受体相关蛋白(rap)环肽的制作方法

专利名称：受体相关蛋白(rap)环肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及低密度脂蛋白受体相关蛋白(RAP)环肽，包括其类似物，其组合物，以 及制备和使用此RAP环肽的方法。
背景技术：
受体相关蛋白(RAP)，也称为a 2_巨球蛋白/低密度脂蛋白受体相关蛋白相关蛋 白1 (Uniprot数据库中编号为P30533，Pfam中编号PF06400和PF06401)，是一种独特的 39KD的蛋白，其几乎与低密度脂蛋白受体(LDLR)的所有家族成员结合。其位于内质网和 高尔基体(Bu andSchwartz, Trends Cell. Biol. 8(7) :272_6，1998)，RAP 起这些家族成员 的伴侣的作用。例如，在这些间隔中RAP紧密结合LRP，防止受体和共表达的配体过早结合 (Herz and ffillnow, Atherosclerosis 118 Suppl :S37_41,1995)。全长的人RAP包括其信号序列有357个氨基酸。成熟的RAP含有323个氨基酸， 其中后四个氨基酸(HNEL)组成了一个内质网滞留信号。已有报道，RAP由三个同源性较低 的结构域组成(dl、d2和d3)。所有这三个结构域都能够结合LRP，尽管d3以较高的亲和 力结合。不同的出版物对RAP的三个结构域的分界的报道稍有不同(氨基酸残基1-100， 101-200和201-323，或18-112，113-218和219-323)，这些结构域在结合特性方面表现出略 有不同。例如，据报道dl抑制0 2-巨球蛋白与1^ 的结合，而(13则被报道促进1^ 的正 确折叠(见 Obermoeller 等人，J. Biol. Chem. 272(16) :10761_100768 (1997))。Medved 等 人，J.Biol.Chem.，274(2) :717_727 (1999)报道了另一种四结构域的划分方式(残基1-92， 93-163，164-216 和 217-323)。RAP的截短和/或突变形式已有研究。Melman等人，J.Biol.. Chem.，276 (31) 29338-29346 (2001)报道了一些GST/RAP片段融合的制备方法，包括成熟RAP残基 221-323，221-275，276-323，221-290，221-300 和 221-310，这些全部显示出与 LRP 结合时 没有或低的亲和力。从这些数据中，Melman等得出结论，残基201-210对于以高亲和力 结合LRP是必需的。Melman等人还制备了 RAP突变体，该突变体含有203-206 (A位点)， 282-289 (B位点)和314-319 (C位点)的突变；单独A位点突变或单独B位点突变对LRP结 合活性的降低较小。然而A位点和B位点同时突变显著地降低LRP结合活性。Medved等 人，同上，制备了两种GST/RAP C末端片段融合，其中一个含有成熟RAP残基216-323，另一 个含有残基 206-323。Rail 等人，J. Biol. Chem.，273 (37) :24152_24157 (1998)报道了将成 熟RAP蛋白水解为多种片段并鉴定作为高度蛋白酶抵抗部分的残基223-323。Obermoeller 等人，同上，也制备了含有成熟RAP残基191-323的RAP片段，并研究了与不同LRP结构域 的结合相互作用。McCormick 等人，Biochemistry, 44 5794-803 (2005)构建了含有 RAP 的 221-323残基的GSP/RAP片段融合，并评价了其与内质网分子伴侣ERp57的结合。Andersen等人，Biochemistry 42,9355-64(2003)测试了 RAP结构域片段与apoE受体2的结合， 并报道只有第三结构域(残基216-323)与之结合。Andersen等人，J Biol Chem 275， 21017-24(2000)测试了 RAP d3 (残基216-323)与各种LRP片段结合的情况。Andersen等 人，Biochemistry 40,15408-17(2001)同样测试了 RAP d3变体，将C末端截短形成残基 219-309，以便能够与融合到泛素(U-CR56)的LRP片段结合，并观察到与U-CR56结合力显 著下降。Lee等人Mol Cell 22，423-30 (2006)构建了全长RAP的突变体，在这些突变体中 将每个保守组氨酸突变为丙氨酸，结构域1中所有组氨酸突变为丙氨酸，结构域2中所有组 氨酸突变为丙氨酸，结构域3中所有组氨酸突变为丙氨酸。Migliorini等人，J BiolChem 278,17986-92(2003)构建了含有在RAP的残基206-323中随机突变的克隆的库，并报道 RAP256位置的赖氨酸突变或270位置的赖氨酸突变后RAP不能够与LRP结合。脂蛋白受体相关蛋白(LRP)受体家族包括一组细胞表面和跨膜蛋白，这些蛋白介 导了多种生理现象。所有这些受体与LDLR相似，并具有相似的结构域组成，包括LDL受体 A类结构域组，或补充型重复序列(CR)，这是保守蛋白序列大家族的部分。这些家族成员的 结构数据显示CR序列采用了典型的折叠，LDL受体样模块(蛋白构造分级，SC0P，术语学)。CR 序列在多种不同类型的蛋白中均被发现，包括LDLR家族和II型跨膜丝氨酸蛋白酶 (matriptase)家方矣。LRP家族成员的作用机理包括结合配体的内吞作用和从细胞外间隙的信号转导 (1)。LRP参与多种细胞功能，包括但不限于脂蛋白的代谢(2，3)，基质蛋白酶和凝结因子调 控(4-6)，细胞命运(3，7)的决定，神经细胞迁移引导(3，7)，肿瘤细胞增殖诱导，鼻病毒结 合(11，12)，通过神经递质的信号传导，通过抗原呈递细胞的抗原获取，配体通过血脑屏障 转胞吞(16-19)，肾小球滤过液中蛋白质回收(20)，内分泌激素运输(21)，从脑中淀粉 样蛋白流出(22)，骨沉积激活(23)和内皮细胞增殖调节(24)。LDLR起多种作用的能力部 分源于这些受体能够结合的不同组的配体。此受体家族的另一特性就是每一个LDLR上的 多种和唯一的组织分布模式。II型跨膜丝氨酸蛋白酶家族包括corin和matriptases ST14, matriptase-2和 matriptase-3。Matriptase (MT-SP1、ST14、TADG-15)在多种上皮肿瘤(癌)中过度表达 (25-33)。肝细胞激活物抑制因子l(HAI-l)引起的反式激活后，matriptase通过直接降解 细胞外基质成分，或通过激活其他蛋白酶(如，尿激酶血浆酶原激活剂(uPA))，致使基质降 解(26，34，35)，来促进肿瘤的生长和代谢。除LDLR和matriptase家族外，还包括多种具有 CR结构域的其他蛋白。一种这样的蛋白，FDC-8D6抗原(⑶320)，具有一对这样的结构域并 在淋巴滤泡中的B细胞分化中起重要作用(36，37)。含有CR的蛋白在病理生理过程中起重要作用，以及其家族的一些成员独特的组 织分布图形，使得这些蛋白成为有用的药物靶标。蛋白选择性药物可直接影响目标蛋白的 功能，从而减少蛋白在具体疾病状态下的支持效果。或者，所述药物可利用目标蛋白的组织 分布的优点有效传递其他治疗分子至受疾病影响的具体组织。尽管相当多的证据证明了含 CR蛋白在哺乳动物生理及病理生理中的重要性，也有一些选择性作用于LDLR或含CR蛋白 家族具体成员的药物的实例。构建结合这些家族具体成员的分子的能力为开发此类药物提 供了手段。
例如，W0 2006/138343 (Zankel等人)报道的数据显示⑶NF与RAP融合(穿过血 脑屏障)后产生缀合物，该缀合物保留了 GDNF 二硫键连接的同型二聚体结构。RAP-GDNF缀 合物以与GDNF相同的亲和力(Kd)结合并激活GDNF受体(GFR a-1)，在培养的PC12细胞中 用RAP-GDNF诱导神经突起生长证明其在体外保留有生物活性。假设含有CR的蛋白普遍参与整个哺乳动物生理过程，那么就需要保留RAP原始结 合特性的RAP片段和变体，或具有针对具体含有CR的蛋白提高的结合选择性的RAP片段和 变体，并且显示出其他期望的特性，如，改善的稳定性或易生产和制备的特性。发明综述补充型重复序列(CR)是保守蛋白序列的大家族，其采用特征性折叠。含有CR的 蛋白包括LDL受体家族成员，II型跨膜丝氨酸蛋白酶(matriptase)家族成员和其他蛋白， 如FDC-8D6抗原(⑶320)。受体关联蛋白(RAP)与很多这些含有CR的蛋白以高亲和力结 合。成熟RAP的323氨基酸序列如SEQ ID NO :95所示，成熟RAP结构域3的氨基酸序列 (201-323氨基酸)，长度为123个氨基酸，如SEQ ID N0:96阐明。氨基酸243-313如SEQ ID NO 97 阐明。RAP249-303 氨基酸如 SEQ ID NO 98 阐明。本发明提供了以高亲和力与含有CR的蛋白结合的RAP环肽(包括类似物或衍生 物)，以及含有该环肽的缀合物和组合物，以及这些多肽的治疗和诊断用途，如，作为这些含 有CR蛋白的抑制剂或增强剂，或诊断剂或治疗剂到表达这些含有CR蛋白的组织的靶向传 递。所述RAP环肽可显示出预期的特性，如改善的亲和力，提高的对含CR蛋白的结合选择 性，改善的稳定性和/或易生产性。本发明的RAP环肽基于成熟RAP的氨基酸序列，优选结构域3，优选少于123个氨 基酸的长度，并在两个非连续氨基酸之间包含共价键。在一些实施方式中，该共价键稳定 RAP肽的三维结构。在一些实施方式中，该共价键提供改善的结合亲和力以使RAP环肽与含 CR的蛋白以约lxl(T8M或更少Kd (更少意味着更好的亲和力)的结合。这种结合的亲和力 可通过本领域任何已知方法测定，如，放射性免疫测定，ELISA，基于技术(如，Biacore)分 析的表面等离子共振(SPR)，或动力排斥试验(如，KinExA)。亲和力数据可进行分析，如，通 过Scatchard等人，Ann N. Y. Acad. Sci. ,51 =660(1949)中所述的方法。在示范性实施方式 中，对CR蛋白的结合亲和力大约在lxlO-9，10,，10-11，10_12，10_13，10_14M或更少。本发明提供 不同大小的RAP环肽，包括长度约103，约99，约95，约90，约85，约82，约80，约78，约76， 75，74，73，72，71，70，69，68，67，66，65，64，63，62，61，60，59，58，57 或 56 个氨基酸或更短的 氨基酸。在一些实施方式中，该共价键在氨基酸之间形成，它们分别为约76，75，74，73，72， 71，70，69，68，67，66，65，64，63，62，61，60，59，58，57 或 56 个氨基酸。本发明的RAP环肽可包含基于成熟的人的RAP序列(SEQ ID NO 95)的氨基酸序 列。在一实施方式中，RAP环肽的氨基酸序列至少缺失了成熟RAP N末端200到243个氨 基酸。因此，RAP 环肽可缺失成熟 RAP 的 1-200，1-220，1-225，1-230，1-235，1-240，1-241， 1-242，1-243氨基酸，或1-244，1-245，1-246，1-247，或1-248氨基酸。在一相关实施方式 中，所述RAP肽的氨基酸序列进一步缺失成熟RAP C末端至少4到11个氨基酸。因此， 所述 RAP 环肽可缺失成熟 RAP 的 314-323 或 313-323，或者 304-323，305-323，306-323， 307-323，308-323，309-323，310-323，311-323，或 312-323 氨基酸。在另一实施方式中，所 述RAP肽氨基酸序列含有成熟RAP的一段连续部分，该RAP (a)至少有71氨基酸长度，以及(b)包含氨基酸256-270。在一相关实施方式中，所述RAP肽氨基酸序列含有成熟RAP 结构域3的一段连续部分，该RAP结构域3 (a)至少有71氨基酸长度，以及(b)包含氨基 酸256-270。RAP示范性部分可形成RAP环肽的基础，其包括成熟RAP (SEQ ID NO 95)的氨 基酸 200-323，221-323，200-319，221-319，243-319，244-319，249-319，200-313，221-313， 243-313，244-313，249-313，200-303，221-303，243-303，244-303，246-311，246-313 或 249-303。如此处描述，可制备RAP环肽，其显示出对含CR蛋白的亲和力和选择性与天 然的RAP相似(如，与天然RAP约5倍或者更少不同)。也可制备RAP环肽，其与天然 RAP相比，显示对一个或多个含CR蛋白的改善的亲和力和/或变化的选择性。在一实 施方式中，所述RAP环肽显示对含CR的蛋白至少1.5-倍，2-倍，2. 5-倍，3-倍，4-倍， 5-倍，7-倍，10-倍或20-倍提高的亲和力(相对于天然RAP)和/或改善的结合选择性， 所述含CR 的蛋白选自:LDLR(P01130), LRP1 (P98157)，LRP1B (Q9NZR2)，LRP2 (P98164)， LRP3 (075074)，LRP4 (075096)，LRP5 (075197)，LRP6 (075581)，LRP8 (Q14114)，选蛋白-相关 受体，SorLA(Q92673)，LRP10 (Q7Z4F1)，LRP11 (Q86VZ4)，LRP12 (Q9Y561)，FDC-8D6 (CD320)， VLDLR(P98155)，TADG-15 (ST14, Q8WVC1)，TMPS3 (P57727)，TMPS4 (Q9NRS4)，TMPS6 (Q8IU80)， Q61CC2，Q6PJ72,Q76B61，Q7RTY8，Q7Z7K9，Q86YD5，Q8NAN7，Q8NBJ0，Q8WW88，Q96NT6，Q9BYE1， Q9BYE2，Q9NPF0和corin(Q8IZR7)。这一结合选择性是可估算的，如，通过所述肽对具体含 CR蛋白的结合亲和力与所述肽对至少一种其他含CR蛋白的结合亲和力的比率。所述肽可 显示出相对于1，2，3，4，5，6，7或8个其他含CR蛋白的对含CR蛋白的结合亲和力。本发明的RAP环肽可由天然的RAP序列构成或包含这些天然序列的突变体。在 示范性实施方式中，本发明的RAP环肽包含与SEQ ID N0:97或SEQ ID N0:98至少60%， 65%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%相 同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述RAP环肽少于约85个氨基酸的长度，包含50个 连续的氨基酸，这些氨基酸与SEQ ID N0:98至少70%相同，并以约1x10-8M或更少的结合亲 和力Kd与含CR蛋白相结合。在一些实施方式中，所述RAP环肽包含选自成熟RAP氨基酸 200-319，300-319或247-257中区域内任何一个的1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多位 置的突变。在示范的实施方式中，所述RAP环肽包含选自成熟RAP (SEQ ID NO 95)氨基酸 175，205，213，217，226，230，232，239，241，242，246，247，249，250，251，256，257，261，266， 267，268，270，273，279，280，287，290，294，296，297，298，305，308，311，312，313，314 或 315 的1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多位置的突变。在其他实施方式中，所述RAP环肽包 含在 205，217，249，251，256，257，266，270，294，296，297，305 位置中的三个或更多的突变。 在一个实施方式中，所述RAP环肽包含成熟RAP的251，256和270位置的至少一个突变。在一方面，所述RAP环肽选择性结合matriptase蛋白。可以预见的是matriptase 特异性的肽可含有成熟RAP(SEQ ID NO 95)的氨基酸243-313或249-303，并且进一步含 有成熟RAP在位置251，256，257，266，270或280中的任意一位置的突变。进一步可以预见 matriptase特异性的RAP肽含有成熟RAP在位置251，256，257，266，270和/或280中至少 1个、2个、3个、4个、5个或6个突变。在另一方面，所述RAP环肽选择性结合VLDLR蛋白。可以预见的是VLDLR特异性 肽可包含成熟RAP (SEQ ID NO :95)的氨基酸243-313或249-303，并进一步包含在RAP的位置251，256，270或296中的任何一位置的突变。进一步可以预见，VLDLR特异的RAP肽 含有在成熟RAP的位置251，256，270和/或296中至少一个，两个，三个，或四个突变。在更进一步方面，所述RAP环肽选择性结合FDC_8D6(⑶320)蛋白。可以预见， FDC-8D6特异性肽可含有成熟RAP(SEQ ID NO 95)的氨基酸243-313或249-303，和进一步 含有在RAP的位置251，256，270，279或305中任一位置的突变。进一步可预见，FDC-8D6特 异性肽含有在成熟RAP的位置251，256，270，279和/或305中至少一个、两个、三个、四个 或五个突变。任何前述突变可包括用碱性氨基酸(K，R)置换酸性氨基酸(D，E)，或者相反置换。 任何前述突变也可包括用组(F，Y，W，H)置换选自组(A，C，D，E，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T， V)的氨基酸。在进一步实施方式中，与成熟RAP (SEQ ID NO: 95)相比，所述RAP环肽包括下 述突变的三个、四个、五个、六个或更多的突变V175L，R205S, S213T，E217K，L226M，H249Y， E230V, S232P, E239G, E246G, E251L, E251K, E251T, E251G, E251P, E251N, E251R, K256R, K256V, K256A, K256I, K256P, K256L, I266F, I266T, K257Y, Q261R, A267V, H268R, K270P, K270D, K270N, K270G, K270E, K270W, L271M, H273Y, D279Y, V283M, R287H, H290Y, H290L, E294V, R296L, T297I, K298R, K305T, K306M, S312F, G313D, E246C, L247G, G280A, L311A, S312C, Q309C, F250C, L308G, L311G, E241C 和 I315C。在前述任何一个实施方式中，所述RAP肽可含有所述肽的N末端或靠近其N末端 的半胱氨酸和所述肽的C末端或靠近C末端的半胱氨酸，通过两个半胱氨酸之间的二硫键 形成使所述肽环化并稳定a螺旋。任选地，甘氨酸或脯氨酸可插入半胱氨酸和a螺旋之 间(如，N末端Cys-Gly和C末端Gly-Cys)。甘氨酸的引入使a螺旋中断，形成邻近的非 天然的内部螺旋的二硫键。本发明也涵盖了至少2、3、4、5或6个本发明的RAP环肽的寡聚体组合或阵列。这 些阵列可是同样RAP环肽的重复阵列或不同RAP环肽的阵列。多种组合可以是邻近的或者 被肽连接子(如，1，2，3，4或5个氨基酸长度)分开，其展示每一个RAP环肽的三维机构，使 得这些结构域能够与相同的含CR的蛋白的不同CR对结合，或与不同的含CR的蛋白的CR
对结合。在另一方面，本发明提供包含RAP环肽(或RAP环肽阵列)与诊断或治疗剂缀合 的缀合物。在一个实施方式中，所述多肽和诊断或治疗剂通过连接子连接。在进一步的实 施方式中，所述的连接子是肽连接子。在另一实施方式中，含有本发明多肽的缀合物为体内 转胞吞。在示范实施方式中，连接本发明多肽的治疗剂选自胶质细胞源性神经生长因子 (⑶NF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、或者本领域内已知的其他神经 生长因子、解联蛋白和金属蛋白酶结构域10 [人]ADAM10、或其他作用于APP或Abeta的蛋 白酶、MESD( —种将受体转运到细胞表面所需的LRP5/6伴侣蛋白)、癌症化疗制剂、蛋白酶 抑制剂、促凋亡分子、自身免疫剂、溶酶体酶。在一相关实施方式中，含有所述RAP环肽(或 RAP环肽阵列)的缀合物与一活化剂缀合。在进一步实施方式中，所述活化剂是化疗剂。在 更进一步实施方式中，所述化疗剂是放射性同位素。在又一方面，本发明预期递送诊断或治疗剂到个体具体组织的方法，其主要通过 给所述个体施用含有所述试剂和本发明的RAP环肽(或其阵列)的缀合物。在一实施方 式中，与RAP环肽缀合的诊断或治疗剂通过转胞吞跨过上皮或内皮屏障，递送到具体组织。在一实方式中，所述试剂被递送穿过血脑屏障。在一相关实施方式中，所述个体患有神经 疾病，其包括但不限于，阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、其他脱髓 鞘疾病、中枢神经系统癌症、创伤性脑损伤、脊髓损伤、中风或脑缺血、斑样硬化、脑脉管炎、 癫痫症、亨廷顿病、图雷特综合征、吉-巴综合征、威尔逊病、皮克病、神经炎性疾病、脑炎、 脑脊髓炎或病毒性、真菌或细菌性脑膜炎或其他中枢神经系统感染、朊蛋白(prion)疾病、 小脑共济失调、小脑变性、脊髓小脑变性综合征、弗里德赖希共济失调、毛细血管扩张性共 济失调、脊髓肌萎缩、进行性核上麻痹、肌张力异常、肌肉强直、震颤、视网膜色素变性、老年 痴呆、皮层下痴呆、动脉硬化痴呆、AIDS关联痴呆或其他痴呆、纹状体黑质变性、线粒体脑 肌病、神经元蜡样质脂褐质症、中枢神经系统引起的溶酶体贮积紊乱、脑白质营养不良、尿 素循环缺陷疾病、肝性脑病、肾性脑病、代谢性脑病、吓啉病、神经毒性物质中毒、放射诱导 的脑损伤、或精神疾病，如，精神异常、焦虑、抑郁、注意力分散、记忆障碍、认知障碍、食欲障 碍、肥胖、成瘾、倾向或药物依赖。本发明进一步提供递送治疗蛋白到个体特异组织中的细 胞溶酶体间隔的方法，其包括使所述细胞接触有效量的含有与本发明RAP环肽缀合的所述 治疗蛋白的缀合物。在一实施方式中，所述个体患有溶酶贮积症(LSD)。在另一实施方式中，本发明预期治疗癌症或转移性肿瘤的方法，或与含CR的蛋白 联合降低致瘤或转移影响的方法。这些方法包括给予个体与含有CR的致瘤蛋白的RAP环 肽(或其阵列)选择性结合，或给予含有与所述RAP环肽(或其阵列)缀合的癌症治疗 剂的缀合物。这些含CR的致瘤蛋白包括但不限于LRP5、LRP6、任何一个matriptases或 FDC-8D6抗原。本发明的RAP环肽可通过与含CR的靶蛋白结合直接干扰其功能，从而减少 致瘤效果，如，通过阻断结合或活化位点。或者，包含与癌症治疗剂缀合的本发明的RAP环 肽的缀合物，可通过抗肿瘤药药物用于过量表达这些含CR蛋白的靶组织。例如，过量表达 matriptase的组织包括癌组织，如，卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌或胃 癌。在另一实施方式中，本发明预期递送治疗剂到达肝脏以治疗肝脏疾病(包括肝炎 或肝癌)的方法。这些方法包括给个体施用缀合物，该缀合物含有与RAP环肽(或其阵列) 缀合的治疗剂，该RAP环肽保持了天然RAP结合特性或对LRP1以甚至更高的亲和力选择性 结合。在一些实施方式中，所述方法还包括递送化疗/细胞毒性试剂到肝脏以治疗肝癌或 其他肝脏疾病。在另一实施方式中，本发明预期治疗骨质疏松或其他伴有造骨细胞活性减少和/ 或破骨细胞活性增加的疾病，该方法包括施用RAP环肽或含有与RAP环肽缀合的活化剂的 缀合物，其特异性的结合到LRP5，因此抑制抗造骨细胞分化和骨沉积的因子，并促进破骨细 胞活性。这种治疗方法预期用于增加成骨细胞和/或减少破骨的活性，从而进一步减少骨 的流失或增强骨的强度。在一相关方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含一种含有与诊断 剂或治疗剂缀合的RAP环肽的缀合物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另一不同方面，本发明提供一种与可检测的部分或标记缀合的RAP环肽。所述 RAP环肽具有对特殊的含CR蛋白的结合选择性，RAP环肽可用于检测此类含CR蛋白的存 在。它同样可用于检测含CR蛋白的表达模式，包括如，与致瘤相关的过量表达。本发明进 一步提供使用该RAP环肽来诊断含CR蛋白过量表达或表达不足相关的疾病。
在其他方面，本发明介绍一种制备RAP肽的方法，通过合成或重组方式，这一方式 可自然环化或能够通过共价连接进一步化学修饰而环化。本发明提供编码任意一种上述 RAP环肽的核酸、含有该核酸的载体、含有上述核酸或载体的宿主细胞，以及制备该多肽的 方法，该方法包括在适宜的培养基中培养所述宿主细胞以及从所述宿主细胞或培养基中分 离该肽。本发明的其他特征和优势将在以下详细描述中显示出来。然而应该理解，因为通 过详细的描述，在本发明精神和范围内的不同的变型和改型对于本领域技术人员而言是显 而易见的，尽管本发明仅仅通过示例的方式描述了详细的说明书和具体实施例，以及本发 明优选实施例。


图1是对补充型重复序列的代表性说明，其基于低密度脂蛋白受体相关蛋白1的 第七个重复序列的序列(LRP1 CR7，PDB 1J8E)，如Simonovic等人(43)所测定的，该图显 示了标记为A，B, C，D位置形成的钙结合环的表面，球形代表钙。图2显示了为结合分析所选的CR序列对比以及RAP突变体或CR抗体选择。在左 侧用括号标出具体序列对和三联体。。筛选底物(LRP2 CR89)用红色(较浅的颜色)括号 指示。对比中的AxcBxCxD基序(motif)以每一个CR序列加下划线的位置A和C来表示。 每一对CR的A、C、A’和C’氨基酸串联文字串在右侧指示。带底纹的氨基酸与对比位置中 突出的氨基酸相同；粗体的氨基酸与对比位置中突出的氨基酸同源。序列对比Clustal ff 格式(44)并用B0XSHADE来形成。图3显示了 CR蛋白质的SDS-PAGE分析。在有2mM DTT或缺少2mM DTT的SDS 上样缓冲液中纯化的再折叠蛋白变性。如方法中所述，处理后的样品溶解在12% NuPAGE Bis-Tris凝胶中。胶用考马斯亮蓝染色。每一对泳道在底部用相关检测的CR蛋白标注， 并标注了分子量标记的大小。已经显示了典型的结果。缩写L1是LRP1 ;L2是LRP2 ;L6 是 LRP6 ；M 是 MAT (matriptase, ST14) ；V 是 VLDLR ；YVWR = LRP2 CR89 ；YVWD = LRP2 CR89 R1088D ；YDWR = LRP2 CR89 V1047D ；YDWD = LRP2 CR89 V1047D R1088D ；WVWR = LRP2 CR89 Y1042W ；WDWR = LRP2 CR89 Y1042W V1047D ；WVWD = LRP2 CR89 Y1042W R1088D ；WDWD = LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D。图4显示了用制备的100-1. 25nM稀释系列的RAP3与经选择的CR蛋白的结合。图 5A-B 显示 RAP d3、MegaRAPl d3 (RAPv2A d3)和中间序列的变体与 LRP2 CR89 和LRP1 CR3-5的结合。图5A显示了 RAP d3突变体和RAPv2A d3回复体与LRP2 CR89的结 合情况。图5B显示了 RAP d3突变体和RAPv2A d3回复体与LRP1 CR3-5的结合情况。对 数据作图并使之适应在假设的单个结合点呈非线性回归GraphPad Prism)。Kd值和标准差 通过回归分析得出。表2 显示了 RAP d3 和 RAP v2 (RAP v2A)变体与 LRP1 CR3-5 和 LRP2 CR89 的结合 情况。NF显示出结合不能测定或者说所述数据用通过假设单个结合点形成的非线性回归并 不能可靠地适合。最大的结合百分比是每一个配体的最高测试浓度的0D值和在此浓度下 测得的所有这些配体的最高0D的比值。图6显示了 MegaRAPl d3和RAP d3与LRP2 CR89变体的结合情况。图中所用到的缩写LRP2 CR89 Y1042ff(WVWR) ,LRP2 CR89V1047D (YDWR), LRP2 CR89 R1088D (YVWD), LRP2 CR89 V1047DR1088D(YDWD), LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D(WDWD), LRP2CR89 Y1042W V1047D(WDWR), LRP2 CR89 Y1042W R1088D(WVWD) 表3显示了 RAP d3和RAPv2A d3与LRP2 CR89变体结合的情况。NF显示出结合 不能测定或者说该数据用通过假设单个结合点形成的非线性回归并不可靠地适合。最大的 结合百分比是每一个配体的最高测试浓度的0D值和在此浓度下所有这些配体的最高0D的 比值。表4显示了在不同的CR对中，通过筛选突变噬菌体库分离的RAP d3变体序列。 只显示了可变的位置。氨基酸编号对应成熟RAP。变体名字(d3)，用于亲和力选择的CR对 (CR)，变体与靶CR对(当测定时)间的表现解离常数(Kd)和可变位置氨基酸的同一性均 显示在表4。图 7 显示了 RAP d3 变体与 CR 对结合的情况。RAP d3, MegaRAPl d3, VRAP2 d3, MatRAPl d3 和 MatRAP2 d3 分别与 LRP1 CR3-5，LRP6 CR12, LRP6 CR23, LRP6 CR1-3，LRP2 CR89，LRP2 CR2728，LRP2 CR3031，LRP2 CR3435，LRP2 CR34-36,VLDLR CR78,VLDLR CR6-8， MAT CR12,MAT CR23和MAT CR34在80nM浓度下孵育。重复检测两次样品，将数值叠加。然 后计算出平均值和标准差。没有配体孔的空白值用来校正吸光值。任何情况下的方差系数 没有超过20% (平均为6%)并在此没有显示。图8显示了在此分离的RAP d3变体的全部氨基酸序列。图9显示了 MatRAPl变体N末端和C末端截短后在结合亲和力上的阳性效应。用 所述全长变体的制备方法制备截短变体。图10显示了 320RAP1和对应截短变体与FDC-8D6抗原来源的靶CR的结合情况。图11A和图11B分别显示了 RAP肽与rhLRPl簇2以及与rmVLDLR胞外结构域的
相对结合情况。图12显示了毒素缀合的mRAPc对在表达LRP的CH0细胞和LRP缺失的CH0细胞 的细胞生存力的影响。图13A、13B和13C显示了 RAP环肽，Ifeptide与不同细胞毒性试剂缀合后的化学结构。图14A、14B和14C显示了通过与链霉抗生物素缀合的mRAPc肽和mRAP抑制RAP 和uPA-PAI-1与LRP1受体结合的情况。图15显示了动物静脉给予RAP环肽后的生物分布情况。发明详述RAP是功能性双配位基，具有与LDLR内的补充性重复序列的具体串联对以低纳摩 尔亲和力结合的第一和第三结构域(dl和d3)。结构域3由约110个氨基酸组成，与相关的 CR对显示出最高的亲和力。为了使免疫原性最小化，使生产效果最大化，同时改进性能，最 小化RAP至那些直接参与受体结合的序列是有用的。然而，d3的稳定折叠显示出需要RAP 内不直接参与形成受体接触表面的序列。因此，这些发现在d3的N末端和d2的C末端的 额外序列对保证稳定的折叠和受体结合的高亲和力是必需的。分离的d3并不像上下文中 的全长RAP的d3—样与受体紧密结合。d3的截短形式缺少稳定折叠的序列，其同样与受体 的结合很低。来自RAP d3和LDLRCR34复合体的结构数据揭示RAP d3受体结合序列被发
12现位于通过可变形环连接的大约相同长度的两个反向平行的a螺旋之间。这一对双螺旋 集合有着显著的逆时针扭转和类似于延伸的扭转“U”。本发明提供RAPd3的基本上截短形式，该RAPd3通过一个分子内共价键来稳定， 如，二硫键。没有分子内共价键的截短的非环化形式对LRP1的结合亲和力下降。相反，环 RAP肽则与那些全长的RAPd3相比具有改良的受体结合亲和力。通过一个非天然的共价键 而不是天然RAP内的大的肽区域来稳定RAP d3片段内的三维螺旋结构的能力，提供了改善 的亲和力并由此产生很多优势。本发明能够快速生产小分子RAP肽，如，通过固体肽合成， 无需重组生物体，能够尽可能地减少免疫原性，并更易于与活化剂缀合。基于靶受体两个一般特性，本发明的环RAP肽具有潜在的药学应用首先，一些受 体在疾病状态的稳定和发展中起作用。因此，与这些受体选择性结合的药剂可用于改变这 些受体所支持的活动和病理效应。第二，一些受体具有独特的组织分布。因此，选择性结合 这些受体的药剂可用于选择性运载其他药物到靶受体突出表达的那些组织。本发明也涵盖 了本发明所述的组合物在预防、处理和治疗疾病中的用途，其包括但不限于细胞增殖性疾 病，如，肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、激素异常性疾病、退行性疾病、老化病、中枢神 经系统疾病(如，阿尔茨海默病、癫痫症、高血脂)、精神疾病或病变(如，精神分裂症、情绪 紊乱如，抑郁和焦虑)、传染性疾病、自身免疫疾病、酶缺乏疾病、如之前所述的那些溶酶体 贮积症等等。LDLR家族成员在中枢神经系统细胞类型包括神经元和星形胶质细胞的毛细血管 内皮表达较多(如，LDL受体、巨蛋白、LRP1)。LDL受体家族内吞结合的配体，并证明在肾、 甲状腺跨极化的上皮细胞转胞吞配体，以及在脑的跨毛细血管内皮细胞转胞吞配体。所以， LDLR含有一个在组成和功能相关的受体池，该受体在不同组织以不同水平表达。例子包 括VLDLR在肌肉组织上的表达，LRP1B在神经组织上的表达，巨蛋白在肾脏和神经组织的表 达，以及LRP1在肝脏和血管平滑肌组织的表达。本发明的RAP环肽可用于靶向这些受体的 任何一个，也可用于靶向所述的表达其他含CR蛋白的组织。在更全面的实施方式中，本发明的受体选择性的RAP环肽，以单独、阵列或与治疗 剂缀合的方式，构建了一种特定性调节含CR蛋白质的方法(活化或抑制)。至少有四种影 响调节的机制通过RAP环肽与配体结合位点直接结合竞争性阻断配体结合；通过RAP环 肽诱导配体结合位点变构变化来非竞争性阻断配体结合；通过RAP环肽结合诱导相同或不 同受体间交联，来清除细胞表面的受体或其他含CR的蛋白；或者选择性的递送结合了经选 择的RAP环肽的活化剂到组织(如，蛋白酶、蛋白酶抑制剂、其他酶、放射性同位素、促凋亡 剂、毒素、治疗性分子(药物)、其他受体结合部分等等)。A 定义除非另有定义，本发明所用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域技术人 员通常理解相同的意义。以下参考给本领域技术人员提供了本发明所用的很多术语的通常 定义Jingleton，等人，微生物学和分子生物学字典(1994年第二版)，剑桥科技字典(1988 年 Walker 编辑)，遗传学术语表 R. Rieger 等人(编辑),Springer Verlag (1991), Hale 和 Marham, THEHARPER COLLINS 生物字典(1991)。每一出版物、专利申请、专利和其他本文引用的参考文献均以参考方式将其全文 并入本申请，其并入的程度与本发明的公开一致。
应当注意的是本说明书以及附加的权利要求书中使用的“一”、“一个”和“所述”包
括其复数意义，除非上下文中有明确规定。本申请所使用的如下术语具有归属于它们的意义，除非另外详细说明。本申请所使用的术语“RAP环肽”表示少于100氨基酸长度，与SEQ IDN0 :98(氨 基酸249-303)至少80%，85%，90%，95%，97%，98%，99%或更多相同或相似的多肽，并 且含有在两个非连续氨基酸之间形成的共价键。在示范的实施方式中，所述共价键是两个 半胱氨酸间形成的二硫键。"RAP缀合物”或“缀合物”指含有附着在活化剂上的本发明RAP环肽的化合物。正 如本发明所使用的，所述术语“缀合物”意指治疗剂和RAP环肽以通过如共价化学键的物理 作用(如范德华力或氢相互作用、包囊作用、包埋或其结合)物理连接起来。本发明使用的术语“突变”指肽序列中的氨基酸插入、删除或替代。相对于天然或 野生型氨基酸序列具有一个或多个突变的肽被认为是类似物。术语“衍生物”指经共价修饰的肽，如，通过与治疗性或诊断性制剂缀合、结合标 记物(如，使用放射性核素或各种酶)、共价聚合物连接如，乙二醇化(由聚乙二醇衍化而 来)，以及通过用化学合成的非天然氨基酸插入或替代的方式。本发明的衍生物将保留本发 明非衍生化的分子的结合特性。用癌症靶向抗体与细胞毒性试剂缀合(如，放射性同位素 (如，1131、1125、Y90和Rel86)，化疗剂，或毒素)可提高对癌症细胞的破坏性。“补充重复序列”或“CR”，也称为低密度脂蛋白受体A类结构域(LDL-A，Pfam)，除 了其他特性外，其是由六个半胱氨酸和一簇酸性氨基酸来定义的蛋白质结构域家族的成员 之一。业已发现，很多补充重复序列折叠成一个确定的结构，术语称LDL受体样单元(蛋白 结构分类，SCOP)。CR结构域构成很多受体的配体结合决定簇，包括那些属于LDLR的受体。 每一个CR的氨基酸线形序列具有基序AxcBxCxD，其中c是保守的半胱氨酸，x是任何一个 氨基酸，B和D是天冬氨酸、谷氨酸或天冬酰胺，业已证明其参与钙的结合和配体的结合。具 体CR结构域的直接邻近对已显示与RAP结合。业已证明在结合RAP的CR对的两个CR结 构域上的位置A和C的氨基酸(A、C、A’和C’ )参与RAP结合。“含有CR的蛋白”是指含有一个或多个CR的蛋白。含CR蛋白的非限制性例 子包括LDLR(P01130)，LRP1(P98157), LRP1B (Q9NZR2)，LRP2 (P98164)，LRP3 (075074)， LRP4 (075096)，LRP5 (075197)，LRP6 (075581)，LRP8(Q14114)，选蛋白相关受体， SorLA(Q92673)， LRP10(Q7Z4F1)， LRP11(Q86VZ4), LRP12(Q9Y561)， FDC-8D6(CD320)， VLDLR(P98155), TADG-15(ST14/matriptase/MT-SPl，Q8WVC1), TMPS3 (P57727)， TMPS4(Q9NRS4)，TMPS6(Q8IU80)，Q6ICC2,Q6PJ72,Q76B61,Q7RTY8,Q7Z7K9,Q86YD5,Q8NAN7, Q8NBJ0, Q8WW88, Q96NT6, Q9BYE1, Q9BYE2, Q9NPF0 和 corin (Q8IZR7)。Uniprot 数据库提供 有关这些蛋白的每一个的索引编码。结合亲和力Kd通过本领域已知方法测定。“选择性""结合选择性""选择性结合”指配体与不同受体间不同的亲和力。如果配 体结合受体的亲和力比其他受体高至少3倍，那么配体对该具体受体是有选择性的。例如， RAP以几乎相同的亲和力与LRP1，LRP1B, LRP2, SorLA, apoER2和VLDLR结合，因此，RAP对 这些受体之一相对于另一个没有选择型。然而，RAP牢固地结合LRP1，LRP1B，LRP2，SorLA, apoER2和VLDLR，其解离常数少于5nM，其与LDLR，LRP5和LRP6结合较弱，其亲和力至少低于 LRP1 的 10 倍。因此，相对于 LDLR，LRP5 和 LRP6，RAP 对 LRP1，LRP1B，LRP2, SorLA, apoER2 和VLDLR有选择性。HRV2壳蛋白与VLDLR牢固地结合，但却不结合其他LDLR。因此，相对 于其他LDLR，HRV2壳蛋白对VLDLR优先选择，表现出其结合的选择性。颤蛋白与apoER2和 VLDLR结合，但不结合其他LDLR。因此，相对于其他LDLR，颤蛋白对apoER2和VLDLR有选择 性。本发明所用的“增加的相对递送”指一种效应，通过这种效应，相对于非缀合的活 化剂的聚集，含有与本发明的RAP环肽结合的活化剂的缀合物在期望递送部位(如，脑，或 表达含CR的蛋白的组织)的聚集增加。。“编码”指多核苷酸中核苷酸具体序列的固有特性，这些多核苷酸如，作为合成生 物学过程中其他聚合物和大分子的模版的基因、cDNA或mRNA，这些聚合物和大分子具有确 定的核苷酸序列(即，rRNA，tRNA和mRNA)，或确定的氨基酸序列以及由此获得的生物学特 性。因此，在细胞或其他生物系统中，如果通过基因产生的mRNA转录和翻译生成蛋白，那么 这个基因就编码蛋白质。一个基因或cDNA的编码链(与mRNA序列相同的核苷酸序列并 通常在序列表中提供)和用于转录模板的非编码链均可指编码蛋白或其他产物的基因或 cDNA。除非另有指定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有彼此简并形式的核苷酸序 列和编码同一氨基酸序列的核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可包括内含子。“重组多核苷酸”指含有非天然结合在一起的序列的多核苷酸。含有所述重组多核 苷酸的宿主细胞被称为重组宿主细胞”。基因在所述重组宿主细胞中的表达形成，如，“重组 多肽”。“表达调控序列”指在调节与其可操控性连接的核苷酸序列表达(转录和/或翻 译)的多核苷酸中的核苷酸序列。“可操控连接”是指两部分之间的功能关系，所述两部分 中的一部分活性(如，调节转录的能力)导致其他部分的作用(如，序列转录)。表达调控 序列可包括但不限于，如启动子(例，可诱导的或可构建的)、增强子、转录终止子、起始密 码子(S卩，ATG)，内含子剪接信号以及终止密码子的序列。“表达载体”指含有重组核苷酸的载体，该重组核苷酸含有操控性连接待表达核苷 酸序列的表达调控序列。表达载体包含足够的表达顺式作用元件；其他表达元件可由宿主 细胞提供或由体外表达系统来提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，如，黏粒， 质粒(如，无修饰的或包含在脂质体里的)以及整合重组多核苷酸的病毒。“放大”指通过其复制多核苷酸序列并扩展到大量多核苷酸分子的任何手段，如 通过逆转录、聚合酶链反应以及连接酶链反应。上下文核酸杂交试验中“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且 在不同环境参数下不同。在TijSSen(1993)生化和分子生物学-核酸探针杂交中的实验室 技术的第一部分第二章中对核苷酸杂交有深入的分析(“杂交原则汇总和核酸探针试验策 略”，Elsevier，纽约)。通常，高度严格杂交和洗涤条件选择为5°C左右，低于特定离子强度 和PH值下具体序列的热熔点(Tm)。Tm是50%的目标序列与精确匹配的探针杂交的温度。 选择非常严格的条件以与具体探针的Tm相等。高度严格的洗涤条件实施例是72°C下0. 15M NaCl洗涤15分钟。严格的洗涤条 件实施例是温度65°C下0. 2X SSC洗涤15分钟(见，Sambrook等对SSC缓冲液的描述)。 通常，高度严格的洗涤前应该用低严格的洗涤去除背景探针信号。，如，多于100个核苷酸的双链体的培养基严格洗涤实施例为，45°C温度下lx SSC洗涤15分钟。如多于100个核 苷酸的双链体的低度严格洗涤实施例为，40°C下4-6x SSC洗涤15分钟。一般来说，比在具 体杂交试验中对于不相关探针观察到的信噪比高2x(或更高)的信噪比显示具体杂交的检 测。“多肽”或“肽”指的是一种通过通过肽键相连接的氨基酸残基组合而成的聚合物， 其天然存在的结构变体以及其非天然存在的类似物。合成多肽可人工合成，如，通过自动多 肽合成仪。术语“蛋白质”通常指大分子多肽。术语“肽”通常指短多肽。上下文中的两个或更多多核苷酸或多肽序列中的术语“相同”或“相同百分比”是 指两个或更多序列或亚序列，当使用如下序列比对法则之一或通过肉眼检查的方法测量来 比较或对比最大相关性时，其是相同的或具有一定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。 优选的，相同百分比存在于两个对比的生物聚合物中的一个或两者的至少约50个氨基酸 的，至少约100个氨基酸，至少约150个氨基酸残基长度的序列的区域，或其全长。用于对照的序列最佳对比可通过例如，Smith和Waterman的局部相同算法 Adv. Appl. Math. 2 482 (1981)，Needleman 和 ffunsch 的相同对比算法 J. Mol. Biol. 48 443(1970)，Pearson 和 Lipman 的探索相似方法Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 2444(1988)， 这些法则的计算机处理(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI)，或肉目艮检 测等来实现。适用于检测序列的相同百分比和序列相似百分比的运算法则的另一例子是BLAST 运算法则，其在 Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215 =403-410(1990)中有描述。当通过常规的序列对比运算法则或用肉眼来对比和比对最大相关性时，当用于多 肽序列时，术语“相似百分比”描述其氨基酸残基的百分比是(1)相同或⑵仅仅因保守性 置换而不同(即，相似)。“基本纯”或“分离的”意味着目标种类是存在的主要种类(即，在摩尔基础上，组 合物中比任何其他个别的大分子种类更丰富)，以及基本纯化的片段是一种组合物，其中所 述目标种类包含存在的全部大分子的至少约50% (在摩尔基础上)。通常，基本纯的组合物 意味着存在的组合物中的约80%、90%、95%、99%或更多是纯化的目标种类。如果组合物 本质上含有一种单一的大分子种类，那么目标种类即被纯化到达了基本均一性(通常的检 测手段无法检测出组合物中的污染物)。本定义的大分子种类不包括溶剂、小分子(<500 道尔顿)、稳定剂(如，BSA)以及基本的离子种类。在一些实施方式中，本发明的药物组合 物含有基本纯化的或分离的RAP环肽或其与活化剂缀合的缀合物。“天然存在的”被用于一种物质时指的是在自然界中能够找到该物质。例如，存在 于能够从自然界中分离的生物体中的多肽或多核苷酸序列，并且没有被人类在实验室中有 意修饰的，就是天然存在的。“检测”指测定样本中被分析物的存在、缺少或者含量，其可包括对样本中或样本 中每一个细胞中的被分析物进行定量。“可检测部分”或“标记”指可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学手 段可检测到的组合物。例如，有用的标记包括32P、35S、荧光染料、电密度反应物、酶(如，常 用于ELISA的)、生物素-链霉抗生物素、地高辛配基(dioxigenin)、半抗原以及可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白，或具有与目标互补的序列的核酸分子。可检测部分通常可以生 成可检测的信号，如放射性、发光或者荧光性信号，这可用于定量检测样本中结合的可检测 的部分。所述可检测部分可通过共价键或离子键、范德华力或氢键结合或附在引物或探针 上，如，与放射性核素结合或链霉抗生物素识别的生物素化的核苷酸。所述可检测部分可被 直接或间接的检测。间接检测可包括第二直接或间接可检测部分与所述可检测部分的结 合。例如，所述可检测部分可以是结合伴侣的配体，如，生物素，其为链霉抗生物素的结合伴 侶，或核苷酸序列，其是互补序列的结合伴侣，并可以与互补序列特异性杂交。所述结合伴 侣本身可被直接检测，如，其自身标记了荧光分子的抗体。所述结合伴侣也可以是可被间 接检测的，例如，具有互补核苷酸序列的核酸可以是分支DNA的一部分，该分支DNA反过来 可通过与其他标记的核酸分子杂交来检测(见，例如，PD. Fahrlander和A. Klausner，Bio/ Technology (1988) 6 :1165.)。信号定量可通过如，闪烁计数、密度分析或流式细胞仪等来获 得。“连接体”指一种通过共价键或离子键、范德华力或氢键连接两个其他分子的分 子，如，与互补序列的5'端杂交和与另一互补序列的3'端杂交的核苷酸分子，这样就连 接了两个非互补序列。本申请中使用的“肿瘤”或“瘤生成”或“癌症”，包括原发肿瘤和/或转移瘤。这 样的肿瘤通常是实体瘤，或局部堆积扩散的肿瘤。已知有很多种这样的肿瘤和瘤形成。原 发性的脑肿瘤包括，胶质瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、垂体腺瘤、成髓细胞瘤、颅咽管瘤、血管瘤、 表皮样囊肿、肉瘤以及其他。癌症包括，例如，卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠 癌或胃癌。肝细胞癌或肝脏肿瘤，是世界上第五大常见癌症，其发生率逐渐稳步升高。肝细 胞癌是一种肝细胞疾病。百分之五十的颅内肿瘤是颅内转移肿瘤。脑肿瘤和瘤形成可与脑 或神经组织相关，或与脑膜、颅骨、脉管系统或头颈部的其他组织相关。根据本发明治疗的 肿瘤或瘤生成可以是恶性或良性肿瘤，并可以在之前经过化疗、放疗和/或其他治疗手段 治疗。术语“有效剂量”指对病人的健康条件、病理学和疾病或为诊断目的足以产生想要 得到的效果的剂量。想要得到的结果可包括接受这一剂量后主观或客观的改善。“治疗性 有效剂量”指对健康有效产生想要的有益效果的试剂的量。“有机小分子”指其大小与药学上常用的那些有机分子可比较的有机分子。所述 术语不包括有机生物聚合物(如，蛋白质、核酸等)。优选的有机小分子的大小范围高达约 5，OOODa、高达约 2，OOODa、或高达约 1，OOODa。诊断或治疗的“个体”，指人或非人类的动物，其包括哺乳动物或灵长类动物。“治疗”是指预防性治疗或治疗性治疗或诊断性治疗。“预防性”治疗是指对没有疾病迹象或仅仅是有早期迹象的个体进行治疗以减少 疾病发展的风险。可施用本发明的缀合物作为预防性治疗以降低疾病发展的可能性，或如 果疾病发生后，使其病理发展的严重性最小化。“治疗性”治疗是指对有病理性迹象或症状的个体实施治疗，以减少或消除这些迹 象或症状。这些迹象或症状可以是生化的、细胞的、组织的、功能的、主观的或客观的。可施 用本发明的缀合物进行治疗性治疗或诊断。“诊断的”是指鉴别病理性疾病的存在或性质。诊断方法依其特异性和选择性而不同。然而具体的诊断方法不能提供疾病的确定性诊断时，如果所述方法提供有助于诊断的 阳性指征，那么就是支持性的诊断。“药学上可接受的载体”指任何一种标准药学载体、缓冲液以及赋形剂，如，磷酸盐 缓冲溶液，5%的葡萄糖水溶液以及乳液(如，油/水或水/油乳液)以及各种类型湿润剂 和/或佐剂，这些药学载体已经被有资质的管理机构批准适合于给予人体。合适的药学载 体禾口制剂在 Remington' s PharmaceuticalSciences，19th Ed. (Mack Publishing Co.， Easton, 1995)中有描述。优选的药学载体取决于活化剂预期的施用方式。典型的施用方式 包括经肠的(如，口服)或非肠道的(如，皮下注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射或鞘内 注射；或局部、透皮，或包括肺内施用的)。“药学上可接受的盐”是指能够配制成用于治疗 用途的化合物的盐，如，金属盐(钠、钾、镁、钙等等)以及铵盐或有机胺盐。A含CR的蛋白及其作用“LDLR”指包括低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)在内的低密度脂蛋白受体 家族的成员。LRP1是4525个氨基酸的大分子蛋白(600kDa)，该蛋白通过弗林蛋白酶切 割为保留非共价键的515_(a)kD和85_(0)kDa的两个亚单位。LRP1在大多数组织类 型中均有表达，但最早发现于肝脏。所述低密度脂蛋白(LDL)受体家族的其他成员包括 LDL-R(132kDa) ；LRP2(巨蛋白，gp330) ；LRP/LRP1 和 LRP1B(600kDa) ；VLDL-R(130kDa)； LRP5 ；LRP6 ；apoER-2 (LRP-8,130kDa)；嵌合 LDL_R(LR11，250KDa)；以及其他成员，诸 如，LRP3、LRP6和LRP-7。这一家族的典型特征包括，细胞表面表达；胞外配体结合域重 复(DxSDE)；配体结合对Ca++的需要；RAP和apoE的结合；EGF前体的同源结构域重复 (YWTD)；单一膜跨越区域；胞质结构域内的内化信号(FDNPXY)；以及受体介导的多种配体 的胞吞。这一家族的一些成员，包括LRP1，LRP5，LRP6，apoER2和VLDLR，参与信号转导通 路。RAP d3折叠成反向平行螺旋发夹。第一个螺旋大约在D237-V277，通过转角(由 残基G278-G280构成)连接到第二个螺旋(残基E281-R317)。在右臂(螺旋2)交叉左臂 (螺旋1)的构象中，这两个螺旋是最接近的。LDLR的CR3基本在K270接触RAP d3，而CR4 形式基本在K256与RAPd3接触。K256和K270在螺旋2的同一表面。RAP R282和R285被 引入CR3的负电荷钙螯合囊中，而RAP K253在结合CR4中起类似的作用。所述LDLR CR对 仅仅在RAP d3反向平行螺旋发夹约H249-T303间与残基相连。在这一区域外是螺旋1的 N末端的延伸和螺旋2的C末端的延伸。据推测是螺旋1和螺旋2的这些部分帮助稳定 螺旋束。此外，在螺旋1前有一个转角S232-T236，其是一个短螺旋和一些附加序列，包括 R206-Q231间的残基。已经表明所述短螺旋和附加的序列对于RAP d3折叠的稳定性也起着 非常重要的作用。i.LRPl 选择的 RAP 肽天然的RAP强有力的结合LRP1，LRP1在肝细胞上高度表达。本发明一方面预期化 疗药物或其他治疗肝脏疾病的制剂与RAP环肽缀合，以递送治疗化合物到达肝脏，从而治 疗肝脏疾病。施用RAP缀合物来治疗肝脏疾病将解决与肝脏疾病治疗相关的几个问题，如， 肝脏对制剂的清除，因为大部分药物在注射后几乎立即被直接递送到肝细胞。此外，因为 RAP缀合物将会通过LRP1来被胞吞，质膜(MDR，P-糖蛋白)中的药物抵抗机制将被绕开。i i LRP2 选择的 RAP 肽
现已表明LRP2在脑毛细血管内皮表达，其介导apoj到脑实质的运输(Lundgren， 等人，(1997) J Histochem Cytochem 45，383-392 ;Zlokovic，等人，(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93,4229-4234 ;Shayo，等人，(1997) LifeSci 60，PL115-118)。以比其它 LDLR 更 高的亲和力选择性结合LRP2的本发明的RAP环肽及其缀合物，被期望提高脑内的分布。 例如，⑶NF已被证明促进帕金森病人黑质纹状体神经元的存活和生长(Lin，等人，(1993) Science 260，1130-1132)。然而，⑶NF本身并不能穿过脉管系统进入脑部。LRP2选择的 RAP肽与GDNF融合将预期提高GDNF在脑内的分布。iii. VLDLR 选择的 RAP 肽相似的，现已表明VLDLR表达于脑毛细血管内皮，并介导脂蛋白脂肪酶跨过主动 脉内皮的运输(Wyne，等人，(1996) Arterioscler Thromb VascBiol 16,407-415 ；Obunike, 等人，(2001) J Biol Chem 276，8934-8941)。选择性与VLDLR结合的本发明的RAP环肽及其 缀合物预期提高脑内的分布。VLDLR也通过介导吸收多余的游离脂肪酸(FFA)到血管巨噬 细胞来参与泡沫细胞的形成。(Hiltunen，等人，(1998) Circulation 97，1079-1086 ;Qu，等 人，(2004) J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 24，1_4，8)。本发明选择地与 VLDLR 结合的RAP环肽及其缀合物被期望用于阻断脂蛋白颗粒和巨噬细胞间的联系，从而抑制泡 沫细胞形成。RAP环肽及其缀合物也被期望限制FFA从循环脂蛋白进入脂肪细胞的转移， 减慢易感个体肥胖的进程(Goudriaan，等人，(2001) Arterioscler Thromb Vase Biol 21， 1488-1493 ；Goudriaan，等人(2004) J Lipid Res 45，1475-1481 ;Tacken，等人，(2001) Curr Op in Lipidol 12，275-279 ;Yagyu，等人，(2002) J Biol Chem 277，10037-10043)。VLDLR 在肌肉内皮管腔表面的高水平表达联合VLDLR在肝脏的低水平表达，被期望在静脉注射后 驱动RAP环肽及其缀合物分布到肌肉组织。对肌肉组织具有治疗效果的制剂可结合VLDLR 选择性的RAP环肽上来提高该制剂在肌肉组织的分布。iv.与肿瘤和转移瘤关联的含CR蛋白至少三个含CR的蛋白，LRP5、LRP6和ST14(TADG-15)的过量表达独立地与增加的 致瘤性或致癌作用相关联(Li，等人，(2004) Oncogene 23，9129-9135 ;Hoang，等人，(2004) Int J Cancer 109，106—111 ;Tanimoto，等人，(2005) Br J Cancer 92,278-283 ；Santin, 等人，(2004)Int J Cancer 112,14-25 ；Santin,等人，(2003)Cancer 98,1898-1904 ； Tanimoto，等人，(2001)Tumour Biol 22，104-114)。与这些蛋白选择性结合的本发明RAP 环肽或其缀合物将被期望提供减小这些蛋白致瘤影响的手段。RAP环肽可直接干扰含CR蛋 白的功能。另外，所述RAP环肽可与治疗癌症的制剂缀合来靶向递送其到过量表达含CR蛋 白的组织。例如，matriptase(MT-SPl，ST14，TADG-15)在多种上皮肿瘤(癌)中过量表达 (25-33)。在肝细胞活化抑制剂1促进的反式激活作用后，matriptase直接或通过激活其 他蛋白酶降解细胞外基质成分来促进肿瘤生长和转移，其他蛋白酶如，尿激酶血浆酶原激 活剂(uPA)，其导致基质降解活动(26，34，35)。已有提示表明在matriptase (ST14)胞外 结构域中的邻近CR阵列的蛋白酶结构域提高了过量表达matriptase (ST14)细胞的侵润 性和致瘤性。matriptase通过II型跨膜结构域的N末端锚定在上皮细胞膜的侧面或底 侧面(Pfistermueller，等人(1996)FEBS Lett 396，14-20)。包埋在膜内的序列在蛋白 C末端连接一个细胞外SEA结构域，两个CUB结构域，四个CR结构域以及胰蛋白酶结构
19域。Matriptase中的CR序列突变导致所得到的蛋白酶突变体活化失败(Qiu，等人(2003) Neuroscience 122，291-303)。相似地，结合到matriptase第三CR结构域的抗体阻断所述 酶的活化(Basu，等人(2001) Immunity 14，303-13)。与包含第三CR结构域的matriptase 的两对CR对中一对具有亲和力的RAP环肽被期望用于干扰蛋白水解的活化，其方式与 已观察到的抗体对这一区域的抑制相似。这样的RAP肽将被期望减小在受影响组织的 matriptase过量表达的转移和致瘤效应。含有matriptase选择性的RAP环肽以及蛋白酶 抑制剂的缀合物也期望用于特异地阻断涉及其蛋白水解活性的matriptase的效应。LRP6选择性的RAP环肽可被设计通过诱导LRP6胞吞或干扰LRP6介导的Wnt信号 转导活动来下调肿瘤细胞上的LRP6。相似地，缀合了治疗制剂(如，癌症化疗药物)或诊断 制剂的LRP6选择性RAP环肽可用于靶向递送到过量表达LRP6的组织。V. LRP5选择性RAP肽和骨疾病通过LRP5增强Wnt信号传导已被证明增加了造骨细胞的分化，抑制破骨细胞的活 动，并提高了骨的沉积(Westendorf，等人，(2004) Gene 341，19-39 ；Zhang，等人，(2004)Mo 1 Cell Biol 24,4677-4684)。通过造骨细胞特异的APC(结肠腺瘤息肉病)敲除小鼠和对 DKK(Dickkopf)-l和硬骨素(sclerostin)介导的抑制敏感的LRP5突变体，这一信号传导 机制已得到确认(Zhang，等人，(2004)Mol Cell Biol 24，4677-4684 ;Holmen，等人，(2005) J Biol Chem)。LRP5特异的RAP环肽通过结合抑制剂或通过其他方式增强Wnt信号传导 (如，不阻断Wnt结合而稳定LRP5)，将被预期具有相似的效果。例如，对两个LRP5 CR对中 任一个特异的RAP环肽与0推进伴侣蛋白Mesd融合将被期望通过LRP5干扰DKK-1介导 的 Wnt 信号传导的拮抗作用(Hsieh，等人，(2003) Cell 112，355-367 ;Herz，等人，(2003) Cellll2，289-292)。干扰LRP5抑制的这些RAP环肽(如，减少DKK-1结合至或LRP5抑制) 及其缀合物预期在骨质疏松症或其他与造骨活性减少和/或破骨活性增加相关的疾病的 治疗中具有治疗效果。相似地，通过LRP5抑制Wnt信号传导的RAP环肽预期在造骨活性增 加相关的疾病的治疗中具有治疗效果，如，骨硬化病。vi. FDC-8D6 选择性 RAP 肽FDC-8D6抗原(⑶320)有一对这样的结构域并在淋巴滤泡B细胞分化中起重要作 用(36，37)。非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括一类称为B细胞的免疫细胞的增殖和结外迁移。NHL是 年龄为20岁到39岁之间的男性主要致死性癌症。已有研究表明FDC-8D6抗原蛋白(⑶320) 促进肿瘤B细胞的生长(36，37)。8D6抗原含有一个单一的CR结构域对。试剂，如RAP环 肽，其结合并阻断8D6的功能，并期望减慢人非霍奇金淋巴瘤的病情发展。B.治疗能够通过施用本发明的RAP环肽或缀合物治疗的特定疾病病变，其依据含CR蛋白 靶向类型和能够存在于缀合物中的药物部分变化。因此，疾病病变包括细胞增殖性疾病， 如，肿瘤疾病、自身免疫疾病、心血管疾病、荷尔蒙异常疾病、退行性疾病、老化病，中枢神经 系统疾病(如，阿尔茨海默病、癫痫病、高血脂)、精神疾病和病变(如，精神分裂症、情绪紊 乱，如抑郁和焦虑)、感染性疾病、酶缺乏症、之前所述的那些溶酶体贮积症等等。治疗意味着包括使施用缀合物相关的个体产生的任何有益效果，包括降低获得疾 病的可能性，预防疾病，减慢、停止或逆转疾病的进程，或改善给宿主带来痛苦的疾病的相关症状，此处所述的改善或有益广义上指至少一个参数数值的减小，如，治疗的病理病变相关的症状(如，与之相关的发炎和疼痛)。同样地，治疗也包括病理状况或至少相关症状被 完全抑制的情形，如，预防发生或停止，如，终止，以使宿主不再遭受病理病变，或至少病理 病变的特征性症状。i.溶酶体贮积症在一些实施方式中，经治疗的疾病是溶酶体贮积症，所述缀合物作为本发明的药 物组合物以足以减少所述哺乳动物脑组织中贮存的颗粒数量的有效剂量施用。典型地，这 一疾病的症状通过以下监测常规的病史评估、身体检查、超声心动图、心电图、磁共振成 像、多道睡眠描记术、骨骼检查、活动度测量、角膜照片、皮肤活组织检查。对这种疾病施用 RAP环肽或其缀合物可使所述个体的发展延缓或衰退正常化，减轻高压脑积水，减轻所述个 体的脊髓压迫，并减少所述个体脑血管周围血管周囊泡的数量和/或大小。监测和评估这 一结果的方法对本领域技术人员而言是已知的。对这个结果的其他描述，本领域技术人员 参见美国专利6，585，971 ；美国专利6，569，661和美国专利6，426，208以及美国专利公开 号 20040009906。在优选的实施方式中，动物患有I型粘多糖贮积病并有50%或更少的正常 α -L-艾杜糖苷酸酶活性。在这些实施方式中，预期如每周一次施用约0. OOlmg/kg体重到 0. 5mg/kg体重之间的有效剂量的人α -L-艾杜糖苷酸酶作为缀合物的一部分给患有这一 疾病的个体。在其他实施方式中，每周一次给所述个体施用哺乳动物的约0. 01mg/15cc CSF 到约5.0mg/15CC CSF之间的剂量的所述人α-L-艾杜糖苷酸酶。本文所述的治疗包括促进 患有溶酶体贮积症病人的脑细胞中粘多糖(GAG)的分解。这些脑细胞可以是神经元、神经 胶质细胞、室管膜细胞。典型地，颗粒堆积发生并可通过使用本发明的缀合物来改善的脑细 胞包括神经元、胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、血管周细胞、外皮细 胞、脑膜细胞、室管膜细胞、蛛网膜颗粒细胞、蛛网膜、硬膜、软膜以及脉络丛细胞。优选实施 方式中的治疗与没有施用所述缀合物的相似细胞中的溶酶体贮积颗粒的数量相比，其减少 了脑膜细胞中贮积颗粒的数量。在一些个体中这产生了减轻高压脑积水症状的治疗效果。 并且，所述的施用减少了所述个体脑膜组织中CSF液体的量。可用本发明的缀合物治疗的溶酶体贮积症的非限定性实施例包括I型粘多糖贮 积病，II型粘多糖贮积病亨特综合征，IIIA型粘多糖贮积病桑菲利波综合征，IIIB型粘多 糖贮积病桑菲利波综合征，IIIC型粘多糖贮积病桑菲利波综合征，IIID型粘多糖贮积病桑 菲利波综合征，IVA型粘多糖贮积病莫基奥综合征，IVB型粘多糖贮积病莫基奥综合征，VI 型粘多糖贮积病，VII型粘多糖贮积病斯莱综合征，IX型粘多糖贮积病，天冬氨酰葡萄糖胺 尿症，胆固醇脂贮积病/沃尔曼病，胱氨酸病，Danon病，法布里病，法伯脂肪肉芽肿病/法伯 病，岩藻糖苷贮积症，Ι/ΙΙ型半乳糖涎酸贮积病，Ι/ΙΠΙΙ型高切尔病，球形细胞脑白质营 养不良/克拉伯(Krabbe)病，II型糖原贮积病/庞皮病，Ι/ΙΙ/ΙΙΙ型GMl-神经结苷脂贮 积病，I型GM2-神经结苷脂贮积病/泰-萨病，II型GM2-神经结苷脂贮积病桑德霍夫病， GM2-神经结苷脂贮积病，Ι/ΙΙ型α -甘露糖苷贮积症，β -甘露糖苷贮积症，异染性脑白质 营养不良，异染性脑白质营养不良，粘脂贮积症I型/涎酸贮积症1/11，ΙΙ/ΙΠ型粘脂贮积 症I型-细胞病，III型粘脂贮积症假胡尔勒多种营养不良，多发性硫酸酯酶缺乏症，神经 细胞蜡样脂褐素病，CLNl巴滕病，神经细胞蜡样脂褐素病，CLN2巴滕病，A型尼曼-皮克病/B型尼曼-皮克病，Cl型尼曼-皮克病尼曼-皮克病，C2型尼曼-皮克病尼曼-皮克病，致密成骨不全症(Pycnodysostosis)，I型施德勒病(Schindler disease)/11型施德勒病 或涎酸贮积症。ii.神经紊乱在其他实施方式中，接受治疗的疾病是神经疾病，缀合物作为药物组合物以足以 预防、处理或治疗这些神经疾病的有效剂量施用。神经疾病包括但不限于阿尔茨海默病， 帕金森病，多发性硬化，肌萎缩侧索硬化，其他脱髓鞘相关疾病，中枢神经系统癌症，创伤性 脑损伤，脊髓损伤，中风或脑缺血，斑样硬化，脑脉管炎，癫痫症，亨廷顿病，图雷特综合征， 吉_巴综合征，威尔逊病，皮克病，神经炎性疾病，脑炎，脑脊髓炎或病毒性、真菌或细菌性 脑膜炎，或其他中枢神经系统感染，朊蛋白疾病，小脑共济失调，小脑变性，脊髓小脑变性综 合征，弗里德赖希共济失调，毛细血管扩张性共济失调，脊髓肌萎缩，进行性核上麻痹，肌张 力异常，肌肉强直，震颤，视网膜色素变性，老年痴呆，皮层下痴呆，动脉硬化痴呆，AIDS关联 痴呆，或其他痴呆，纹状体黑质变性，线粒体脑肌病，神经细胞蜡样脂褐素病，中枢神经系统 引起的溶酶体贮积紊乱，脑白质营养不良，尿素循环缺陷疾病，肝性脑病，肾性脑病，代谢性 脑病，卟啉病，神经毒性物质中毒，放射诱导的脑损伤，或精神疾病，如，精神异常，焦虑，抑 郁，注意力分散，记忆障碍，认知障碍，食欲障碍，肥胖，成瘾，倾向或药物依赖。阿尔茨海默病在一个优选的实施方式中，被治疗的疾病是阿尔茨海默病，该病与受影响病人脑 内40-42氨基酸肽的淀粉样β蛋白(Α β)水平增高有关(Selkoe，等人(1996) J Biol Chem 271,18295-18298)。随着一系列连续的蛋白酶水解的2产生，Aβ寡聚化并最终堆积在神 经间隙形成不可溶斑块。体内及体外试验证明可溶及不可溶的形式的Αβ均有神经毒性 (Zerbinatti，等人，(2004) ProcNatl Acad Sci USA 101，1075-1080 ；Tsai，等人，(2004) Nat Neurosci ；Schmitz，等人(2004) Am J Pathol 164，1495-1502 ;Gong，等人(2003) Proc Natl Acad Sci USA 100，10417-10422 ;Bard，等人(2000)Nat Med 6，916-919 ;Schenk，等人 (1999) Nature 400，173-177 ;Hsia，等人(1999) ProcNatl Acad Sci USA 96,3228-3233)。 可溶Αβ单体及其低聚体被证明通过抑制长时程电位可逆地诱导记忆缺陷(Gong，等人 (2003)Proc Natl Acad SciUSA 100，10417-10422)。Αβ是淀粉前体蛋白或APP的蛋白水解片段，一种功能尚未确定的细胞表面膜蛋 白。Αβ的形成由神经分泌途径或通过LRPl (LDLR受体家族成员之一)的APP胞吞启动 (Cam，等人，(2004) J Biol Chem 279,29639-29646)。一旦到达内体系统，APP 即被 β 位点 APP裂解酶或BACE (—种膜蛋白酶)裂解。BACE在671位点切割ΑΡΡ，恰好是跨膜结构域的 N末端。然后APP保留下来的部分被三种蛋白的联合体(早老蛋白-1，早老蛋白_2和呆蛋 白，构成了 Y-分泌酶联合体)再次切割(Xia，等人(2003) J Cell Sci 116,2839-2844)。 早老蛋白在脂质双分子层内部小叶内对底物进行切割。在APP的跨膜结构域内，γ-分泌 酶切割步骤发生在711和713位点之间。Y-分泌酶切割释放Αβ，Αβ保留在神经元内或 分泌到细胞外间隙。在任何一个部位对神经元都是具有毒性的(Casas，等人(2004)Am J Pathol 165,1289-1300)。通过β和γ分泌酶连续切割APP被定义为淀粉样生成(amyloidogenic)途径。一交替性途径控制正常脑组织。通过受体脱落释放APP的整个胞外域，蛋白水解过程通过α分泌酶催化。释放的胞外域被定义为sAPP a，并且已被证明具有保护神经和增强记忆的效 果(Furukawa，等人(1996) JNeurochem67,1882-1896 ；Meziane，等人(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95，12683-12688)。在非淀粉样生成途径中，APP胞外域释放是关键的事件。在淀粉 样生成过程中，蛋白水解发生在变为A 0的APP区域内的688位点(Allinson，等人(2003) J Neurosci Res 74，342-352)。因此，淀粉样生成和非淀粉样生成途径是相互排斥的。sAPP a 的释放通过a分泌酶ADAM10 (也是一种膜结合蛋白酶)催化(Fahrenholz，等人(2000) Arm N Y Acad Sci 920，215-222)。ADAM10是解联蛋白和金属蛋白酶，是“脱落酶”酶家族的一 部分，包括Notch裂解酶(Kuzbanian)和TNF-a前体裂解酶(TACE，ADAM17)。ADAM10已被 发现是造成 BACE 胞外脱落的原因(Hussain，等人(2003)JBiol Chem 278，36264-36268)。像其它ADAM家族成员一样，ADAM10有N端的前结构域(prodomain)，催化酶结构 域，解联蛋白结构域，跨膜结构域以及胞质尾巴。前结构域与催化结构域紧密结合，是酶正 确折叠的必要条件。这一结合也使前结构域中的半胱氨酸可逆地结合激活部位的锌原子， 当其转运分泌途径时屏蔽酶的水解活性。一旦到达转运高尔基体，组成型分泌途径中的前 蛋白(proprotein)转换酶弗林蛋白酶(Furin)识别ADAM10的残基211-214 (RKKR)，切割掉 前结构域，表现出酶的蛋白水解活性。以通过ADAM10释放sAPP a为代价来增加通过0和Y分泌酶释放的A ^，被认 为是阿尔茨海默病的基础。在进行大量的程序来开发BACE的药理学抑制剂或Y分泌酶复 合物，以转移APP使其从淀粉样生成途径中被加工清除。一个补充途径是通过增加脑间质 a分泌酶的水平来消耗A0，增加sAPPa产生。动物模型中APP蛋白水解过程的不平衡 已经通过适当地补充具体的神经蛋白酶(ADAM10)内生水平来得到矫正。增加脑内ADAM10 水平的好处已经在阿尔海默小鼠模型中被证实(Postina，等人(2004)J Clinlnvest 113， 1456-1464 ;Lichtenthaler，等人(2004) J Clin Invest 113,1384-1387)。业已发现脑内 ADAM10水平的轻度增加可预防疾病的表型。本发明预期基于静脉施用RAP环肽与ADAM10的融合物来治疗阿尔茨海默病。一 个优选的实施方式是，治疗阿尔茨海默病的方法，其包括施用ADAM10-RAP环肽缀合物病提 高脑a分泌酶的活性，其中所述施用是通过静脉内或颈动脉内或鞘内施用。a分泌酶水平 提高反过来预期转移淀粉样生成途径中的APP加工。sAPPa产量增加及其必然的结果，产 生的A0减少，被预测对于阿尔茨海默病人有治疗效果。或者，本发明涵盖了阿尔茨海默病 的治疗，其包括施用RAP环肽与其它作用于APP或A3的蛋白酶，或与3分泌酶的抑制剂， 或与Y分泌酶抑制剂的融合物。在一相关方面，本发明涵盖了通过使用主要附加的ADAM10-RAP融合物来使经静 脉注射的活化的脱落酶的外周效应最小化。完整的pro-ADAMlO-RAP可通过弗林蛋白酶抑 制剂和a 1抗胰蛋白酶Portland共表达，从标准的生产线分离(Srour，等人(2003)FEBS Lett 554,275-283 ；Benjannet，等人(1997) J Biol Chem 272,26210-26218)。然后在转胞 吞过程中，或在到达脑间隙时，通过移除清除至组织之后的前结构域活化所述融合物。在 转胞吞过程中，因为与LRP相关，因此融合物变得与膜相关。所述融合受体复合物则在内 涵体内转运细胞。早期的体内及体外研究表明在转胞吞过程中，转运中一些蛋白质部分被 蛋白酶水解(Lisi，等人(2003) JEndocrinol Invest 26，1105-1110)。内吞的 ADAM10-RAP 缀合物无论是在最初的内吞至内皮细胞还是在最终的内吞进入神经元，都会在早期内涵体
23中将融合物暴露至弗林蛋白酶(Mayer，等人(2004) J Histochem Cytochem 52,567-579 ； Bosshart，等人(1994)J Cell Biol 126，1157-1172 ;Rohn，等人(2000) J Cell Sci 113 (Pt 12), 2093-2101)。一种可选择的延迟ADAM10活化的途径是，用对ADAM敏感的肽连接体替换 连接前结构域和催化结构域的对弗林蛋白酶敏感的肽连接体。达到修饰的前结构域在生产 线中被裂解的程度时，该反应可通过含氧肟酸抑制剂培养或通过共表达TIMP1或TIMP3来 抑制(Amour，等人(2000)FEBS Lett 473，275-279)。然而在外周中RAP融合物的半衰期很 短，对ADAM敏感的pro-ADAMlO-RAP融合物的堆积，将会导致所述融合物对空隙中神经元表 面内生活化的ADAM10的暴露。每一个活化的ADAM10-RAP融合物随后活化更多ADAM10-RAP， 那么可预测蛋白酶水解连锁反应。用甘露醇颈动脉内共注射和鞘内注射可不需要非活化的 ADAM10。本发明涵盖的其他的神经疾病描述如下。如，以震颤和运动神经元功能下降、僵直 和丧失运动为特征的帕金森病。这些神经症状主要因黑质纹状体即黑质纹状体束主要传 出投射的机能失常导致的。多巴胺能系统中的神经元胞体是PD疾病发展中涉及的主要细 胞。原发性帕金森综合征包括，帕金森病(PD)，进行性核上麻痹(PSP)，和纹状体黑质变性 (SND)，其包括橄榄体脑桥小脑变性(0PCD)和夏-德综合征SDS)(其已知症状是多系统萎 缩 MSA)。肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)通常也称为“洛盖赫里格”病，是一种攻击脑和脊髓 的运动神经元的进行性神经退行性疾病。ALS中运动神经元的进行性退变最终导致其死亡， 使得脑启动和控制肌肉活动的能力下降。亨廷顿病(HD)，虽然是一种遗传性疾病，但导致了纹状体中间棘状GABA能神经元 的退变(Hickey 等人，Prog Neuropsychopharmacol Biol6Psychiatry. 27 :255_65，2003)。 这一退变引起行动失控、智力下降以及情绪障碍。多发性硬化(MS)是一种多发于年轻人的致残的疾病。该病较典型的表现是炎症 反应，可能是自身免疫型炎症反应，以及通常与中枢神经系统的少突胶质细胞和髓磷脂形 成细胞缺失关联的脱髓鞘。目前可利用的治疗手段集中于MS的炎症因子，但是对髓鞘形成 的效果甚微，如果有效果的话。本发明的组合物用于治疗脑部肿瘤。最常见的脑肿瘤是起源于胶质组织的胶质 瘤。星形细胞瘤起源于一种被称为星形胶质细胞的小的星形细胞，大多数发生于成年大脑。 III级星形细胞瘤有时称为间变型星形细胞瘤。IV级星形细胞瘤通常被称为多形性胶质母 细胞瘤。脑干胶质瘤发生在脑最低的杆样部分。脑干控制着很多重要的功能。大部分脑干 胶质瘤是高分化星形细胞瘤。室鼓膜瘤通常发生在脑室内层，也可发生在脊髓。少突胶质 细胞瘤发生于产生髓磷脂的细胞，其包裹的脂肪保护神经。这些肿瘤通常发生于大脑，它们 生长缓慢，通常不会扩散到周围脑组织。成神经管细胞瘤发生在较原始的神经细胞，这些细 胞通常在个体出生后不再保留。因为这一原因成神经管细胞瘤通常被称为原始的神经外胚 层瘤(PNET)。大多数成神经管细胞瘤发生于小脑，然后，它们也可发生于其它区域。脑膜瘤 发源于脑膜，它们通常是良性的。因为这些肿瘤生长非常缓慢，脑组织可调整适应它们的存 在；脑膜瘤在其产生症状前通常生长得较大。神经鞘瘤是发生于施旺氏细胞的良性肿瘤，施 旺细胞产生髓磷脂保护听神经。听神经瘤是神经鞘瘤的一种类型。颅咽管瘤发生于脑垂体 腺靠近视丘下部，通常为良性。然而，有时认为它们是恶性的，因为它们会压迫或破坏视丘下部，影响重要功能。生殖细胞瘤起源于原始的性细胞，或生殖细胞。脑部最常见的生殖细 胞肿瘤是生殖细胞瘤。松果体区瘤发生在松果腺或其周围。这一肿瘤可以是缓慢生长的松 果体细胞瘤或快速生长的成松果体细胞瘤。松果体部位很难触及，因此这些肿瘤通常不能 清除。对脑部肿瘤的治疗取决于很多因素。包括类型、部位和肿瘤的大小以及病人的年 龄和健康程度。通常脑部肿瘤通过外科手术、放疗和化疗来治疗。在一个方面，本发明提供 了一种抑制成神经瘤细胞和神经肿瘤生长和发展的方法，其包括对患有成神经细胞瘤或神 经肿瘤的病人施用含RAP环肽的组合物。另一方面，所述RAP环肽可与对治疗神经瘤有用 的制剂缀合。GDNF在另一优选的实施方式中，本发明预期治疗神经退行性疾病的方法，其包括施用 与神经生长因子(如，胶质细胞源性神经营养因子(⑶NF))缀合的RAP环肽。这些神经退 行性疾病包括但不限于帕金森病。GDNF最初从大鼠的胶质瘤细胞系上清液中纯化而来，作 为胚胎中脑多巴胺能神经元的营养因子。在体内，⑶NF同型二聚体与其受体GFRa-1 (可 能也是一个二聚物)结合，然后⑶NF-GFRa -1复合物与Ret蛋白结合，使其二聚体化。Ret 的二聚体化导致酪氨酸1062自磷酸化。研究表明GDNF对其他神经亚群有着显著的影响。 因为⑶NF保护帕金森病动物模型中的多巴胺神经元，并在体内挽救运动神经元，因此⑶NF 期望用来作为治疗几种神经退行性疾病的治疗制剂。然而，GDNF不能穿过血脑屏障。本发 明提供了转运GDNF跨过血脑屏障的方法，其包括使用缀合至GDNF的RAP环肽。iii肝脏疾病使用本发明RAP环肽或其缀合物治疗的肝脏疾病，包括但不限于以下讨论的那些 疾病。肝细胞瘤或肝脏肿瘤是世界第五大最常见的癌症，其发生率稳步上升。肝细胞瘤是 一种肝细胞疾病。致瘤性肝细胞保持着高水平的LRP1表达。肝细胞瘤对化疗反应不是很 好，因为肿瘤细胞表现出高度的抗药性，并且因为系统性(静脉给药)给药化疗有严重的毒 性，尤其对心脏和肾脏。肝炎是肝脏炎症的一般术语。肝炎可是急性或慢性的并包括急性或慢性肝衰竭， 如，因为病毒(如，肝炎病毒A, B, C，D，或E，或非ABCDE, CMV(巨细胞病毒)，Epstein-Barr 病毒)，真菌，里克次氏体属微生物，或寄生虫感染，酒精，化学毒素，药物(如，对乙酰氨基 酚，胺碘酮，异烟胼，氟烷，氯丙嗪，红霉素)，代谢性肝病(如，威尔逊病，a 1-抗胰蛋白酶缺 乏症)，癌症，先天自身免疫疾病，肝硬化(如，原发性胆汁肝硬化)，胆道堵塞等引起。肝脏 感染A，B或C型肝炎病毒可引起导致肝衰竭的缓慢进展的肝脏疾病。急性肝炎感染最常见 由感染A型肝炎病毒引起。B和C型肝炎病毒可同时感染身体，演变为长时间感染(慢性)。 C型肝炎病毒可引起严重的病变，包括肝硬化和癌症。本发明涵盖的其他肝脏疾病或病变可通过施用缀合至RAP环肽的组合物治疗，其 包括肝脂肪变(美国专利6，596，762)，胆汁淤积(美国专利6，069，167)，肝硬化，中毒性肝 损伤，肝切除后的病变，胆管阻塞。能够与RAP环肽缀合来治疗肝脏疾病的候选药物包括但不限于5_氟尿嘧啶，多 柔比星(阿霉素)，丝裂霉素C，顺钼，表柔比星，柔红霉素，依托泊苷以及其他化疗表1中 所列的化学药物，阿德福韦，拉米夫定，恩替卡韦，利巴韦林，干扰素a，聚乙二醇化干扰素a -2a,，干扰素a -2b及其他抗病毒剂，维生素E，熊去氧胆酸，以及其他用于治疗肝脏疾病 的制剂。
表 1
米托坦分化剂氨鲁米特视黄酸衍生物细胞因子激素和拮抗剂干扰素(《，P, 丫) 白介素-2肾上腺皮质类固醇/拮抗剂强的松和等同物地塞米松光敏刑氨鲁米特血卟啉衍生物(ainoglutethimide)Photofrin 苯并卟啉衍生物Npe6黄体制初卟啉锡(SnET2>己酸羟孕酮pheoboride-a醋酸甲羟孕酮细菌叶绿素-a醋酸甲地孕酮萘跃箐(naphthalocyanines)雌激素苯二甲蓝染料己烯雌酚(phthalocyanines)乙炔雌二醇/等同物锌笨二甲蓝染料抗雌激素物质放射物他莫昔芬X-射线雄性激素紫外线睾酮丙酸盐伽玛輻射氟曱睾酮/等同物可见光红外线輻射抗雄激素物质微波輻射
氟他胺
促性腺激素释放剂 激素类似物 亮两端林
非类固酵类抗雄性激素物 氟他胺iv.癌症Matriptase在上皮癌中过量表达，如，卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结 肠癌或胃癌。其他实施例包括肺间皮瘤、黑色素瘤、非小细胞性肺癌、胶质瘤、肝细胞(肝)瘤、甲状腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾脏癌症、胰腺癌、非黑色素皮肤癌。RAP 环肽可用于抑制matriptase活性，或作为递送细胞毒性或其他癌症治疗试剂的靶向制剂。已经确定LRP6在结肠和乳腺癌中过量表达。RAP环肽可用于抑制LRP6的活性，或 作为递送细胞毒性或其他癌症治疗试剂的靶向试剂。可使用本发明的RAP环肽或其缀合物治疗的其他癌症还包括伯基特淋巴瘤、非霍 奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤以及白血病。V，骨代谢疾病可使用本发明的RAP环肽和缀合物治疗的骨代谢疾病包括与相关的骨的疾病 (如，异常骨沉积、异常骨流失或骨弱化(bone weakening))骨质疏松症，骨骼石化症，骨 发炎，关节炎，风湿性关节炎，骨关节炎，皮质醇增多症，性腺机能衰退，原发或继发的甲状 旁腺功能亢进，或甲状腺亢进，血钙过多，维生素D缺乏状态(如，佝偻病/骨软化，坏血病， 营养不良)，吸收障碍综合征，慢性肾衰(肾性骨营养不良)，慢性肝脏疾病(肝性骨营养不 良)，老化，卧床，药物引起的骨质疏松症(糖皮质激素或类固醇，肝磷脂，酒精)或遗传疾病 (成骨不全症，高胱氨酸尿症)，骨转移癌，骨髓瘤，骨折，骨移植，纤维结构不良，和/或佩奇 病。C. RAP环肽缀合物及活化剂RAP环肽和活化剂可通过本领域已知的任何方法结合。它们可生理连接，如，通过 共价化学键、物理作用力例如，范德华力或氢键，包囊作用，包埋或其结合。在优选的实施方 式中，所述治疗剂与RAP环肽通过共价化学键生理结合。正如，优选的化疗剂含有官能团 如，醇、酸、羰基、硫醇或胺基团，用于缀合RAP肽。阿霉素是胺类的，同时也有可能通过羰基 来结合。紫杉醇是醇类。不含适合的缀合基团的化疗剂可添加这种基团进一步修饰。所有 这些化合物均包括在本发明之内。在有多种治疗剂的情况下，可使用各种缀合物的组合。在一些实施方式中，共价化学键可直接(没有干扰原子)或间接(通过连接体，如 共价连接原子链)连接RAP肽和活化剂。在一些实施方式中，所述RAP肽和所述缀合物的 活化剂部分通过RAP肽原子和活化剂的原子之间的共价键直接连接。在其他实施方式中， RAP肽与活化剂部分通过连接体相连，该连接体包含能够将所述RAP肽与所述活化剂部分 相连的共价键或差不多任何氨基酸序列或任何分子或原子的肽。在一些实施方式中，所述连接体包含长度从1至约60，或1至30个原子或更长，2 至5个原子，2至10个原子，5至10个原子或10至20个原子的原子链。在一些实施方式 中，所述链原子均为碳原子。在一些实施方式中，所述链原子选自C、0、N和S。链原子和连 接体可根据其预期溶解度(亲水性)选择，以提供更高可溶性的缀合物。在一些实施方式 中，所述连接体提供经受在溶酶体中酶的攻击的官能团。在一些实施方式中，所述连接体提 供经受在目标组织或器官中发现的酶的攻击的官能团，并且在受攻击或水解时在所述活化 剂和所述RAP肽之间起连接体的作用。在一些实施方式中，所述连接体提供在目标位点发 现的条件下(如，溶酶体的低PH)经受水解的官能团。连接体可含有一个或多个这样的官 能团。在一些实施方式中，所述连接体的长度足以降低所述一个或两个RAP肽结合位点与 活化剂结合位点之间的空间位阻电位(当活化剂较大时)。如果连接体是共价键或肽，活化剂是多肽，整个缀合物可是融合蛋白。这样的肽连 接体可以是任何长度。示范性连接体为约1-50个氨基酸的长度，5至50，3至5，5至10，5至15，或10至30个氨基酸的长度。这样的融合蛋白可通过本领域普通技术人员已知的重 组基因工程方法来获得。在一些实施方式中，缀合物的RAP肽部分被制成迅速降解或清除 的剂型以便释放活性化合物。在其他实施方式中，连接体在细胞内，或更优选的，在溶酶体 环境条件下经受裂解，以从所述RAP肽部分释放或分离活化剂部分。所述缀合物可含有一个或多个连接在相同RAP肽的活化剂。例如，缀合反应可缀 合约1-5，约5，约1-10，约5-10，约10-20，约20-30，约30，或更多的活化剂分子到RAP肽 上。这些制剂可作为混合物来使用，或它们可纯化成为特殊的化学计量制剂。本领域的普 通技术人员可确定哪一种形式和哪一种化学计量比率是优选的。进一步地，人们期望实现 超过一种活化剂可与RAP肽连接，递送一种以上的制剂到所需靶位点或间隔。大多数的活 化剂种类可附在相同的RAP肽上，例如，阿霉素-顺钼RAP肽缀合物。因此，缀合物可含有 一定化学计量比率并结合超过一种类型的活化剂。这些也可分为纯化的混合物或它们以聚 集物使用。本发明的RAP环肽，或其缀合物，可根据需要修饰来提高稳定性或药物动力学特 性(如，通过PEG化)。可以预见的是本发明的RAP肽可被融合或连接治疗性蛋白，如，胶质细胞来源的 神经生长因子(⑶NF)，脑源性神经生长因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，以及其他本领域 已知的神经营养因子，ADAM10，作用于APP或A0的其它蛋白酶，MESD，癌症化疗剂，蛋白酶 抑制剂，自身免疫性抗原，促凋亡分子，溶酶体酶，DNA或siRNA。可以预见的是，这些制剂与 对含CR蛋白具有改进的亲和力和结合选择性的RAP环肽的融合，可促进跨血脑屏障的运输 增加或至其他组织位点的运输增加。在一个方面，可以预见的是在静脉内、皮下、肌肉、心室 内、鞘内或脑室内给予所述缀合物后与RAP环肽的缀合引起组织分布的改变或改善缀合物 的递送。本发明进一步提供缀合至RAP环肽导致活化剂药理学活性改变，其通过一个或多 个下述效应增加的效力，对不同于想要的靶受体或组织的受体或组织的结合减少，对想要 的靶受体或组织的受体或组织结合增加，到达想要的靶受体或组织的受体或组织的通路增 加，改变的体内清除率，以及改变的对蛋白的免疫反应特征。本发明进一步提供了 RAP环肽可缀合治疗性核酸，如DNA或siRNA，以改善所 述核酸的组织选择性分布，促进所述核酸胞吞进入细胞(Kim等人，(2004)Bioconjugate Chemistry 15,326-332)。D活化剂根据本发明的活化剂包括能够影响生物学过程的试剂。本发明中用于化合物组 合物及方法中的具体优选活化剂是治疗试剂，包括药物或诊断试剂。术语“药物”或“治疗 试剂”指当施用有效治疗剂量时，具有药理学作用或有益于健康的活化剂。特别首选的试 剂是天然存在的生物学试剂(如，酶、蛋白、多核苷酸、抗体、多肽、纳米颗粒、糖蛋白缀合物 (glyconjugates))。药物或治疗试剂的例子包括用于预防/诊断/减缓/治疗或治愈疾病 或病变的物质。特别预期不引发疾病的试剂。i.蛋白活化剂所述活化剂可以是非蛋白或蛋白。活化剂可以是蛋白或酶，或者仍保持着一些、基 本上全部、或所有治疗或生物学活性的蛋白或酶的任何片段。在一些实施方式中，蛋白或酶是一种这样的蛋白如果不表达或产生，或者表达或产生的量基本上减少则会引起疾病，其 包括但不限于，溶酶体贮积症。所述蛋白或酶优选来源或得自人或小鼠。
在本发明优选实施方式中，当与RAP环肽缀合的活化剂是蛋白或酶，或其具有这 种蛋白或酶的生物活性的片段时，这种活化剂具有与人或哺乳动物的蛋白或酶相应部分氨 基酸序列相同的氨基酸序列。在其他的实施方式中，这种缀合物的活化剂部分是对于人类 或哺乳动物物种而言是天然的蛋白或酶。在其他实施方式中，这种蛋白或酶，或其片段对这 种相应的人或哺乳动物的蛋白或酶天然序列而言是基本上同源的(即在长度至少10，25， 50，100，150或200个氨基酸或活化剂全长的氨基酸序列上至少80%，85%，90%，95%，更 优选98 %，或最优选99 %的氨基酸序列相同)。若所述化合物为蛋白，则所述化合物可为酶，或仍保持一些、基本上全部或全部酶 活性的酶片段。在治疗溶酶体贮积病中，所述酶优选是在细胞内发现、且如果不表达或表达 或生成大量减少将导致溶酶体贮积病的酶。所述酶优选来自或得自人或小鼠。所述酶优选 溶酶体贮积酶，如a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，类肝素-N-硫酸酯酶， a -N-乙酰葡糖胺糖苷酶，芳基硫酸酯酶A，半乳糖神经鞘氨醇酶，酸性a -葡萄糖苷酶，三 肽基肽酶，a-己糖胺酶，酸性神经鞘磷脂酶，半乳糖苷酶，或任何其他溶酶体贮积酶。因此，在一些实施方式中，在治疗人溶酶体贮积症(LSDs)中，所述RAP环肽缀合 物包括活化剂蛋白或酶，其在待治疗的个体或患者的溶酶体内是不足的。这些酶包括例如 a -L-艾杜糖苷酸酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，类肝素-N-硫酸酯酶，a _N_乙酰葡糖胺糖 苷酶，芳基硫酸酯酶A，半乳糖神经鞘氨醇酶，酸性a -葡萄糖苷酶，硫酯酶，己糖胺酶A，酸 性神经鞘磷脂酶，3 _半乳糖苷酶，和任何其他溶酶体贮积酶。溶酶体贮积症及其缺陷蛋白， 这些蛋白用作活化剂，列表如下 因此，采用本发明的方法可被治疗或预防的溶酶体贮积病包括但不限于粘多糖贮 积病I (MPS I)，MPS II，MPS IIIA，MPS IIIB，异染性脑白质营养不良(MLD)，克拉伯病，庞 皮病，神经细胞蜡样脂褐素症(CeroidLipofuscinosis)，泰-萨病，A型尼曼-皮克病/B型 尼曼_皮克病和其他溶酶体病。因此，根据上面的表格，就每一疾病而言，所述缀合剂应优选包含在这种疾病中缺 失的特异性活化剂酶。例如，对于涉及MPS I的方法，优选的化合物或酶是a-L-艾杜糖苷 酸酶。对于涉及MPS II的方法，优选的化合物或酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。对于涉及 MPS IIIA的方法，优选的化合物或酶是类肝素-N-硫酸酯酶。对于涉及MPS IIIB的方法， 优选的化合物或酶是a-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。对于涉及异染性脑白质营养不良(MLD)I的方法，优选的化合物或酶是芳基硫酸酯酶A。对于涉及克拉伯病的方法，优选的化合物或 酶是半乳糖神经鞘氨醇酶。对于涉及庞皮病的方法，优选的化合物或酶是酸性a-葡萄糖 苷酶。对于涉及CLN的方法，优选的化合物或酶是三肽基肽酶。对于涉及Tay-Sachs的方 法，优选的化合物或酶是a-己糖胺酶。对于涉及尼曼-皮克病A和B的方法，优选的化合 物或酶是酸性神经鞘磷脂酶。RAP环肽缀合物可包括一个或多个与RAP环肽连接的活化剂部分(如1-10或4-2 或2-3部分)。例如缀合反应可为1-4或更多个a -L-艾杜糖苷酸酶分子缀合到单一 RAP 环肽。这些制剂可以混合物使用，或它们被纯化为特异性RAP环肽-活化剂化学计量制剂。 本领域技术人员能确定哪种形式和哪种化学计量比是优选的。此外，为了促进被贮积的底 物更加完全降解，一个或多个不同的活化剂可连接到任何给定的RAP环肽分子。这些缀合 活化剂的RAP环肽可包括化学计量比的范围。它们也可分成纯化的混合物或以聚集物使 用。在融合体内RAP环肽和LSD的次序可能是重要的。因此，在一些实施方式中，所述RAP 环肽为N-端结合LSD酶，而在另一些实施例中，所述RAP环肽为C-端结合LSD酶。这些缀合活化剂的RAP环肽可进入或被转运进入或最终定位于属于或不属于CNS 的细胞的溶酶体中。这种缀合试剂的迁移效率可由调控受体转运活性的任何化合物或蛋白 调节。这类细胞可来自受溶酶体贮积症影响的任何组织或器官系统。例如这些细胞可为内 皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、心肌细胞、骨细胞、肺细胞、脂肪细胞、肾细胞或肝细胞。在一 些实施方式中，所述细胞优选为在BBB内发现的细胞。在一些实施方式中，所述细胞为神经 元或脑细胞。在其他实施方式中，所述细胞为外周的细胞或不能通过内皮组织从全身循环 分离的细胞，如BBB中的细胞。ii.药物活化剂通常，药物活化剂可为任何大小。优选的药物为能结合于目的靶点的有机小分子。 这种缀合物的药物部分为小分子时，常有至少约50D的分子量，通常为至少约100D分子量， 其中分子量可为500D大或更大，但通常不超过约2000D。在上述治疗方法的实施中，所述药物部分可与被给药的宿主内的靶点相互作用。 这种靶点为许多种不同类型夫的天然存在的结构，其中目的靶点包括细胞内或细胞外的靶 点，其中这些靶点可为蛋白、磷脂、核酸等，其中蛋白是优选的目标。特定的蛋白性的目的靶 点包括但不限于酶，如激酶、磷酸酶、还原酶、环氧合酶、蛋白酶等，靶点包含涉及蛋白-蛋 白相互作用的结构域，如SH2，SH3，PTB和PDZ结构域，结构蛋白，如肌动蛋白、微管蛋白等， 膜受体，免疫球蛋白，如IgE，细胞黏合受体，如整联蛋白等，离子通道，膜转运泵，转录因子， 信号蛋白等。在一些实施方式中，所述活化剂或药物具有羟基或氨基基团以与异氰酸酯试剂反 应或活化剂被化学修饰以便引入羟基或氨基基团以与异氰酸酯试剂反应。在一些实施方式中，所述活化剂或药物包括可被修饰和/或参与共价连接的区 域，优选活化剂没有所需的生物活性的丧失。所述药物部分通常包括带有一个或多个的上 述官能团取代的碳环或杂环结构和/或芳香或多芳香族结构。另外目的药物部分是可在生 物分子、蛋白、酶、多糖和多聚核酸中发现的结构，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、 衍生物、结构类似物或其组合。合适的活化剂包括但不限于精神药理学试剂，如(1)中枢神经系统抑制药物，例如，全身麻醉药(巴比妥类，苯二氮萆类，类固醇类，环己酮衍生物和杂项试剂)，镇静 催眠药(苯二氮萆类，巴比妥类，哌啶二酮类和三酮类，喹唑啉衍生物，氨基甲酸酯，醛及 衍生物，酰胺，无环酰脲，苯丙氮(benzazepines)和相关药物，吩噻嗪等)，中央随意肌 张力调节药物(抗惊厥药如乙内酰脲，巴比妥类，噁唑烷二酮，丁二酰亚胺类，无环酰脲 (acylureides)，戊二酰亚胺，苯二氮萆类，仲醇和叔醇，二苯阿嗪吡丁(dibenzaz印ine) 衍生物，丙戊酸及其衍生物，GABA类似物等)，止痛剂(吗啡及衍生物，东罂粟碱衍生物， 吗啡南衍生物，苯基哌啶，2，6-甲烷3-苯杂坐卡因(benzazocaine)衍生物，二苯基丙胺 (diphenylpropylamines)和等排物，水杨酸，对氨基苯酚衍生物，5_吡唑啉酮衍生物，芳基 乙酸(arylaceticacid)衍生物，芬那酸(fenamates)和等排物等)，以及止吐药(抗胆碱 能药物，抗组胺药物，抗多巴胺能药物等)，(2)中枢神经系统兴奋剂，例如，苏醒药(呼吸 兴奋剂，惊厥兴奋剂，精神运动兴奋剂)，麻醉药拮抗药(吗啡衍生物，东罂粟碱衍生物，2， 6-甲烷3-苯并噁嗪(benzoxacine)衍生物，吗啡南衍生物)促智药(3)精神药理学药物， 例如，抗焦虑镇静药物(苯二氮革类，丙二醇氨基甲酸酯)抗精神病药(吩噻嗪衍生物，硫 代黄嘌呤(thioxanthine)衍生物，其他三环类化合物，丁酰苯衍生物和等排物，二苯基丁 胺衍生物，取代的苯甲酰胺类，芳基哌嗪衍生物，吲哚衍生物等)，抗抑郁药(三环类化合 物，MA0抑制剂等)，⑷呼吸道的药物，例如，中枢性镇咳药(鸦片类生物碱及其衍生物)； 药效动力学制剂，如(1)周围神经系统的药物，如局部麻醉剂(酯衍生物，酰胺衍生物)， (2)作用于突触或神经感受器接触位点的药物，如胆碱能剂，胆碱能阻断剂，神经肌肉阻断 剂，肾上腺素能剂，抗肾上腺素剂，(3)平滑肌活性药物，如解痉药(抗胆碱能药物，向肌性 解痉药(musculotropic spasmolytics)，血管扩张剂，平滑肌兴奋剂，(4)组胺和抗组胺 药，如组胺和其衍生物(倍他唑)，抗组胺药(HI受体拮抗剂，H2受体拮抗剂)，组胺代谢药 物，(5)心血管药物，如强心剂(植物提取物，丁烯羟酸内酯，戊二烯醇(pentadienolids)， 来自格木(erythrophleum)属的生物碱，离子载体，肾上腺素受体兴奋剂等)，抗心律失常 药物，抗高血压药，降血脂剂(氯贝酸衍生物，烟酸衍生物，激素及类似物，抗生素，水杨酸 及衍生物)，抗静脉曲张药，止血剂，(6)血液和造血系统药物例如，抗贫血药品，血液凝固 的药物(止血剂，抗凝血剂，抗血栓剂，溶栓剂，血液蛋白及其成分)，(7)胃肠道药物，如助 消化剂(健胃药，利胆剂)，抗溃疡药物，止泻剂，(8)局部作用药物；化疗药物，如(1)抗感 染药，例如，杀体外寄生虫药(氯化烃，除虫菊素(pyrethins)，硫化化合物)，驱虫药，抗原 虫剂，抗疟疾药物，抗阿米巴药，抗利什曼虫药，抗毛滴虫剂，抗锥体虫剂，磺胺药，抗分支杆 菌药物，抗病毒化疗药等，(2)细胞生长抑制剂，即抗肿瘤药物或细胞毒类药物，如烷化剂， 如氮芥盐酸盐(氮芥，Mustargen，HN2)，环磷酰胺(Cytovan，Endoxana)，异磷酰胺(IFEX)， 苯丁酸氮芥(留可然)，美法仑(苯丙氨酸芥，L-溶肉瘤素，爱克兰，L-PAM)，白消安(马 利兰)，噻替哌(三亚乙基硫化磷酰胺)，卡氮芥(BiCNU，BCNU)，洛莫司汀(CeeNU，CCNU)， 链佐星(Zanosar)等，植物生物碱，如长春新碱(安可平)，长春碱(Velban，Velbe)，紫杉 醇(泰素)等，抗代谢药物，如甲氨喋呤(MTX)，巯基嘌呤(巯嘌呤，6-MP)，鸟嘌呤(6-TG) 和氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(Cytosar-U，Ara_C)，氮杂胞苷(Mylosar，5-AZA)等；抗生 素，如更生霉素(放线菌素D，Cosmegen)，多柔比星(阿霉素)，柔红霉素(duanomycin， Cerubidine)，去甲氧柔红霉素(Idamycin)，博莱霉素(Blenoxane)，普卡霉素(光神霉素， 光辉霉素)，丝裂霉素(自力霉素)等，以及其他抗细胞增殖剂，如羟基脲(羟基脲)，甲基苄胼(Mutalane)，达卡巴嗪(DTIC-Dome)，顺钼(钼)，卡钼(碳钼)，门冬酰胺酶(Elspar)，依 托泊苷(VePesid，VP-16-213)，安吖啶(Amsarcrine) (AMSA，m_AMSA))，米托坦(Lysodren), 米托蒽醌(Novatrone)等等。首选化疗药物是那些药物，其以游离形式在所需剂量下表现 不可接受的全身毒性。通过与RAP环肽连接，与这些药物的治疗水平相关的总体全身毒性 可降低。特别优选的是用于治疗但剂量受心脏毒性限制的心脏毒性化合物。一个典型的例 子是阿霉素(也称为多柔比星)及其类似物，如柔红霉素。RAP环肽与这种药物连接可以防 止活化剂和相关的心脏毒性在心脏积累。合适的活化剂包括但不限于抗生素如氨基糖苷类抗生素，如阿米卡星，安普霉 素，阿贝卡星，班贝霉素，布替罗星，地贝卡星，双氢链霉素，福提霉素，庆大霉素，异帕米星， 卡那霉素，小诺米星，新霉素，奈替米星，巴龙霉素，核糖霉素，西索米星，壮观霉素，链霉素， 妥布霉素，丙大观霉素；酰胺醇类(amphenicols)，如叠氮氯霉素，氯霉素，氟苯尼考和甲砜 霉素(theimaphenicol)；安莎霉素类，如利福酰胺，利福平，利福霉素，利福喷丁，利福昔 明4 -内酰胺类，如碳头孢烯类，碳青霉烯类抗生素，头孢菌素，头孢霉素(cehpamycins)， 单环内酰胺类，氧头孢烯(oxaphems)，青霉素；林可酰胺类抗生素，如氯林肯霉素 (clinamycin)，林可霉素；大环内酯类，如克拉霉素，地红霉素，红霉素等；多肽，如安福霉 素，杆菌肽，卷曲霉素等；四环素，例如阿哌环素，金霉素，氯莫环素等；合成抗菌剂，如2， 4- 二氨基嘧啶，硝基呋喃类药物，喹诺酮类及其类似物，磺胺类药，砜；合适的活化剂包括但不限于抗真菌剂，如多烯，如两性霉素B，克念菌素，制皮 菌素，菲利平，制霉色基素，曲古霉素，哈霉素，鲁斯霉素，甲帕霉素，纳他霉素，制霉菌素，培 西洛星，表霉素；合成抗真菌药物如烯丙基胺类，如布替萘芬，萘替芬，特比萘芬；咪唑类， 如联苯苄唑，布托康唑，氯海因，氯苄甲咪唑等，硫代氨基甲酸酯类，例如甲苯硫萘酯，三唑 类，如氟康唑，伊曲康唑，特康唑；合适的活化剂包括但不限于驱蠕虫药，如槟榔碱，绵马素，绵马酚，双氯酚，酸藤 子酚，苦苏素，萘(napthalene)，氯硝柳胺，石榴皮碱，奎纳克林，土木香内酯，阿莫卡嗪，硝 硫氰胺，驱蛔素，苄酚宁，双硫氰苯，四氯化碳，香芹酚，环苯达唑，乙胺嗪等；合适的活化剂包括但不限于抗疟药，如二乙酰氨苯砜，酚喹，蒿乙醚，蒿甲醚， 青蒿素，青蒿琥酯，阿托伐醌，比比林(bebeerine)，黄连素，基拉策，氯胍，氯喹，氯丙胍，金 鸡纳，辛可尼定，辛可宁，环氯胍，龙胆苦苷，氯氟菲醇，羟基氯喹，甲氟喹盐酸盐，3-甲基对 乙酰氨基苯胂酸(methylarsacetin)，扑疟喹啉，甲氧胺喹，伯氨喹，乙胺嘧啶，阿的平，奎尼 丁，奎宁，喹西特，喹啉，砷酸二钠；合适的活化剂包括但不限于抗原虫剂，如氯甲氧吖胺，替硝唑，异丙硝哒唑，乙 睇胺，喷他脒，乙酰胂胺，醋胺硝唑，茴香霉素，硝呋噁酮，替硝唑，联苯唑(benzidazole)，苏 拉明等等。作为活化剂的合适药物也已被列举在Goodman and Gilman ‘ s， ThePharmacological Basis of Therapeutics (第 9 版本)(Goodman 等编)(McGraw-Hill) (1996)；以及 1999 Physician' s Desk Reference (1998)。合适的活化剂包括但不限于如下美国专利公开的抗肿瘤药5，880，161,5，877，206, 5，786，344, 5，760，041, 5，753，668, 5，698，529, 5，684，004,5，665，715,5，654，484,5，624，924,5，618，813,5，610，292,5，597，831,5，530;,026, 5,,525，633,5，525，606,5，512，678, 5，508;,277,5，463:,181,5,,409，893，5，358;，952，5，318，965, 5，223，503,5，214，068,5，196;,424,5:’ 109;,024,5，106，996，5，101;,072,5，077，404,5，071，848，5，066，493,5，019,,390, 4;,996,,229,4,996，206，4，970,,318,4,968，800,4，962，114，4，927，828,4，892，887,4;,889,,859,4，886，790，4，882，334,4,882，333,4，871，746，4，863，955,4，849，563,4;,845，216,4,833，145，4，824，955,4，785，085,4，684，747，4，618，685,4，611;,066,4，550;,187,4,,550，186，4，544;,501,4,541，956,4，532，327，4，490，540,4,399;,283,4:’ 391;,982,4，383，994，4，294;,763,4,283，394,4,246，411，4，214，089,4，150,,231,4:’ 147;,798,4,056，673，4，029，661,4, 012，448 ；
如下美国专利公开的精神药理学的/丨治疗精神病药物
5，192，799, 5，036，070, 4，778，800, 4，753，951, 4，590，180，4，690，930，4，645;,773,4,427，694,4，424，202，4，440，781，5，686;,482, 5:’ 478;,828, 5，461，062，5，387;,593，5，387，586,5，256，664,5，192，799,5,120;,733,5，036;,070,4,,977，167，4，904;,663,4，788，188,4,778，800，4，753，951,4，690;,930, 4:’ 645;,773,4,,631，285，4，617;,314,4,613，600,4，590，180，4，560，684,4，548,,938,4:’ 529;,727,4,459，306，4，443,,451,4,440，781,4,427，694，4，424，202,4，397,,853,4;,358,,451,4,324，787，4，314,,081,4,313，896,4，294，828，4，277，476,4，267，328,4;,264，499,4，231，930，4，194，009,4，188，388,4,148，796，4，128，717,4,062，858,4;,031，226,4，020，072，4，018，895, 4,,018，779,4，013，672, 3，994，898, 3，968;,125,3，939;,152,3,,928，356，3，880，834，3，668，210 ；
如下美国专利公开的心血管药物
4，966，967, 5，661，129, 5，552，411,5，332，737, 5，389，675,5，198，449，5，079;,247,4,966，967,4，874，760，4，954，526,5，051;,423,4:’ 888;,335,4，853，391，4，906;,634,4,775，757,4,727，072，4，542，160,4,522,,949,4;,524,,151,4,525，479，4，474,,804,4,520，026,4，520，026，5，869，478，5，859，239, 5;,837，702,5,807，889，5，731，322，5，726，171,5,723，457，5，705，523,5，696;,111,5，691:，3 3 2，5，,679，672，5，661;,129,5,654，294,5,646，276，5，637，586，5，631;,251, 5:’ 612;,370，5，612，323，5，574;,037, 5，563，170，5，552，411，5，552，397,5，547,,966, 5:,482,,925，5，457，118，5，414,,017,5,414，013，5，401，758，5，393，771,5,362,,902, 5;,332,,737,5,310，731，5，260,,444,5,223，516,5,217，958，5，208，245,5，202，330, 5;,198，449，5，189，036，5，185，362，5，140，031, 5，128，349，5，116，861, 5，079，247, 5;,070，099,5，061，813，5，055;,466,5,,051，423,5，036，065，5，026，712，5，OIL,931,5，006;,542,4,,981，843，4，977;,144,4,971，984,4，966，967，4，959，383,4,954;,526,4:’ 952;,692,4，939，137，4，906;,634,4,889，866,4，888，335，4，883，872,4，883,,811, 4;,847,,379,4,835，157，4，824,,831,4,780，538,4,775，757，4，774，239,4，771，047,4;,769,,371,4,767，756，4，762，837,4，753，946,4，752，616，4，749，715,4,738，978,4;,735，962,4,734，426，4，734，425,4，734，424,4,730，052，4，727，072,4，721，796,4’ 707;,550,4,,704，382，4，703;,120,4,681，970,4,681，882，4，670，560,4,670;,453,4，668,787,4,,663，337，4，663;,336,4，661，506,4，656，267，4，656，185,4,654;,357,4:’ 654;,356,4，654，355，4，654;,335,4，652，578,4,652，576,4，650，874,4;,650;,797,4，649:,139,4,,647，585，4，647;,573,4,647，565,4，647，561,4，645，836,4;,639;,461,4:’ 638;,012,4,638，011，4，632;,931,4,631，283,4,628，095,4，626，548,4,,614,,825, 4;,611,,007,4,611，006，4，611,,005,4，609，671,4,608，386,4,607，049,4,,607，048,4;,595,,692,4，593，042，4，593，029,4,591，603,4，588，743,4，588，742,4，588，741,4;,582，854,4,575，512，4，568，762,4,560，698,4，556，739,4，556，675,4;,555;,571,4，555;,570,4,,555，523，4，550;,120,4,542，160,4,542，157,4,542，156,4;,542;,155,4:’ 542;,151,4,537，981，4，537;,904,4,536，514,4,536，513,4,533，673,4;,526,,901,4:’ 526,900,4，525，479，4，524,,151,4,522，949,4，521，539,4，520，026,4,,517,,188,4;,482,,562,4,474，804，4，474,,803,4，472，411,4,466，979,4，463，015,4,456，617,4;,456，616,4,456，615，4，418，076,4,416，896,4，252，815,4,220，594,4,190，587,4;,177,280,4，164，586，4，151，297,4，145，443,4，143，054,4，123，550,4;,083;,968,4，076:,834,4,,064，259，4，064;,258,4，064，257,4，058，620,4，001，421,3;,993;,639,3:’ 991;,057, 3，982，010，3，980;,652,3,968，117,3,959，296，3，951，950, 3,,933,,834, 3:’ 925,,369,3，923，818，3，898,,210，3，897，442,3，897，441,3,886，157，3,,883,,540, 3;,873,,715,3,867，383，3，873，715，3，867，383，3，691，216，3，624，126
如下美国专利公开的抗微生物剂
5，902，594, 5，874，476, 5，874，436, 5，859，027, 5，856，320,5，854，242，5，811;,091, 5，786，350，5，783，177,5,773，469, 5;,762;,919，5’ 753;,715,5,,741，526，5，709;,870,5，707，990,5，696，117,5,684，042,5;,683;,709, 5:’ 656;,591,5,643，971，5，643;,950,5，610，196,5,608，056，5，604，262, 5,,595,,742，5:,576,,341,5,554，373，5，541,,2 3 3，5，534，546，5，534，508，5，514，715，5,,508，417，5;,464,,832, 5，428，073，5，428，016，5，424，396,5，399，553, 5，391，544,5，385，902,5;,359，066,5，356，803，5，354，862,5，346，913,5,302，592,5,288，693，5，266，567,5’ 254,685, 5,,252，745，5，209;,930,5，196，441,5,190，961, 5，175，160，5:,157;,051,5,096;,700, 5,,093，342，5，089;,251,5，073，570,5，061，702,5，037，809, 5;,036;,077,5:’ 010;,109,4,970，226，4，916;,156,4,888，434,4，870，093,4，855，318,4,,784,,991, 4;,746,,504,4,686，221，4，599,,228,4,552，882,4，492，700,4,489，098,4，489，085,4;,487,776,4,479，953，4，477，448,4,474，807,4，470，994,4，370，484,4,337，199,4;,311，709,4,308，283，4，304，910,4,260，634,4，233，311,4,215，131,4;,166;,122,4’ 141;,981,4,,130，664，4，089;,977,4,089，900,4，069，341,4,055，655,4;,049;,665,4:,044;,139,4,002，775，3，991;,201，3，966，968，3，954，868,3，936，393, 3;,917,,476, 3:,915;,889, 3，867，548，3，865，748，3，867，548，3，865，748，3，783，160，3，764，676，3，764，677 ；
如下美国专利公开的抗炎药
5，872，109, 5，837，735, 5，827，837, 5，821，250, 5，814，648,5，780，026，5，776;,946,5，760，002,5，750，543, 5，741，798, 5;,739;,279, 5:’ 733;,9 3 9 j 5，723，481，5，716;,967, 5，688，949,5，686，488,5，686，471, 5;,686;,434,5，684:,204,5,,684，041，5，684;,031, 5，684，002, 5，677，318,5,674，891,5;,672;,620,5:’ 665;,752，5，656，661，5，635;,516,5,631，283，5，622，948，5，618，835, 5,,607,,9 5 9 j 5.,593,,980, 5，593，960，
385580888, 5552424, 5552422, 5516764, 5510361，5508026, 5500417，5498405, 5494927, 5476876,5472973,5470885,5470842,5464856，5464849,5462952,5459151，5451686, 5444043, 5436265, 5432181，RE034918，5，393，756,5，380，738,5，376，670, 5，360，811,5，354，768, 5348957，5347029, 5340815，5338753, 5324648, 5319099,5318971, 5312821，5302597, 5298633, 5298522,5298498,5290800,5290788,5284949，5280045,5270319,5266562，5256680, 5250700,5250552, 5248682，5244917，5240929，5234939，5234937, 5232939, 5225571, 5225418，5220025, 5212189，5212172，5208250,5204365,5202350,5196431，5191084,5187175,5185326,5183906, 5177079, 5171864, 5169963，5155122，5143929，5143928，5143927, 5124455, 5124347, 5114958，5112846,5104656, 5098613，5095037, 5095019，5086064,5081261，5081147，5081126,5075330,5066668,5059602, 5043457, 5037835，5037811,5036088, 5013850，5013751, 5013736，5006542,4992448，4992447,4988733,4988728,4981865,4962119,4959378,4954519，4945099,4942236,4931457,4927835,4912248,4910192,4904786，4904685,4904674,4904671,4897397,4895953,4891370,4870210，4859686,4857644,4853392,4851412,4847303,4847290,4845242，4835166,4826990,4803216,4801598,4791129,4788205,4778818，4775679,4772703,4767776,4764525,4760051,4748153,4725616，4721712,4713393,4708966,4695571,4686235,4686224,4680298，4678802,4652564,4644005,4632923,4629793,4614741,4599360，4596828,4595694,4595686,4594357,4585755,4579866,4578390，4569942,4567201,4563476,4559348,4558067,4556672,4556669，4539326,4537903,4536503,4518608,4514415,4512990,4501755，4495197,4493839,4465687,4440779,4440763,4435420,4412995，4400534,4355034,4335141,4322420,4275064,4244963,4235908，4234593,4226887,4201778,4181720,4173650,4173634,4145444，4128664,4125612,4124726,4124707,4117135,4027031,4024284，4021553,4021550,4018923,4012527,4011326，3998970，3998954，3993763，3991212，3984405, 3978227, 3978219，3978202, 3975543，3968224, 3959368, 3949082, 3949081, 3947475,3936450,3934018，3930005, 3857955,3856962,3821377,3821401, 3789121，3789123，3726，978，3，694，471，3，691，214，3，678，169，3，624，216 ；
如下美国专利公开的免疫抑制剂
4，450，159, 4，450，159, 5，905，085, 5，883，119,5,880，280,5，877，184，5874594，5843452, 5817672, 5，817，661, 5817660, 5801193，5，776，974，5763478, 5739169，5723466,5，719，176,5696156,5695，753,5，693，648，5，693645,5691346,5686，469，5，686，424, 5，679，705, 5679，640，5，670，504，5，665;,774,5，665，772, 5，648，376,5，639，455, 5,633;,277,5,624,930, 5,,622，970，5，605;,903, 5:’ 604，229,5，574，041,5，565，560,5,,550;,2 3 3，5 ■’ 545;,734,5,540，931，5，532;,248, 5;,527，820,5，516，797，5，514，688，5，512,,687, 5;,506,,2 3 3，5，506，228，5，494,,895, 5;,484，788，5，470，857,5，464，615，5，432，183，5;,431,,896,5，385，918，5，349，061, 5;,344，925, 5，330，993, 5，308，837,5，290，783,5;,290，772,5,284，877，5，284，840,5,,273，979,5，262，533,5，260，300,5;,252;,732,5，250;,678,5,,247，076，5，244;,896,5:’ 238，689,5，219，884，5，208，241, 5,,208;,228, 5:’ 202;,3 3 2，5，192，773，5，189;,042, 5;,169，851, 5，162，334,5，151，413，5,,149,,701，5:’ 147;,877,5,143，918，5，138,,051, 5;,093，338,5，091，389,5，068，323,5，068,,247, 5;,064,,835,5，061，728，5，055,,290,4;,981，792,4,810，692,4，410，696,4，346，096,4;,342，769,4,317，825，4，256，766，4，180，588，4，000，275，3，759，9219
如下美国专利公开的免疫调节剂
4，446，128, 4，524，147, 4，720，484, 4，722，899, 4，748，018,4，877，619，4，998;,931, 5:’ 049，387,5，118，509,5，152，980, 5,,256;,416, 5:’ 468;,729,5,583，139，5，604;,234, 5;,612，060,5，612，350,5,658，564,5,672,,605, 5;,681,,571,5,708，002，5，723,,718, 5;,736,143，5，744，495,5，753，687, 5，770，201, 5;,869，057, 5，891，653，5，939，455, 5;,948，407,6，006，752,6，024，957,6，030，624,6,037，372,6,037，373，6，043，247,6,,060，049,6，087，096,6，096，315,6,099，838,6,,103，235,6，124，495，6，153;,203,6’ 169，087,6，255，278,6，262，044,6;,290;,950,6，306;,651,6,,322，796，6，329;,153,6:’ 344，476,6，352，698,6，365，163,6,,379;,668,6:’ 391;,303,6，395，767，6，403;,555,6,,410，556,6,412，492,6，468，537,6，489,,330, 6;,521,,232,6,525，035，6，525，242，6，558，663，6，572，860 ；
如下美国专利公开的止:痛剂
5，292，736, 5，688，825, 5，554，789, 5，455，230, 5，292，736,5，298，522，5，216;,165，5:’ 438，064,5，204，365,5，017，578,4,,906,655,4:’ 906,655,4，994，450，4，749;,792，4，980，365,4，794，110,4,670，541,4;,737,493,4,622;,326,4,,536，512，4，719;,231,4:’ 533，671,4,552，866,4，539，312,4,,569,942,4’ 681;,879,4,511，724，4，556;,672,4;,721，712,4,474，806,4，595，686,4，440,,779,4,434,,175,4,608，374，4，395,,402, 4;,400，534,4，374，139,4,361，583,4，252，816,4;,251,,530,5，874，459，5,688，825, 5;,554，789,5，455，230,5，438，064,5，298，522,5;,216，165,5,204，365，5，030，639,5,,017，578,5,008，264,4,994，450,4，980，365,4,,906;,655,4,,847，290，4，844;,907,4:’ 794，110,4,791，129,4,774，256,4;,749;,792,4,737;,493,4,,721，712，4，719;,231,4:’ 681，879,4，670，541,4,667，039,4,,658;,037,4:’ 634;,708,4,623，648，4，622;,326,4;,608，374,4，595，686,4，594，188,4,569,,942,4,556,,672,4,552，866，4，539,,312, 4;,536，512,4,533，671,4,511，724,4，440，779,4,434,175,4,400，534，4，395，402,4;,391，827,4，374，139,4,361，583,4，322，420,4;,306，097,4，252，816，4，251，530,4,,244，955,4，232，018,4,209，520,4;,164;,514,4’ 147;,872,4,,133，819，4，124，713,4,L17, 012,4, 064，272,4, 022，836，3，966，944 ；
如下美国专利公开的拟胆碱剂
5，219，872, 5，219，873, 5，073，560, 5，073，！560，5，346，911,5，424，301，5，073;,560,5，219，872,4，900，748,4，786，648，4，798’841,4’ 782,071,4,710，508，5，482;,938,5，464，842, 5，378，723,5，346，911，5，318:’ 978,5:’ 219;,873,5，219，872，5，084;,281,5,073，560,5,002，955,4，988，710，4，900;,748, 4;,798,,841,4,786，648，4，782，071,4, 745，123,4, 710，508 ；
如下美国专利公开的肾上腺素能剂
5，091，528, 5，091，528, 4，835，157, 5，708，丨315，5，594，027,5，580，892，5，576:’ 3 3 2，5，510，376，5，482，961, 5，334，601，5，202，347,5，135;,926, 5,,116，867，5，091;,528,5，017，618,4,835，157,4,829，086，4，579，867,4，568;,679,4,469，690，4，395;,559,4，381，309,4，363，808,4，343，800，4，329:’ 289,4:’ 314;,943,4,311，708，4，304;,721,4,296，117,4,285，873,4，281，189，4，278;,608, 4;,247,,710,4,145，550，4，145,,425,4,139，535,4，082，843,4，011，321，4，001;,421, 3;,982,,010，3，940，407，3，852，468，3，832,470 ；
如下美国专利公开的抗组胺剂
5，874，479, 5，863，938, 5，856，364, 5，770, I312,5,702，688,5，674，912，5，663;,208,5，658，957,5，652，274, 5，648，380，5，646，190，5，641:,814,5,633，285，5，614;,561，5，602，183,4,923，892,4，782，058，4，393:’ 210,4:’ 180;,583,3，965，257，3，946，022，3，931，197 ；
如下美国专利公开的留体试剂
5，863，538, 5，855，907, 5，855，866, 5，780，！592，5，776，427,5，651，987，5，346;,887,5，256，408,5，252，319，5，209，926，4，996，335,4,927,807,4,910，192，4，710:’ 495,4,049，805,4，004，005, 3，670，079，3,,608，076,5,892:’ 028,5,,888，995，5，883:’ 087, 5，880，115,5,869，475,5，866，558，5，861，390,5，861:,388, 5，854，235，5，837;,698,5，834，452, 5，830，886，5，792，758，5，792:’ 757，5:’ 763;,361, 5，744，462，5，741;,787,5,741，786，5，733，899,5，731，345，5，723:’ 638, 5:’ 721;,226,5,712，264，5，712;,263,5,710，144,5,707，984,5，705，494，5，700;,793, 5;,698,,720,5,698，545，5，696,,106,5,677，293,5,674，861，5，661，141，5，656;,621, 5;,646:’ 136, 5,,637，691，5，616:’ 574,5,614，514，5，604，215，5，604，213，5,,599，807,5，585:’ 482, 5,,565，588，5，563;，2 5 9，5，563，131，5，561，124，5，556，845，5，547，949,5，536;,714,5,527，806，5，506;,354,5，506，221,5,494，907,5，491，136，5，478:’ 956, 5:’ 426;,179,5,422，262，5，391;,776,5,382，661, 5，380，841, 5，380，840，5，380;,839, 5:’ 373,,095, 5，371，078，5，352,,809,5，344，827, 5，344，826,5，338，837，5，336;,686, 5;,292,,906,5，292，878，5，281,,587,5，272，140,5,244，886,5，236，912，5,,232，915,5，219:’ 879, 5,,218，109，5，215:’ 972,5，212，166，5，206，415，5，194，602，5，166，201,5’ 166:,055, 5,,126，488，5，116;,829, 5，108，996,5，099，037, 5，096，892，5，093，502,5，086;,047,5,084，450，5，082;,835, 5，081，114,5,053，404,5，041，433，5，041:’ 432,5:’ 034;,548,5，032，586，5，026;,882,4，996，335,4，975，537,4，970，205，4，954;,446,4,950,,428,4,946，834，4，937,,237,4,921，846,4，920，099,4，910，226，4，900;,725, 4;,892,,867,4,888，336，4，885，280,4,882，322,4，882，319,4,882，315，4,,874，855,4，868:’ 167,4,,865，767，4，861，875,4，861，765,4，861，763,4，847，014,4，774，236,4，753，932,4，711，856, 4，710，495,4，701，450,4，701，449,4，689，410,4，680，290,4，670，551,4，664，850, 4，659，516,4，647，410,4，634，695,4，634，693,4，588，530,4，567，000,4，560，557, 4，558，041,4，552，871,4，552，868,4，541，956,4，519，946,4，515，787,4，512，986, 4，502，989，4，495，102 ；上述所有公开内容以参考方式并入本申请。所述缀合物的药物部分可为整个药物或其结合片段或部分，该结合片段或部分保 持其亲和力和对目的靶点特异性，同时具有一连接位点以便共价连接载体蛋白配体或连接 体。这些药物的缀合物可与药物自身一样用于相同的失调症、疾病和适应证。iii.优选的肿瘤化疗性化学的活化剂优选用于本发明的RAP环肽缀合物的肿瘤化疗剂包括可以其游离形式用于治疗 在脑内或脑附近的脑瘤或其他瘤形成，或如果其游离形式对这些肿瘤没有效果，而当连接 RAP环肽时有效果的所有的药物。这些化疗剂优选为细胞毒性化疗剂，包括但不限于对阿霉 素(也称为多柔比星)，顺钼，紫杉醇及其类似物，以及体内外表现抑癌活性的其他化疗剂。 这种化疗剂还包括烷化剂，抗代谢药物、天然产物(如长春花生物碱，表叶毒素，抗生素，酶 和生物反应调节剂)、拓扑异构酶抑制剂，微管抑制剂，纺锤体毒素，激素及拮抗剂，以及杂 项药剂如钼配位络合物，蒽二酮，取代的尿素等，本领域技术人员将了解其他化疗剂。用于治疗癌症或瘤形成的细胞毒性放射性同位素包括但不限于，mI (碘)，125I, 111In (铟)，9°Y(钇)，67Cu (铜)，127Lu (镥)，212Bi (铋)，213Bi，255Fm(镄)，149Tb (铽)，223Rd(镭)， 213Pb (铅),212Pb, 211At (砹),89Sr(锶),153Sm (钐)，166Ho (钬)，225Ac(锕)，186Re (铼)， 67Ga (镓)，68Ga和99mTc (锝)，可缀合到本发明所述的RAP环肽。为此目的使用本领域常用的 金属螯合剂，该放射性同位素可与多肽连接，该金属螯合剂包括但不限于1，4，7，10_四氮 杂环-11-十二烷州力，』”，^”-四乙酸(0(7^)，1，4，8，11-四氮杂环十四烷州力'，N"， N"‘-四乙酸(TETA)，二乙烯三胺戊-乙酸酯(diethylene triamine penta-acetate) (DTPA)，二巯基琥珀酸(DMSA)，四氮杂环十三烧(tetraazacyclotridecane)-N，N'，N"， N"‘-四乙酸(TRITA)，以及 1，5，9，13-四氮杂环十六烧(tetraazacyclohexadecane)-N， N ‘，N 〃，N 〃 ‘-四乙酸(HETA)，羟基亚乙基二 膦酸酯(hydroxyethylidene diphosphonate) (HEDP)，HEXA，和乙二胺四乙酸(EDTA)的，它们允许将放射性同位素“装 载”在多肽上。优选的化疗剂是那些以其游离形式在所需剂量下表现出不可接受的全身毒性的 药物。其通过与RAP环肽连接，与这种药物的治疗水平相关的总体全身毒性降低。特别优 选的是用于治疗但剂量受心脏毒性限制的心脏毒性化合物。一个典型的例子是阿霉素(也 称为多柔比星)及其类似物，如柔红霉素。这些药物连接RAP环肽可减少在心脏的积聚和 伴随的心脏毒性。。iv.复合糖复合糖是其中包括碳水化合物部分的任何分子。例子包括但不限于，糖蛋白、寡糖、糖脂质和蛋白多糖。这些分子具有如提高治疗剂的生物利用度的有益功能，或如阻止发 病机制的能力。例如，α-L-艾杜糖苷酸酶是一复合糖(糖蛋白)，由于低聚甘露糖7-二磷 酸盐决定子吸附这种酶，它可广泛地分布在全身。硫酸肝素是一蛋白多糖的碳水化合物部 分，其在人体内用于阻止凝血途径。合适的RAP环肽与带有治疗活性复合糖的连接可通过影响生物分布提供一种增加这种复合糖效力的手段。或者，RAP环肽的复合糖融合体可被 设计成作为双特异性受体结合的分子，该分子在特定组织具有直接影响一个或多个受体分 子功能的能力。v.纳米粒 纳米粒是生物可降解的和非生物可降解聚合物构成的或其他材料如脂类构成的 大分子集合。这些集合可被设计为在颗粒内的空腔里包含治疗分子。通过这种方式，纳米 粒提供了改变药物的生物分布、药代动力学、免疫原性和效力的手段。连接适宜的RAP环肽 将反过来提供增加这些分子组织分布特异性的手段。E.制备RAP环肽的方法RAP环肽优选通过共价键的形成而环化，这些共价键可通过本领域所描述任何方 法形成。在一些实施方式中，所述共价键在肽的N端氨基酸和C端氨基酸之间形成。在一 些实施方式中，所述共价键在两末端氨基酸的支链之间形成。在其他实施中，所述共价键在 一末端氨基酸的支链和另一末端氨基酸的末端基团之间形成，或每个末端氨基酸的末端基 团之间形成。如，头_尾、支链_支链、支链-头、支链_尾均有可能。自然环化的RAP肽可以通过在目的位点插入2个半胱氨酸并容许这些半胱氨酸自 然形成二硫键很容易地设计。甘氨酸或脯氨酸可插入到半胱氨酸内(如C端到最远N端-半 胱氨酸和N端到最远C端-半胱氨酸)以使因RA蛋白天然三维结构的共价键导致的任何 结构扭曲最小化。末端氨基和末端羧基基团偶联的头_尾环化可采用许多方法进行，如采用P-硝基 苯基酯、叠氮化合法、2，4，5-三氯苯酯和五氟代苯酯，混合酸酐法，碳二亚胺伴有催化剂如 HOBt或HONSu或HoAt或HATU，DIC, DCC,或在树脂上的环化。此外，这种环化结构可用桥连基团、肽的氨基酸残基的支链或肽的末端氨基酸残 基形成。桥连基团是一种让肽的两部分得以环化的化学部分。桥连基团的非限定性实例包 括酰胺、硫醚、硫酯、二硫化合物、脲、氨基甲酸酯、磺胺类物质等。本领域公知合并具有这些 桥连基团的单元的各种方法，。例如，内酰胺桥(例如环酰胺)可通过具有氨基和羧酸的氨 基酸的支链而形成，如赖氨酸、鸟氨酸和谷氨酸或门冬氨酸。硫酯可在半胱氨酸残基的C端 和支链之间形成。或者，硫酯可通过具有巯基和羧酸的氨基酸的支链之间形成。或者，可采用结合羊毛硫氨酸(硫二丙氨酸)残基连接通过硫醚键共价连接在一 起的丙氨酸残基形成交联。另一种方法中，交联剂，诸如二羧酸，例如软木酸(辛二酸)等， 可引入二个氨基酸支链的官能团之间的连接，如游离氨基、羟基、巯基及其组合。也可采用酶催化的环化。例如，据报道短杆菌酪肽合成酶的硫酯酶结构域可用于 环化硫酯前体，枯草杆菌蛋白酶突变体可用于环化肽苯丙氨酰胺羟乙酸酯，以及抗体连接 酶16G3可用于催化对硝基苯酯的环化。就肽的环化综述，参见Davies，J. Peptide Sci., 9 471-501 (2003)，通过引用将其全文结合到本文中。F. RAP肽的制备i.合成本发明的肽可按照常规技术采用液相固相或液相肽合成技术而合成。多种自动 化合成仪是市售的，可按照已知方法使用。参见例如Stewart和Young，固相肽合成，第2 片反，Pierce chemical co. ， (1984) ；Tam J. Am. Chem. soc. 105 6442,1983 ；Merrifield,Science 232 :341_347，1986 ；以及 Barany 和 Metrifield， The Peptides, Gross 和 Meienhofer 编辑，Academic Press, New York, 1284 ；Barany 等，Int.J. PeptideProtein Res. 30 :705-739,1987 ；Bodanszky, The Principles of PeptideSynthesis, 第 2 版， Springer, New York(1993)；以及 Molina 等，P印t. Res. 9 151-5，1996，美国专利 5，424，398，和Fischer 等，Journal of PeptideScience 8 :529_542，2002，所述每个文献都 通过引用结合到本文中。
例如，可采用液相技术如叠氮化物法，酸氯化法，酸酐法，混合酸酐法，活性酯法 (如对硝基苯酯，N-羟基丁二酰亚胺酯，或氰甲基酯)，碳二亚胺法，氧化还原法，或二环己 基碳二亚胺(DCXD)/添加法。固相肽合成方法使用含有0. 1-1. OmMol胺/g聚合物的苯乙烯-二乙烯基苯共聚 物。这些用于肽合成的方法使用α -氨基的丁氧基羰基(t-B0C)或9-芴甲氧基羰基(FMOC) 保护。两种方法都涉及分步合成，其中在每个步骤由肽的C端开始加入单个氨基酸(参见 coligan 等，current Protocols inlmmunology, wiley Interscience, 1991,第 9 单兀)。 在完成化学合成后，通过用酸在降低的温度处理(例如液态HF-10%苯甲醚，在0°C约0. 25 至约1小时)，所述肽脱去t-B0C或FMOC氨基酸封闭基团，从聚合物上切下。在蒸发试剂 后，用1 %乙酸溶液将肽从聚合物中萃取出来，然后冻干，得到粗产物。粗产物一般可通过例 如在Sephadex G-15上使用5%乙酸作为溶剂进行凝胶过滤的技术来纯化。柱子的适宜馏 分冻干将得到均一的肽或肽衍生物，然后其可通过诸如氨基酸分析、薄层层析、高效液相层 析、紫外吸收分光光度法、摩尔旋光法、溶解性等标准技术来鉴定，并通过固相Edman降解 定量。液相技术包括可逆地连接聚乙二醇的多肽链的合成装配，是传统的溶液化学和固 相化学的混合体。这种方法采用常用于固相肽合成中N-芴甲氧羰基技术和在反复的氨基 脱保护步骤中氟离子替代传统的有机碱哌啶而进行。参见Fischer等，Journal of Peptide Science 8 :529_542，2002。ii.宿主细胞用于制备嵌合蛋白的宿主细胞可是细菌、酵母、昆虫、非哺乳类脊柱细胞或哺乳动 物细胞。所述哺乳动物细胞包括但不限于仓鼠、猴子、黑猩猩、狗、猫、牛、猪、小鼠、大鼠、兔、 绵羊或人细胞。所述宿主细胞可是永生化细胞(细胞系)或非永生化(原代或二代)细胞， 以及可是任何类型的细胞种类，诸如，但不限于成纤维细胞，角质化细胞，上皮细胞(如，哺 乳动物上皮细胞、肠上皮细胞)，卵巢细胞(如中国仓鼠卵巢或CHO细胞)，上皮细胞，胶质 细胞，神经细胞，血液的有形成分(如淋巴细胞、骨髓细胞)，肌肉细胞，肝细胞和这些体细 胞类型的前体。宿主细胞可包括不表达LRP的CHO细胞的突变体，如CH013-5-1 (FitzGerald 等人，J. Biol. Chem.，129(6) :1533_41，1995)。包含和表达编码所述嵌合蛋白的DNA或RNA的细胞在此处是指遗传基因修饰细 胞。包含和表达编码所述嵌合蛋白的DNA或RNA的哺乳动物细胞在此处是指基因修饰的哺 乳动物细胞。这些DNA或RNA导入细胞可采用公知的转染方法，如电穿孔，显微注射，微粒 轰击，磷酸钙沉淀，改良磷酸钙沉淀，阳离子脂质体处理，光穿孔(photoporation)，融合方 法，受体介导的转化，或1，5-二甲基-1，5-二氮i^一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)沉淀。 或者，这些DNA或RNA可采用病毒载体感染导入。表达编码嵌合蛋白的DNA或RNA的细胞的制备方法，包括哺乳动物细胞，正如美国专利号6，048，729，5，994，129和6，063，630中所 描述。这些申请的每一篇的教导以其全文作为参考结合到本文中。iii.核酸构建体用来表达嵌合蛋白的核酸构建体可为在转化的哺乳动物细胞的染色体外(游离 基因的)表达的核酸构建体或为以随机地或通过同源重组预定的靶点整合进入接受细胞 的基因组内的核酸构建体。染色体外表达的构建体包含，除了嵌合蛋白编码序列外，还包含在细胞内足以表达所述蛋白的序列和任选足以复制这些构建体的序列。它典型地包括启动 子、嵌合蛋白编码DNA和聚腺苷酸化位点。编码嵌合蛋白的DNA采用它的表达处于启动子 的控制之下这样的方式放置于构建体中。任选地，这种构建体可包含额外的诸如一个或多 个下列成分剪切位点、增强子序列、在适当的启动子控制下的选择标记基因，和在适当的 启动子控制下的可扩增标记基因。在那些DNA构建体整合至细胞基因组的实施方式中，它仅需要包含编码嵌合蛋白 的核酸序列。任选地，它包括启动子和增强子序列、聚腺苷酸化位点、一个或多个剪切位点、 编码一个或多个选择性标记的核酸序列、编码一个或多个的可扩增标记基因和/或接受细 胞基因组DNA的DNA同源序列，以靶向所述DNA整合至基因组选定的位点(靶向DNA或DNA 序列)。iv.细胞培养方法含有编码嵌合蛋白的DNA或RNA的哺乳动物细胞在适宜所述细胞生长和DNA或 RNA表达的条件下培养。那些表达所述嵌合蛋白的细胞可采用公知技术和本文所述的技 术而鉴定，可采用公知技术和本文所述的技术分离和纯化所述嵌合蛋白，或利用或不利用 嵌合蛋白产物的扩增。鉴定可通过如下方法进行，如通过筛选基因修饰的哺乳动物细胞， 所述哺乳动物细胞显示出编码嵌合蛋白的DNA或RNA存在的的表型迹象，诸如PCR筛选， Southern印迹分析的筛选，或嵌合蛋白表达分析的筛选。具有合并编码嵌合蛋白的DNA的 细胞的选择可通过以下完成DNA构建体中包含选择性标记和在仅适宜表达选择性标记基 因的细胞能存活的条件下培养包含选择性标记基因的转染的或感染的细胞。进而这种导入 的DNA构建体的扩增可通过在适宜扩增的条件下培养基因修饰的哺乳动物细胞而被影响 (如在存在仅使包含多拷贝可扩增标记基因的细胞存活的药物浓度的条件下培养包含可扩 增标记基因的基因修饰的哺乳动物细胞)。如本文所描述，表达嵌合蛋白的基因修饰的哺乳动物细胞可通过表达产物的检测 而被鉴定。例如，其中所述载体为为RAP环肽的表达嵌合蛋白的哺乳动物细胞可采用夹心 酶免疫方法来鉴定。抗体可直接导向RAP部分或所述缀合物的活化剂部分。v. RAP肽的纯化采用本领域公知技术RAP肽可通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化。参见， 如，“The Handbook of Analysis and Purification of Peptides andProteins by Reversed-Phase HPLC，，，第 3 版，Grace Vydac, W. R. Grace &Co.，Columbia, MD (2002)。乙 腈和含三氟乙酸的水的梯度混合液常作为洗脱液。通常采用制备的RP-HPLC纯化毫克和克 级合成肽，和纯化毫克级到公斤级的用于治疗的重组制备的多肽，。RAP肽也可如WO 2006/138343 (Zankel等人)所述制备和纯化，以其全文作为参考 结合到本文中。
RAP肽也可在偶联适当的CR对的琼脂糖珠上采用亲合层析法来纯化。这个技 术可单独采用或作为RP-HPLC后的下一步骤。包含CR对或三联体的含有CR的蛋白片段 按照下列描述制备。编码每CR对或三联体的DNA片段可采用HotStart PfuTurbo 聚 合酶和试剂(Stratagene)从人 cDNA(BDBiosciences Marathon-ready )PCR 扩增得 至IJ。每种扩增片段连续地采用BamHI和HindIII相继酶切，然后与相似的消化的pET30 (+) a (EMDBiosciences)连接。得到的质粒编码由融合至CR片段的N-端六聚组氨酸和S-肽组 成的蛋白片段。对所有的表达构建体测序以确定植入片段的完整性。然后将每一质粒用于 转化BL21 (DE3) CodonPlus- RIPL 细胞(Stratagene)。正，所述CR片段如前所述表达和 再折叠，并按照制造商的手册(Qiagen)采用Ni-NTA层析纯化。活化的琼脂糖珠AfTiGel 15，Bio-Rad)被移入一 IOmL玻璃化的塑料柱(Pierce)内。小珠采用3倍体积的含5mMCaC12 缓冲液的IOmM HEPES, IOOmM NaCl溶液清洗2次。然后加入CR片段(2. 5mg/mL填充珠，含 在5倍柱体积相同缓冲液中)，然后混合物在室温下混合孵育过夜。小珠接着用缓冲液清洗 直至用Bradford方法检测在洗脱液中没有蛋白存在。小珠储存在20%乙醇中直至使用。 TBS中的RAP肽加到已平衡的CR交联珠中lmg/mL填充珠)，然后室温下混合孵育2小时。 小珠用相同缓冲液清洗，然后结合肽被含IOOmM EDTA的TBS洗脱。G. RAP缀合物的鉴定 i.标记在一些实施方式中，标记RAP环肽或它的缀合物以便于检测。“标记”或“可检测的 部分”是为可通过分光的、光化学的、生化的、免疫化学的、化学的或其他物理方法检测的组 合物。例如，适合用于本发明的标记包括，如放射性标记(如32P)，荧光团(如荧光素)，高 电子密度试剂，酶(如常用于ELISA)，生物素，地高辛配基，或可制成可检测的半抗原或肽， 如通过将放射性标记结合到半抗原或肽，或用于检测与半抗原或肽特异性反应的抗体。如上所述，依靠所采用的筛选方法，可标记缀合物的活化剂、连接体或RAP环肽部 分。只要不显著地干扰缀合物的生物活性，所用的特定的标记或可检测的基团不是本发明 关键性的部分。可检测的基团可为任何具有能被检测的物理或化学上的特性的物质。因而 标记为可被分光的、光化学的、生化的、免疫化学的、电学的、光学的或化学的方法检测的任 何组合物。适于用于本发明的标记例子包括但不限于荧光染料(如异硫氰酸荧光素，德克萨 斯红，罗丹明等)，放射性标记(如3H, 125L35S, 14C,或32P)，酶(如辣根过氧化物酶，碱性磷酸 酶，和常用于ELISA的其它酶)，以及比色标记诸如胶体金或有色玻璃或塑料珠(如聚苯乙 烯，聚丙烯，橡胶等)。依据本领域的公知方法，标记可与检测的所需成分直接地或间接地偶联。优选地， 根据本发明，在一实施方式中的标记采用异氰酸盐试剂与生物聚合物共价结合以缀合活性 剂。在本发明的一个方面，本发明的双功能异氰酸盐试剂可用于将标记缀合到生物聚合物， 以形成不附着活化剂的标记生物聚合物缀合物。这种标记生物聚合物缀合物可用作合成本 发明的标记缀合物的中间体或可用于检测所述生物聚合物缀合物。如上所述，可使用广泛 的标记，标记的选择取决于要求的敏感性，与检测方法所需成分易于缀合，稳定性要求可用 的仪器和处理规定。非放射性标记常采用间接方法连接。通常，配体分子(如生物素)与 所述分子共价结合。这种配体结合另一分子(如链霉抗生物素)，所述另一分子是固有可检测的或是共价结合到一信号系统，如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。所述缀合物也可直接与信号生成化合物缀合，如通过与酶或荧光团缀合。适于 用作标记的酶包括但不限于水解酶，尤其磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化酶，尤其过氧化物 酶。适于用作标记的荧光化合物，即荧光团，包括但不限于荧光黄和它的衍生物，罗丹明和 它的衍生物，丹酰，伞形花内酯等。适合的荧光团的其他实施例包括但不限于伊红，四甲 基异硫氰基罗丹明-胺，奎宁，荧光素W，吖啶黄，丽丝胺罗丹明，B磺酰氯红(B sulfonyl chlorideerythroscein)，钌(三，联吡啶)，德克萨斯红，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，黄素腺嘌 呤二核苷酸等。适于用作标记的化学发光化合物包括但不限于虫荧光素和2，3_ 二氢酞嗪 二酮，如鲁米诺。可用于本发明方法中的不同标记或信号生成系统的综述，参见美国专利号 4，391，904。检测标记的工具是本领域技术人员所公知的。因此，比如，当所述标记为放射性标 记，检测工具包括闪烁计数器或放射自显影术中的照相胶片。当所述标记为荧光标记，它可 通过合适波长的光激发荧光并检测得到的荧光而检测。所述荧光可通过采用电子探测器如 电荷偶联器件(CCDs)或光电倍增器等而在视觉上检测。类似地，酶标记可通过提供酶合适 的底物并检测得到的反应产物而检测。比色法的或化学发光的标记可简单地通过观察与标 记相关的颜色而检测。用于本发明方法中的其它标记或检测系统对于本领域技术人员而言 是显而易见的。这些标记的调节剂和配体可用于疾病或健康状况的诊断。ii.缀合物筛选实验和它们的递送调节剂本发明提供RAP环肽缀合物筛选实验，其中检测所述缀合物影响特异性受体可测 量的活性的能力，这种特异性受体可位于全细胞、细胞抽提物、允许其活性检测的部分纯化 的、纯化的或其它任何形式。这种活性可为含CR蛋白在表达、功能或降解方面的活性，其包 括，如这些活性的总量或时限。这些活性包括，如，受体基因序列或mRNA转录物的转录、转 录加工、翻译或转录物稳定性。这些活性包括，如，新受体的合成、受体的亚细胞结构的定位 和受体生物活性的激活。这些活性包括，如，受体结合物质、采用构型、催化反应、结合已知 配体等方面的能力。这些活性包括，如，受体的数量和稳定性、受体加工和移除或降解等。在 一优选实施方式中，采用的RAP环肽是被修饰的或自然具有对靶向受体的亲和力高于其它 受体的RAP环肽。本发明预期许多种不同的筛选形式。考虑到一些设计的低通量，以系列或平行方 式仅测试一个或几个化合物。高通量筛选实验适于在数周或数月内筛选数万或几十万个化 合物。“计算机”筛选形式应用计算机辅助推理设计技术以鉴定生物活性的潜在调节剂。
H.药物组合物及其给药缀合物和调节剂可采用多种途径给予。对于口服制剂，所述缀合物可单独使用或 与适当的添加剂联合以制成片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊，如，与常用的添加剂，例如乳糖、甘 露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉，粘合剂如微晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或 明胶；与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羟甲基纤维素钠；与润滑剂，如滑石或硬脂酸 镁；以及如果需要的话，还可含稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂或调味剂。所述缀合物和调节剂可按配制成注射制剂，通过使它们在水溶剂或非水溶剂中溶 解、悬浮或乳化，如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯，高碳脂肪酸酯或丙二醇；以及 如果需要的话，还可含有常规添加剂如助溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
所述缀合物、调节剂和LDLR配体可以吸入法给药的气溶胶形式使用。本发明的化 合物配制成增压可接受的推进剂如二氟二氯甲烷、丙烷、氮气等。此外，所述缀合物和调节剂可通过与不同的基质如乳化基质或水溶性基质混合制 成栓剂。本发明的化合物可通过栓剂经直肠给药。所述栓剂可包含载体如可可脂、碳蜡和 聚乙二醇，其在体温下融化而在室温下呈固体状。可提供以口服或直肠给药如糖浆剂、酏剂和悬浮液时缀合物、调节剂和LDLR配体 的单位剂型，其中每一剂量单位，如，一茶匙容量、一汤匙容量、片或栓，包含预定数量的含 活化剂的组合物。类似地，注射或静脉给药的单位剂型可包含在作为无菌水、生理盐水或其 它药学上可接受的载体溶液中的组合物的缀合物。
在实际应用中，可根据常规药剂配制技术，将本发明所述的缀合物、调节剂和LDLR 配体作为均勻混合物中的活性成分与药学载体混合。根据所需给药如口服或非胃肠(包含 静脉内)的制剂形式，载体可采取许多形式。在制备口服剂型的组合物中，可采用任何常用 的药学介质，例如，如在口服液体制剂情况下，例如，如悬浮液、酏剂和溶液，可采用水、乙二 醇、油脂、乙醇、调味剂、防腐剂、着色剂等；或例如，在口服固体制剂如粉剂、硬和软胶囊以 及片剂的情况下，载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等， 所述固体口服制剂优于液体制剂。关于透皮途径给药，药物透皮给药方法已在Remington，sPharmaceutical Sciences，第 17 版，(Gennaro 等人 Eds. Mack PublishingCo.，1985)公开。真皮或皮肤贴 剂是本发明所述缀合物、调节剂和LDLR配体透皮递送给药的优选方式。贴剂优选提供吸收 促进剂如DMSO以增加化合物的吸收。透皮药物输送的其它方法已在美国专利5，962，012、 6，261，595和6，261，595中公开。每一专利以其全文作为参考纳入本文中。在具体的实施方式中，预期本文所述缀合物的给药方式为鞘内给药至脑脊液。本 发明的鞘内给药可包括将药物组合物引导入脑室。或者，所述鞘内给药可包括将所述药物 组合物引导入腰椎区域。在另一个备选方案，所述鞘内给药包括将药物组合物引导入大池。 任何这样的给药方式优选通过推注注射(bolus injection)。根据症状的严重程度和个体 对治疗的反应性，这种推注注射可每周一次，每月一次，每6个月一次或一年一次给药。在 其他的实施方式中，所述鞘内给药是通过使用输液泵进行。药物当然可在至少数天的时间 内被连续地鞘内给药，或者，鞘内给药在至少四周的时间内连续给予。当然，当给药是通过 不断的注入，相比推注注射给药，酶替代疗法的给药剂量的比率可大大降低。在优选的实施 方式中，所述缀合物的活化剂是艾杜糖苷酸酶，按接受MPS治疗的哺乳动物每20公斤体重 约1毫克艾杜糖苷酸酶的量给予。在具体的实施方式中，上述剂量递送到15cc脑脊液中。 在这样的浓度下，可预期这种酶的浓度将达到每毫升脑脊液18，000单位。应该理解，上述 剂量仅仅是一示范剂量和本领域技术人员应认识到剂量是可变动的。本发明所述方法和组合物在酶替代疗法之前可与诱导抗原特异性耐受的方法和 组合物联合。这些方法包括诱导抗原特异性耐受，其包括给予免疫抑制剂如环孢霉素A的 给予，进一步包括给予抗增殖药物，其包括但不限于核苷酸类似物或抗代谢药。抗增殖药物 可为硫唑嘌呤。更多的方法已在以下文献中描述美国专利申请10/141，668，以美国专利
发明者C·M·斯塔, T·C·赞克尔 申请人:雷普特药品公司