球菌A蛋白溶液的反应条件为，30-37. 5'C反应0.5-2.0 h，优选为 37。C反应l h。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述结合有金黄色葡萄球菌A 蛋白的微悬臂梁和所述抗体的反应条件为，30-37.5°。反应1.0-3.0 h，优选为37 。C反应2 h。
4、 权利要求1-3中任一所述的方法制备的修饰有抗体的微悬臂梁。
5、 金黄色葡萄球菌A蛋白在制备修饰有抗体的微悬臂梁中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种在微悬臂梁的金膜上修饰抗体的方法。本发明所公开的在微悬臂梁的金膜上修饰抗体的方法，是将带有金膜的微悬臂梁投入到金黄色葡萄球菌A蛋白溶液中，得到结合有金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁；再将所述结合有金黄色葡萄球菌A蛋白的微悬臂梁投入到抗体溶液中，将抗体修饰到微悬臂梁的金膜上。本发明的在微悬臂梁的金膜上修饰抗体的方法与现有的方法相比具有反应步骤少、操作时间短、避免因巯基化反应对抗体活性的损失等优点，并且为所有鼠源或兔源抗体在悬臂梁上的固定提供了一种通用的方法。
文档编号C07K17/00GK101407549SQ200810227450
公开日2009年4月15日 申请日期2008年11月25日 优先权日2008年11月25日
发明者何素平, 威 刘, 南铁贵, 李召虎, 王保民, 谭伟明, 赵洪伟, 巍 高 申请人:中国农业大学