专利名称：：色谱方法色谱方法本发明属于用于纯化多肽尤其是聚乙二醇化(PEGylated)多肽的色谱分离方法领域。
背景技术：
：蛋白质在当今医药事务中起重要作用。对于人类施用来说，每一种治疗性蛋白质必须符合特定的标准。为了确保生物药用物质对人类的安全性，尤其是必须将生产过程中积累的副产物除去。为了达到质量管理规格标准，一个或多个纯化步骤必须跟随于生产过程之后。除其它因素外，纯度、生产能力和收率在确定合适的纯化方法中起重要作用。已很好地建立了不同方法并将其广泛用于蛋白质纯化，例如使用微生物蛋白质的亲和色谱法(如蛋白质A或蛋白质G亲和色谱法)、离子交换色谱法(如阳离子交换(磺丙基或羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合型离子交换)、嗜硫吸附(如应用P-巯基乙醇和其它的SH配体)、疏水作用或芳香族吸附色谱(如应用苯基_琼脂糖、aza-arenophilic树脂或者间_氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和色谱(如应用Ni(II)-和Cu(II)-亲和物质)、分子排阻色谱和电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93—102)。已报道了下列物质的接合例如，聚乙二醇(PEG)和白介素_6(EP0442724)、PEG和促红细胞生成素(WO01/02017)、包含内皮生长抑素和免疫球蛋白类的嵌合分子(US2005/008649)、基于分泌抗体的融合蛋白(US2002/147311)、包含白蛋白的融合多肽(US2005/0100991;人血清白蛋白US5，876，969)、聚乙二醇化多肽(US2005/0114037)和干扰素融合物。Necina，R.等人(Biotechnol.Bioeng.60(1998)689-698)报道通过具有高电荷密度的离子交换介质直接从细胞培养上清液中捕获人单克隆抗体。在W089/05157中，报道了通过直接将细胞培养基进行阳离子交换处理来纯化产物免疫球蛋白的方法。Danielsson，A.等人，J.Immun.Meth.115(1988)，79-88描述了从小鼠腹水一步纯化单克隆IgG抗体。W02004/024866中报道了通过离子交换色谱纯化多肽的方法，其中用梯度洗脱从一种或多种污染物中分离出感兴趣的多肽。在EP0530447中，报道了通过三个色谱步骤的联合来纯化IgG单克隆抗体的方法。在ProcessBiotechnol.42(2007)971-977中Yu，G.等人报道了单-聚乙二醇化的白介素-l受体拮抗剂的巧妙纯化。Wang等人(Wang，H.，等人，P印tides26(2005)1213-1218)报道通过两步阳离子交换色谱纯化大肠杆菌中表达的hTFF3。Yun等人(Yun，Q.，等人，J.Biotechnol.118(2005)67-74)报道通过两个连续离子_交换色谱步骤纯化聚乙二醇化的rhG-CSF。
发明内容本发明的一个方面是在感兴趣的化合物洗脱后再生阳离子交换色谱柱的方法，该方法包括下述顺序的以下步骤-用包含至少500mM浓度的氯化钠的水性缓冲溶液从柱子上洗脱吸附的多肽，-用纯净水冲洗柱子，_施用0.5M氢氧化钠溶液至柱子，-用纯净水冲洗柱子，-施用包含0.5M磷酸二氢钠和1M磷酸的溶液至柱子，-用纯净水冲洗柱子，-施用0.5M氢氧化钠溶液至柱子，持续至少4小时，禾口-通过用纯净水冲洗柱子来使阳离子交换柱再生。发明详述第一方面，本发明包括在感兴趣的化合物洗脱后再生阳离子交换色谱柱的方法，该方法包括下列步骤-用包含氯化钠的水性缓冲溶液从阳离子交换柱上除去残留的结合多肽，-用纯净水冲洗柱子，-施用氢氧化钠溶液至柱子，-用纯净水冲洗柱子，-施用包含磷酸二氢钠和磷酸的溶液至柱子，-用纯净水冲洗柱子，-施用0.5M氢氧化钠溶液至柱子，持续至少4小时，禾口-通过用纯净水冲洗柱子来使阳离子交换柱再生。在本申请中所用的术语"纯净水"指根据US药典的用于注射的水。在本申请中所用的术语"离子交换材料"指在离子交换色谱中用作固定相的、载有共价结合的带电荷取代基的、固定不动的高分子量基质。为了达到完全的电荷中性，非共价结合的抗衡离子结合至所述基质。"离子交换材料"具有与周围溶液的相似带电离子交换其非共价结合的抗衡离子的能力。根据其可交换的抗衡离子的电荷，将"离子交换树脂"分为阳离子交换树脂或阴离子交换树脂。依据带电基团(取代基)的性质，将"离子交换树脂"，例如在阳离子交换树脂情况中，分为磺酸树脂(S)或磺丙基树脂(SP)或羧甲基树脂(CM)。根据带电基团/取代基的化学性质，依据共价结合的带电取代基强度，又可以将"离子交换树脂"分为强或弱阳离子交换树脂。例如，强阳离子交换树脂具有作为带电取代基的磺酸基团，优选磺丙基基团；弱阳离子交换树脂具有作为带电取代基的羧酸基团，优选羧甲基基团，并且弱阴离子交换树脂具有作为带电取代基的二乙基氨基乙基基团。在一实施方案中，阳离子交换色谱柱含有磺丙基阳离子交换树脂，即所述柱子是磺丙基阳离子交换色谱柱。不同类型的离子交换材料即固定相是可以以不同的名称并从众多公司购得的，例如阳离子交换材料Bio-Rex(例如型号70)、Chelex(例如型号100)、Macro-Prep(例如型号cm、Highs、25S)、AG(例如型号50w、mp)都可以从BioRadLaboratories购得；WCX2可以从Ciphergen购得；DowexMAC-3可以从Dow化学公司购得；MustangC和MustangS可以从Pall公司购得；CelluloseCM(例如型号23、52)、hyper-D、partisphere可以从Whatmanpic.购得；AmberiiteIRC(例如型号76、747、748)、Amberiitegt73、Toyopearl(例如型号sp、cm、650M)都可以从TosohBioscienceGmbH购得；CM1500禾PCM3000可以从BioChromLabs购得；SP-S印haroseTM、CM-S印haroseTM可以从GEHealthcare购得；Poros树脂可以从PerS印tiveBiosystems购得；AsahipakES(例如型号502C)、CXpakP、IECCM(例如型号825、2825、5025、LG)、IECSP(例如型号420N、825)、IECQA(例如型号LG、825)可以从ShokoAmericaInc.购得；50W阳离子交换树脂可以从EichromTechnologiesInc购得。在一实施方案中，阳离子交换材料是强阳离子交换材料例如Macro-Prep⑧Highs或25S或者MacroC即SP或者Toyopear1⑧SP650M或者SourceS或者SPS印harose或者POLYCATA。示例性阴离子交换材料是可以从Dow化学公司购得的Dowex⑧l;都可以从BioRadLaboratories购得的AG⑧(例如型号1、2、4)、Bio-ReX5、DEAEBio-Gel1、Macro-PrepDEAE;可以从EichromTechnologiesInc.购得的阴离子交换树脂1型；都可以从GEHealthcare购得的SourceQ、ANXS印harose4、DEAES印harose(例如型号CL-6B、FF)、QS印harose、C即toQ、C即toS;可以从PerkinElmer购得的AX-300;都可以从ShokoAmericaInc.购得的AsahipakES_502C、AXpakWA(例如型号624、G)、IECDEAE;都可以从TosohBioscienceGmbH购得的Amberlite⑧IRA_96、ToyopearlDEAE、TSKgelDEAE;可以从Pall公司购得的MustangQ。在本申请内所用的术语"冲洗"指用二个或多个柱体积的特定溶液清洗柱子。术语"相同类型的阳离子交换材料"指利用相同的阳离子交换材料来完成两个连续的离子交换色谱步骤。这是指连续的阳离子交换色谱步骤如下进行将第一部分的阳离子交换材料用于第一个阳离子交换色谱步骤并将第二部分的相同的阳离子交换材料用于第二个阳离子交换色谱；或者将相同的阳离子交换材料用于两个阳离子交换色谱步骤。在本申请范围内可替换使用的术语"阶式洗脱(st印elution)"和"阶式洗脱方法"指如下方法，其中例如将引起洗脱(即从材料上溶出结合的化合物)的物质浓度立刻提高或降低，即直接从一个值/水平到下一个值/水平。在所述"阶式洗脱"中，一个或多个条件例如pH、离子强度、盐浓度和/或色谱法的流量马上全部从第一个(例如起始的)值变化成第二个(例如最终的)值，即与线性变化不同，条件是增量式(即阶式)变化的。在所述"阶式洗脱方法"中，离子强度每次增加后，便收集新的流份。该流份包含伴随离子强度的相应增加从离子交换材料中回收的化合物。每一次增加后，将条件持续至洗脱方法中的下一个步骤。在本申请范围内可替换使用的术语"连续洗脱"和"连续洗脱方法"指如下方法，其中例如将引起洗脱(即从材料上溶出结合的化合物)的物质浓度连续提高或降低，即将浓度通过一系列小梯阶进行变化，每一梯阶中引起洗脱的物质的浓度变化不大于2%，优选不大于1%。在"连续洗脱"中，一个或多个条件例如pH、离子强度、盐浓度和/或色谱法的流量可以线性地或以指数方式或渐近地进行变化。该变化优选是线性的。如本申请内所用的术语"施用......至"和其语法上的同义词涉及纯化方法的部分步骤，其中使例如含有待纯化的感兴趣的物质的溶液与固定相接触。这是指a)将溶液加至固定相位于其中的色谱设备，或者b)将固定相加至溶液中。在a)情况中，例如含有待纯化的感兴趣的物质的溶液穿过固定相，使固定相和溶液中的物质相互作用。取决于条件例如pH、导电性、盐浓度、温度和/或流速，溶液中的一些物质结合至固定相，并因此将其从溶液中移除。其它物质保留在溶液中或被从固定相解吸附。溶液中的物质可见于流出液(flow-through)中。"流出液"指流过色谱装置后得到的溶液，其可以是所用的含有感兴趣的物质的溶液或者用于冲洗柱子或用于致使结合至固定相的一种或多种物质洗脱的缓冲液。在一实施方案中，色谱装置是柱子或盒(cassette)。纯化步骤后，可以通过本领域技6术人员熟悉的方法例如沉淀、盐析、超滤、渗滤、冻干、亲和色谱或溶剂体积减少，将感兴趣的物质从溶液中回收，以得到基本均一形式的感兴趣的物质。在b)情况中，将固定相例如作为固体加到例如含有待纯化的感兴趣的物质的溶液中，使固定相和溶液中的物质相互作用。相互作用后，例如通过过滤将固定相除去，在此，例如感兴趣的物质结合至固定相并随其从溶液中除去，或者感兴趣的物质不结合至固定相并保留在溶液中。如本申请内所用的术语"在适合结合的条件下"和其语法上的同义词指当使感兴趣的物质与固定相例如离子交换材料接触时，感兴趣的物质例如聚乙二醇化的促红细胞生成素结合至固定相。这不是指必须100%的感兴趣的物质结合至固定相，而是指基本上100%的感兴趣的物质结合至固定相，即至少50%的感兴趣的物质结合至固定相，优选至少75%的感兴趣的物质结合至固定相，优选至少85%的感兴趣的物质结合至固定相，更优选大于95%的感兴趣的物质结合至固定相。如本申请内所用的术语"缓冲的"指其中通过缓冲物质将由于酸性或碱性物质的加入或释放引起的pH变化稳定在一定水平的溶液。可以使用任何能产生上述效果的缓冲物质。在一实施方案中，使用药学上可接受的缓冲物质例如磷酸或其盐、乙酸或其盐、柠檬酸或其盐、吗啉、2-(N-吗啉代)乙磺酸或其盐、组氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、或者三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或其盐。在优选的实施方案中，使用磷酸或其盐、或者乙酸或其盐、或者柠檬酸或其盐、或者组氨酸或其盐。缓冲溶液可以任选地含有其它的盐例如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾。—般色谱方法及其使用是本领域技术人员公知的。参见例如色谱法(Chromatography)，第5片反，A部分基本原理禾口技术(FundamentalsandTechniques)，Heftma皿(编者)ElsevierSciencePublishingCompany1992Chromatogr即hy5thed51A1992;生物科学中的先进色谱法和电迁移方法(AdvancedChromatographicandElectromigrationMethodsinBiosciences)，Deyl，Z.(编者)，ElsevierScienceBV，Amsterdam,TheNetherlands,(1998);当今色谱法(ChromatographyToday)，Poole，C.F.禾口Poole，S.K.，ElsevierSciencePublishingCompany,NewYork,(1991);Scopes，蛋白质纯化原理和实践(ProteinPurification-PrinciplesandPractice)(1982);Sambrook，J.等人(编者)，分子克隆实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第二片反，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989;或者分子生物学的当前技术(CurrentProtocolsinMolecularBiology),Ausubel，F.M.等人(编者)，JohnWiley&Sons,Inc.，NewYork。促红细胞生成素的聚乙二醇化通常生成不同化合物的混合物，例如多聚乙二醇化的促红细胞生成素、单聚乙二醇化的促红细胞生成素、非聚乙二醇化的促红细胞生成素、活化的PEG酯的水解产物以及促红细胞生成素本身的水解产物。为了获得基本均一形式的单聚乙二醇化的促红细胞生成素，必须将上述物质分开，且必须将感兴趣的化合物纯化。因此，本发明的第二个方面是提供获得基本均一形式的单聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法，该方法包括下列步骤a)使用分子量20kDa至40kDa的活化的聚乙二醇化试剂将促红细胞生成素聚乙二醇化，b)用两个连续的阳离子交换色谱步骤纯化在步骤a)中得到的聚乙二醇化促红细胞生成素，其中第一和第二个阳离子交换色谱步骤使用相同类型的阳离子交换材料，c)以基本均一的形式从第二个阳离子交换色谱柱回收单聚乙二醇化的促红细胞生成素，d)通过根据本发明的方法再生阳离子交换色谱柱。所述方法尤其用于纯化聚乙二醇化的重组多肽，所述多肽是糖基化的，即其由哺乳动物细胞优选CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞、Per.C6⑧细胞或HeLa细胞产生，并且然后被用化学方法聚乙二醇化。在一实施方案中，阳离子交换色谱柱的再生包括下列步骤-用包含氯化钠的水性缓冲溶液将结合的多肽从阳离子交换柱移除，-用纯净水冲洗柱子，优选使用至少两个柱体积，-施用氢氧化钠溶液至柱子，优选至少两个柱体积，-用纯净水冲洗柱子，优选使用至少两个柱体积，-施用包含磷酸二氢钠和磷酸的溶液至柱子，优选至少三个柱体积，-用纯净水冲洗柱子，优选使用至少两个柱体积，-施用0.5M氢氧化钠溶液至柱子，持续至少4小时，优选4小时，禾口-通过用纯净水冲洗柱子来再生阳离子交换柱，优选使用至少两个柱体积。在本方法的第一个步骤中，促红细胞生成素是聚乙二醇化的。用于聚乙二醇化反应中的聚(乙二醇)(PEG)聚合物分子具有约20kDa至40kDa的分子量(就此处所用的"分子量"而言，其应被理解为PEG的平均分子量，因为不能以确定的分子量得到作为聚合化合物的PEG，而实际上其具有一分子量分布范围；术语"约"意指在所述的PEG制品中，一些分子会比所示的分子量大或有些分子会比所示的分子量小，即术语"约"指分子量分布，其中95%的PEG分子具有所示分子量+/_10%范围内的分子量。例如30kDa的分子量指27kDa至33kDa的范围)。术语"促红细胞生成素"指具有序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的蛋白质或者与其基本同源的蛋白质或多肽，其生物学性能与剌激红细胞产生和剌激骨髓中的定向红系祖细胞的分裂和分化有关。可以通过重组DNA技术或通过内源基因活化经在真核细胞中例如在CHO细胞或者BHK细胞或者HeLa细胞中表达来制备重组促红细胞生成素，即将促红细胞生成素糖蛋白通过内源基因活化来表达，参见例如US5，733，761、US5，641，670、US5，733，746、WO93/09222、WO94/12650、WO95/31560、WO90/11354、WO91/06667和WO91/09955。在一实施方案中，根据本发明的促红细胞生成素是基于人EPO序列的。在一优选实施方案中，人促红细胞生成素具有在SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列，更优选地，人促红细胞生成素具有在SEQIDN0:1中所示的氨基酸序列。术语"促红细胞生成素"还指SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的蛋白质的变体，其中一个或多个氨基酸残基被改变、删除或插入，并且其具有与未修饰的蛋白质相同的生物活性，例如在EP1064951或US6，583，272中报道的。变体可以具有含有1_6个额外的用于糖基化的位点的人促红细胞生成素的氨基酸序列。可以通过本领域公知的各种实验来测定聚乙二醇化的促红细胞生成素的比活性。本发明的纯化的聚乙二醇化的促红细胞生成素的生物活性如下与未注射组或对照组个体相比，通过注射将所述蛋白给药至人类患者致使骨髓细胞增加网状细胞和红细胞的产生。可以通过根据PharmeuropaSpec.IssueBiologicalsBRPErythropoietinBio97-2(1997)31-48的方法来测试根据本发明得到和纯化的聚乙二醇化促红细胞生成素的生物活性。根据本发明的"PEG"或"PEG基团"意指含有作为基本部分的聚(乙二醇)的残基。所述PEG可以含有另外的化学基团，其对于结合反应是必需的，其产生自分子的化学合成或者其是分子的组成部分的最佳距离的间隔物。上述另外的化学基团不用于PEG聚合物分子的分子量计算中。此外，所述PEG可以由互相连接在一起的一个或多个PEG侧链构成。将具有多于一个PEG链的PEG称作多臂的或支链的PEG。可以例如通过将聚环氧乙烷加成至各种多元醇(包括甘油、季戊四醇和山梨醇)来制备支链的PEG。支链的PEG描述于例如EP0473084、US5，932，462中。对于具有20_35kDa分子量的PEG,在一实施方案中使用线性的PEG分子，并且对于具有大于35kDa尤其具有40kDa分子量的PEG聚合物，在另一个实施方案中使用支链的PEG。对于PEG40kDa，两臂的PEG是特别优选的。术语"聚乙二醇化"指聚(乙二醇)残基在多肽N-末端和/或内部赖氨酸残基处的共价连接。蛋白质的聚乙二醇化在本领域内是众所周知的并被例如Veronese,F.M.，Biomaterials22(2001)405-417综述。可以使用不同的官能基团和具有不同分子量的聚(乙二醇)、线性的和支链的PEG以及不同的连接基团将PEG进行连接(还参见Francis,G.E.等人，Int.J.Hematol.68(1998)1-18;Delgado，C.等人，Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSystems9(1992)249-304)。可以在水溶液中按照例如WO00/44785中所述用聚乙二醇化试剂完成促红细胞生成素的聚乙二醇化，在一实施方案中使用分子量5kDa-40kDa的NHS-活化的线性或支链PEG分子。还可以根据Lu，Y.等人，ReactivePolymers22(1994)221-229在固相完成聚乙二醇化。非随机地，还可以根据W094/01451来生产N-末端聚乙二醇化的多肽。上述方法致使得到在一个或多个赖氨酸残基的e-氨基基团和/或在N-末端氨基基团处聚乙二醇化的促红细胞生成素。可以根据Felix，A.M.等人，ACSSymp.Ser.680(Poly(ethyleneglycol))(1997)218-238实现N_末端氨基酸的选择性聚乙二醇化。可以在固相合成中通过偶联矿-聚乙二醇化的氨基酸衍生物至肽链的N-l末端氨基酸来实现选择性的N-末端聚乙二醇化。可以在固相合成中通过偶联NE-聚乙二醇化的赖氨酸衍生物至增长链来实现侧链的聚乙二醇化。在固相合成期间如上所述那样或经液相合成通过施用活化的PEG试剂至氨基脱保护的肽，组合的N-末端和侧链聚乙二醇化是可以实现的。合适的PEG衍生物是活化的PEG分子，其在一实施方案中具有约5至约40kDa的平均分子量，在优选的实施方案中具有约20至约40kDa的平均分子量，并且在更优选的实施方案中具有约30kDa至约35kDa的平均分子量。PEG衍生物可以是线性的或支链的PEG。可以从ShearwaterPolymers(H皿tsville，AL，U.S.A.;www.nektar.com)获得适合于在制备PEG-蛋白和PEG-肽共轭物中使用的各种PEG衍生物。活化的PEG衍生物在本领域中是已知的，并将其描述在例如Morpurgo，M.，等人，J.Bioconjug.Chem.7(1996)363-368，关于PEG-乙烯基砜。直链和支链PEG种类(species)适合于制备聚乙二醇化的片段。活性PEG试剂的示例是碘代_乙酰基_甲氧基-PEG或甲氧基-PEG-乙烯基砜(在一实施方案中，m是约450至约900的整数并且R是直链或支链的具有l-6个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、异丙基等，其中甲基是优选的)9所述碘代-活化物质的应用在本领域是公知的，并描述在例如Hermanson，G.T.的BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego(1996)147-148页中。在一实施方案中，PEG种类是活化的PEG酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺基丁酸酯或者N-羟基琥珀酰亚胺类例如PEG-NHS(Monfardini，C.等人，BioconjugateChem.6(1995)62-69)。在一实施方案中，PEG是被N_羟基琥珀酰亚胺酯活化的，采用烷氧基-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺，例如甲氧基-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(丽30000;ShearwaterPolymers,Inc.)，其中R和m是如上所定义。在一实施方案中，PEG种类是甲氧基聚(乙二醇)-丁酸的N-羟基琥珀酰亚胺基酯。术语"烷氧基"指烷基醚基团，其中术语"烷基"意指含有至多四个碳原子的直链或支链的烷基基团，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基等，优选甲氧基。本申请内所用的术语"基本均一形式"指得到的、含有的或所用的聚乙二醇化促红细胞生成素是具有确定数目的连接的PEG基团的那些。在一实施方案中，聚乙二醇化促红细胞生成素是单-聚乙二醇化的促红细胞生成素。该制品可以含有未反应的(即PEG基团缺失的)促红细胞生成素，多聚乙二醇化促红细胞生成素以及聚乙二醇化反应中产生的多肽片段。术语"基本均一形式"指单_聚乙二醇化促红细胞生成素制品含有至少50%(w/w)的单-聚乙二醇化促红细胞生成素，至少75%的单_聚乙二醇化促红细胞生成素，至少90%的单-聚乙二醇化促红细胞生成素，或者多于95%的单_聚乙二醇化促红细胞生成素。所述百分值是基于色谱图的面积-%，所述色谱图由获得单-聚乙二醇化促红细胞生成素的阳离子交换色谱得到。本发明报道用于纯化单-聚乙二醇化促红细胞生成素以便得到基本均一形式的单-聚乙二醇化促红细胞生成素的方法。令人惊讶地发现都使用相同类型的阳离子交换材料的两个连续的阳离子交换色谱步骤的组合提供基本均一形式的单-聚乙二醇化促红细胞生成素。因此，本发明提供用于纯化单-聚乙二醇化促红细胞生成素的方法，其包括下列步骤提供包含单_、多_和非聚乙二醇化的促红细胞生成素的溶液；进行两个连续的阳离子交换色谱步骤；在第二个阳离子交换色谱步骤中回收纯化的单_聚乙二醇化促红细胞生成素，其中在两个阳离子交换色谱步骤中使用相同类型的离子交换材料；以及通过根据本10发明第一方面的方法再生阳离子交换色谱柱。在第二个阳离子交换色谱步骤中回收纯化的单-聚乙二醇化促红细胞生成素是通过从第二个阳离子交换色谱材料上洗脱单-聚乙二醇化促红细胞生成素来实现的。在根据本发明方法的一个实施方案中，两个阳离子交换色谱步骤的差异在于所用的洗脱方法不同。在一个实施方案中，第一个阳离子交换色谱步骤以阶式洗脱方法完成，即所用缓冲液的离子强度是阶梯式增加的，即立刻从一个离子强度值到下一个离子强度值。在一个实施方案中，阶式洗脱方法是以三阶洗脱方法完成的。在第一梯阶中，将大部分多-聚乙二醇化的促红细胞生成素从阳离子交换色谱柱上洗脱。离子强度的第二次增加主要洗脱单_聚乙二醇化促红细胞生成素，基于相应的分子排阻色谱图的面积其具有大于60%的纯度(面积_%)。离子强度的第三次增加主要从柱子上洗脱剩余的非_聚乙二醇化促红细胞生成素。在一个实施方案中，第二个阳离子交换色谱步骤用连续洗脱方法完成，即缓冲液的离子强度是连续增加的。将含有单_聚乙二醇化促红细胞生成素的洗脱的流份合并，以得到基本均一形式的单-聚乙二醇化促红细胞生成素，在一实施方案中，基于相应色谱图的峰面积其含有少于O.5%的低分子量形式。在一实施方案中，缓冲液以10mM-250mM，优选50mM-150mM，更优选约100mM的浓度存在。因此，在根据本发明的方法中，两个连续的阳离子交换色谱步骤是如下的步骤a)在适合于使所述单_聚乙二醇化促红细胞生成素结合至所述第一个柱子中含有的阳离子交换材料的条件下，将含有单_、多_和非_聚乙二醇化的促红细胞生成素的混合物的水性缓冲溶液施用至第一个阳离子交换色谱柱，b)通过流出缓冲液离子强度阶梯式增加的阶式洗脱方法，从第一个阳离子交换色谱柱回收单_聚乙二醇化促红细胞生成素，其中与步骤a)中所施用的混合物相比，单_聚乙二醇化促红细胞生成素的相对含量增加，c)在适合于使所述促红细胞生成素结合至所述第二个柱子中含有的阳离子交换材料的条件下，将从步骤b)回收的单-聚乙二醇化促红细胞生成素施用至第二个阳离子交换色谱柱，此处所述第二个柱子中含有的阳离子交换材料与第一个柱子中的阳离子交换材料是相同类型的，d)通过流出缓冲液的离子强度连续增加的连续洗脱方法，以基本均一形式从所述第二个阳离子交换色谱柱回收纯化的单_聚乙二醇化促红细胞生成素。多肽的聚乙二醇化通常不提供均一形式的聚乙二醇化产物。而且，其作为单-聚乙二醇化、多-聚乙二醇化和非-聚乙二醇化的产物的混合物获得。因此，在所述方法的步骤a)中施用的聚乙二醇化促红细胞生成素的溶液是单_、多_和非_聚乙二醇化促红细胞生成素以及低分子量形式或片段在水缓冲液中的混合物。通过分子排阻色谱(SE-HPLC)来测定不同物质的相对含量。在分子排阻色谱图中的相关峰的面积(即峰下的面积)的总和是分子排阻色谱图的总面积。将单个峰的分数以面积-%给出，即以色谱图总面积的相对面积分数给出。—般色谱方法，其用途和相关术语是本领域技术人员所公知的。参见例如色谱法(Chromatography)，第5片反，A部分原理禾口技术(FundamentalsandTechniques)，Heftma皿(编者)，ElsevierSciencePublishingCompany,Chromatography第5片反，51A(1992)和其它相关的教科书。在色谱过程中，缓冲液流出阳离子交换色谱柱。所述"流出的缓冲液"根据色谱方法的步骤的需要进行调整。其运输感兴趣的物质至(施用至)色谱材料和从色谱物质运输出(洗脱)感兴趣的物质。在第一个阳离子交换色谱步骤中，将单-聚乙二醇化、多-聚乙二醇化和非-聚乙二醇化的促红细胞生成素混合物以约lmg/ml的蛋白质浓度施用至在水性溶液(其用约lOOmM磷酸钾缓冲，约pH3.0)中的第一个阳离子交换色谱柱。在本申请范围内所用的术语"约"指在给定值上下10%的范围，8卩±10%。施用之前和之后，用相同的缓冲溶液洗第一个柱子。对于阶式洗脱方法中的第一个步骤，将缓冲液改变为在约PH3.0的含有约100mM磷酸钾、约90mM氯化钠的缓冲液。用该缓冲液，将水解的PEG试剂即相应的聚乙二醇化的碳酸、未反应的偶联试剂和多_聚乙二醇化的促红细胞生成素从阳离子交换色谱柱洗脱。对于所述三阶洗脱方法中的第二个梯阶，将缓冲液改变为在约pH3.0的含有约100mM磷酸钾、约250mM氯化钠的缓冲液。在该梯阶中，将单-聚乙二醇化的促红细胞生成素从第一个阳离子交换色谱柱回收。将收集的该洗脱梯阶的流出缓冲液用纯净水约1:5至1:8稀释。第一个阳离子交换色谱步骤后，回收的单-聚乙二醇化的促红细胞生成素不含游离PEG。收集的第一个阳离子交换色谱的第二个梯阶的流出缓冲液含有提高的相对含量的单-聚乙二醇化促红细胞生成素，即当与第一个阳离子交换色谱步骤之前相比时，单-聚乙二醇化促红细胞生成素的重量或面积_%(在收集的第二个梯阶的流出缓冲液的分子排阻色谱的色谱图中)分数提高了。在一实施方案中，单-聚乙二醇化促红细胞生成素的相对含量是至少60面积_%。在优选的实施方案中，单-聚乙二醇化促红细胞生成素的相对含量是至少80面积-%。为了进一步纯化单-聚乙二醇化促红细胞生成素，进行第二个阳离子交换色谱步骤。对于第二个阳离子交换色谱来说，将收集的并稀释的第二个洗脱梯阶的流出缓冲液(调至约100mM的磷酸钾浓度和约pH3.0的pH)施用至第二个阳离子交换色谱柱(其含有与第一个阳离子交换色谱柱相同类型的阳离子交换材料)。在一实施方案中，第二个阳离子交换柱和其中含有的阳离子交换材料与第一个阳离子交换色谱步骤中的相同。通过施用线性梯度来从第二个阳离子交换色谱柱回收单-聚乙二醇化促红细胞生成素，该线性梯度起始于约pH3.0的、具有约50mM氯化钠的约100mM浓度的磷酸钾缓冲液并终止于约pH3.0的、具有约500mM氯化钠的约100mM浓度的磷酸钾缓冲液。历经10个柱体积，氯化钠浓度的变化是线性的。将流出的缓冲液分成份，并将每份用lM磷酸氢二钾稀释，以增加pH值至约pH6-8。第二个阳离子交换色谱步骤后，以基本均一形式(优选具有至少95%(面积)的纯度)得到单-聚乙二醇化促红细胞生成素。本领域技术人员熟知离子交换色谱技术。在结合至阳离子交换材料的多肽的回收步骤中，通过离子交换柱的缓冲液/溶液的离子强度即导电性是增加的。这可以通过增加缓冲液盐浓度或通过添加其它盐(所谓的洗脱盐)至缓冲溶液来实现。根据洗脱方法，通过分批加入浓縮缓冲液或洗脱盐溶液使缓冲液/盐浓度立刻(阶式洗脱方法)或连续(连续洗脱方法)增加。在一实施方案中，洗脱盐是柠檬酸钠、氯化钠、硫酸钠、磷酸钠、氯化钾、硫酸钾、磷酸钾或者柠檬酸或磷酸的其它盐或者所述组分的任何混合物。在优选的实施方案中，洗脱盐是柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾或其混合物。在本方法的一个实施方案中，阳离子交换材料是强阳离子交换材料；在优选的实施方案中，阳离子交换材料是Toyopearl⑧sp650M;在另一个优选实施方案中，阳离子交换材料是磺丙基阳离子交换材料。在一实施方案中，引起洗脱的盐浓度是5mM-500mM，在优选的实施方案中其是5mM-400mM，并且在特别优选的实施方案中其是5mM-250mM。在本发明的另一个实施方案中，引起洗脱的盐同时用作缓冲物质，例如柠檬酸或其盐或者磷酸或其盐。可以通过本领域公知的方法将单-聚乙二醇化促红细胞生成素在含有药学上可接受的载体或溶媒的适于注射的药物组合物中使用。例如，合适的组合物已描述在WO97/09996、W097/40850、W098/58660和W099/07401中。用于配制本发明产品的优选的药学上可接受的载体是人血清白蛋白、人血浆蛋白等。可以将本发明化合物配制在含有张度剂(例如132mM氯化钠)的pH7的10mM磷酸钠/钾中。药物组合物可以任选地含有防腐剂。药物组合物可以含有不同量的单-聚乙二醇化促红细胞生成素，例如10-1000iig/ml、例如50iig或400iig。本发明的促红细胞生成素糖蛋白产品的施用致使人体中红细胞形成。因此，单-聚乙二醇化促红细胞生成素糖蛋白产品的施用补充在红细胞生产中起重要作用的促红细胞生成素蛋白。可以将含有单-聚乙二醇化促红细胞生成素糖蛋白产品的药物组合物以对于通过各种方式施用至人类患者有效的强度进行配制，所述患者患有以红细胞产生低或缺失(单独地或为疾患或疾病的部分)为特征的血液病症。可以将药物组合物通过注射例如通过皮下或静脉注射施用。单-聚乙二醇化促红细胞生成素糖蛋白产品的平均量可以变化。共轭物的确切量受以下因素影响例如要被治疗的疾患的确切类型、要被治疗的患者的情况及组合物中的其它成分。例如可以以0.01-10iig/kg体重、优选0.1-1iig/kg体重施用，例如每周施用一次。已令人吃惊地发现可以用根据本发明的方法在分离效率没有显著降低的情况下将阳离子交换色谱柱再生。已表明用根据本发明的再生方法，阳离子交换色谱柱可以使用至少40个分离循环，在一实施方案中可以使用至少50个分离循环，在另一个实施方案中可以使用至少60个分离循环，而在分离效率(参见图1)和收率(参见图2)方面没有显著降低。本申请范围内所用的术语"分离循环"指下列序列i)平衡柱子，ii)将待分离的溶液施用至柱子上，iii)冲洗柱子，iv)从柱子上回收被吸附的化合物，v)冲洗柱子，vi)再生柱子。还已发现用根据本发明的再生方法，不但可以避免分离效率的下降，而且还能防止负荷容量的下降(参见图2)。本申请范围内所用的术语"分离效率"指阳离子交换色谱柱分离溶液中化合物的能力。本申请范围内所用的术语"没有显著降低"指阳离子交换色谱柱在含有相同化合物溶液的连续色谱中提供相同的化合物分离，即在+/-5%变化范围内，在一实施方案中在+/-2.5%变化范围内。本申请范围内所用的术语"负荷容量"指从阳离子交换色谱柱回收的感兴趣的化合物的量。提供下列实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在附加的权利要求书中提出。应当理解可以在不背离本发明精神的情况下，对所述的方法进行修改。13附图详述图1再生方法的循环数验证期间第一个色谱的流出缓冲液集合体(pool)中单_聚乙二醇化促红细胞生成素的纯度。图2再生方法的循环数验证期间第一个色谱的流出缓冲液集合体中单-聚乙二醇化促红细胞生成素的收率。材料和方法SE-HPLCSE-HPLC根据蛋白质的表观分子量来分离蛋白质。因此，本方法能检测单-聚乙二醇化促红细胞生成素、低分子量形式和片段、促红细胞生成素的多聚乙二醇化形式和较高的聚集物。将HPLC装配220-nm检测器和Superose6HR柱子(尺寸10X300mm，PharmaciaBiotech,Cat-Nr:17-0537-01)或者Superose610/300GL柱子(PharmaciaBiotech,Cat-Nr:17-5172-01)。将柱子于室温在等强度条件下使用，用约0.4ml/min的流速。流动相缓冲液是pH6.8的具有300mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液。根据所用的HPLC系统，该方法可以用100i!L或500iiL的样品上样体积来完成。将样品用流动相缓冲液稀释至约0.5mg/mL(100iiL负载)或0.Img/mL(500yL负载)的蛋白浓度。具有低于0.Img/mL的蛋白浓度的样品可以不稀释就使用。将洗脱的蛋白质在220nm的检测波长进行检测。RP-HPLC:通过RP-HPLC来分析纯度，RP-HPLC可将单_聚乙二醇化促红细胞生成素从寡聚形式和相关物质中分出。在Poroshell柱子上使用乙腈/TFA水溶液梯度来完成实验。在用紫外吸收在220nm监测洗脱曲线。单_聚乙二醇化促红细胞生成素和相关物质或寡聚形式的百分数是根据洗脱的蛋白质的总峰面积来计算的。实施例1单-聚乙二醇化促红细胞生成素的纯化可以例如根据WO01/87329来生产促红细胞生成素并根据W096/135718的报道来纯化。可以例如根据WO03/029291来生产聚乙二醇化的促红细胞生成素。a)在SPToyopearl650M上的第一个色谱在填充SPToyopeaii650M的磺丙基(SP)柱子上完成第一个色谱步骤。将柱子在RT使用。第一个柱子的最大负荷容量定为1.5g蛋白/升柱体积(CV)。将柱子用pH2.9-3.1的lOOmM磷酸钾缓冲液(SP-A缓冲液)平衡。在载样步骤后，将柱子用一系列含有增加量NaCl的磷酸钾缓冲液冲洗和洗脱。将游离的聚乙二醇化碳酸即水解的PEG试剂和多-聚乙二醇化形式分别在流出液中和随后的应用SP-A缓冲液和pH2.9-3.1的含有90mM氯化纳的lOOmM磷酸钾缓冲液(SP-B缓冲液)的冲洗步骤中除去。通过使用pH2.9-3.1的含有250mM氯化纳的lOOmM磷酸钾缓冲液(SP-C缓冲液)来洗脱单_聚乙二醇化促红细胞生成素，将其收集在容器中并直接用纯净水l:5稀释。将该收集的洗脱物称作"SP洗脱物集合体(pool)1"。接着，将柱子用pH2.9-3.1的含有750mM氯化纳的lOOmM磷酸钾缓冲液(SP-D缓冲液)冲洗，以便除去未反应的促红细胞生成素，并将柱子再生。b)在SPToyopearl650M上的第二个色谱将第二个柱子在RT使用。用SP-A缓冲液平衡后，将SP洗脱物集合体I施用至柱子，并随后将柱子用SP-A缓冲液冲洗。通过使用经pH2.9-3.1的lOOmM磷酸钾缓冲液缓冲的历经10个柱体积从50mM至500mM斜率的氯化纳线性梯度进行洗脱。将产物峰分成至多8个单一流份，并将每份直接用1M磷酸氢二钾稀释，以提高pH至6-8。单-聚乙二醇化促红细胞生成素洗脱完成后，可以将梯度的斜率增加，以便立即用pH2.9-3.1的含有500mM氯化纳的lOOmM磷酸钾缓冲液冲洗柱子。c)SPToyopearl650M柱子的再生将两个柱子的树脂以7个步骤的序列进行再生。将柱子用纯净水冲洗后，用0.5M氢氧化钠溶液冲洗。将碱性溶液用纯净水置换，接着用酸冲洗(0.5M磷酸二氢钠，1M磷酸)。经再一个纯净水步骤后，将柱子用0.5M氢氧化钠除热源，持续^4小时。苛性(Caustic)再生后，将柱子再次用纯净水冲洗。通过超滤来生产纯净水(PWIII)。根据美国药典，PWIII水的质量相当于注射用水的质量。根据Ph.Eur.和USP.完成测试。根据上述第一个色谱步骤完成的对照操作期间，在各流出缓冲液中不能检测到残留的蛋白质或PEG部分。60个循环后，树脂的SDS-PAGE分析显示在凝胶上没有残留的蛋白质或PEG部分。基于这些数据，残留蛋白质和PEG部分的批次间遗留可以被排除，因此柱子的再生是非常有效的(还见图1)。各色谱中得到的收率检测显示没有下降(还见图2)。表1:柱子再生参数概览。柱子参数<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如在图1和2中所示，对于所有循环的第一个色谱步骤来说，在流出缓冲液集合体中单-聚乙二醇化促红细胞生成素的纯度和收率明显在至少80%纯度和至少35%收率的范围内。另外，在柱子的使用期限内，不能观察到单_聚乙二醇化促红细胞生成素的纯度趋势。权利要求用于在感兴趣的化合物洗脱后再生阳离子交换色谱柱的方法，其包括以下顺序的下列步骤-用包含至少500mM浓度的氯化钠的水性缓冲溶液从柱子上洗脱吸附的多肽，-用纯净水冲洗柱子，-施用0.5M氢氧化钠溶液至柱子，-用纯净水冲洗柱子，-施用包含0.5M磷酸二氢钠和1M磷酸的溶液至柱子，-用纯净水冲洗柱子，-施用0.5M氢氧化钠溶液至柱子，持续至少4小时，和-通过用纯净水冲洗柱子来使阳离子交换色谱柱再生。2.获得基本均一形式的单-聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法，其包括下列步骤a)使用活化的分子量20kDa至40kDa的聚乙二醇化试剂将促红细胞生成素聚乙二醇化，b)用两个连续的阳离子交换色谱步骤纯化在步骤a)中得到的聚乙二醇化促红细胞生成素，其中第一和第二个阳离子交换色谱步骤使用相同类型的阳离子交换材料，c)以基本均一的形式从第二个阳离子交换色谱柱回收单-聚乙二醇化的促红细胞生成素，d)通过以下顺序的下列步骤再生阳离子交换色谱柱i)用包含氯化钠的水性缓冲溶液将结合的多肽从阳离子交换柱移除，ii)用纯净水冲洗柱子，iii)施用氢氧化钠溶液至柱子，iv)用纯净水冲洗柱子，v)施用包含磷酸二氢钠和磷酸的溶液至柱子，vi)用纯净水冲洗柱子，vii)施用0.5M氢氧化钠溶液至柱子，持续至少4小时，禾口viii)通过用纯净水冲洗柱子来再生阳离子交换色谱柱。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的阳离子交换色谱柱是强阳离子交换色谱柱。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的阳离子交换色谱柱是磺丙基阳离子交换色谱柱。5.根据前面权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于所述的缓冲剂是磷酸或其盐、或者乙酸或其盐、或者柠檬酸或其盐、或者组氨酸或其盐。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的促红细胞生成素是具有SEQIDNO:1或2氨基酸序列的人促红细胞生成素。7.根据权利要求2或6中的任何一项所述的方法，其特征在于所述的PEG具有20-35kDa的分子量并且是线性的。8.根据权利要求2或6中的任何一项所述的方法，其特征在于所述的PEG具有40kDa的分子量并且是支链的。9.根据权利要求2和6-8中的任何一项所述的方法，其特征在于所述的第一个阳离子交换色谱步骤是以阶式洗脱完成的，并且所述的第二个阳离子交换色谱步骤是以线性洗脱完成的。10.根据前面权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于所述的阳离子交换色谱柱能够使用至少40个分离循环。全文摘要本发明包括用于再生阳离子交换色谱柱的方法。文档编号C07K1/00GK101754789SQ200880025173公开日2010年6月23日申请日期2008年7月15日优先权日2007年7月17日发明者A·施罗特,A·维斯纳,H·舒里格,J·伯格,K·雷彻特申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司