专利名称：多肽、基质、水凝胶以及使用它们进行组织再生和修复的方法
多肽、基质、水凝胶以及使用它们进行组织再生和修复的方
法技术领域和
背景技术：
本发明在其一些实施方案中涉及包含新型层粘连蛋白多肽的组合物，更具体涉及 但不唯独涉及包含该组合物的基质和水凝胶以及使用该组合物的方法。水合凝胶(水凝胶)在生理温度和pH下是粘稠、半固体物质，其可用于组织工程、 再生医学和用作生物材料。例如，水凝胶是从多糖(Coviello等人，2007)如透明质酸(例 如使用透明质酸与磷酸钙、壳聚糖、明胶或藻酸盐的混杂组合)或壳聚糖(例如壳聚糖与层 粘连蛋白肽；Suzuki等人，2003 ；Itoh等人，2005 ；Matzuda等人，2005 ；Ho等人，2005)以及 从合成材料如聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)制备。透明质酸基水凝胶为细胞和组织(如为 神经再生)提供生长支持环境(Suzuki等人，2003 ;Itoh等人，2005)，同时指导营养剂和抗 氧化剂的迁移和再生。层粘连蛋白是基膜糖蛋白，其充当黏附分子介导细胞骨架结合的整联蛋白、钙黏 着蛋白、细胞黏附分子(CAMs)和胞外基质(ECM)组分并与它们相互作用，并支持细胞迁移、 附着、增殖、分化和存活。用层粘连蛋白修饰的透明质酸剂水凝胶被证明能促进神经突延伸 (Hou等人，2005)。某些层粘连蛋白序列重复被发现对细胞表面受体具有生物活性。这些 序列重复包括IKVAV (SEQ ID NO 1) ^P YIGSR(SEQ IDNO :2)，它们充当迁移、再生和生长的 “导轨”(Tashiro 等人，1989 ；Powell 和 Kleinmann，1997 ；Niece 等人，2003 ；HalImann 等人， 2005)。针对氧化胁迫的主要防御机制是超氧化物歧化酶(SOD)，其催化超氧化物阴离子 自由基((V)歧化成过氧化氢(H2O2)和氧(O2)。包含来自牛红细胞、与透明质酸钠缀合的 SOD的水凝胶被发现在小鼠中没有免疫原性，且显示出比单独的透明质酸和SOD高得多的 抗炎活性(Sekurai等人，1997)。另外，还发现SOD不仅能抑制活性氧中间体(ROS)的诱导， 而且能抑制由机械胁迫引起的HA解聚作用(Yamazaki等人，2003)。另外的背景技术包括Hartman JR.，1986 (Proc. Natl. Acad. Sci. 83 :7142_7146)。发明概述本发明一些实施方案的一个方面提供包含SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的多 肽。本发明一些实施方案的一个方面提供包含多糖和本发明多肽的组成物。本发明一些实施方案的一个方面提供包含透明质酸、层粘连蛋白多肽和抗氧化剂 的组成物。本发明一些实施方案的一个方面提供包含透明质酸、超氧化物歧化酶(SOD)和本 发明多肽的组成物。本发明一些实施方案的一个方面提供包含本发明组成物的基质。本发明一些实施方案的一个方面提供包含本发明组成物的水凝胶。本发明一些实施方案的一个方面提供产生水凝胶的方法，该方法包括将本发明组 成物悬浮于水中以获得包含至少80%水的悬浮液，从而产生水凝胶。
本发明一些实施方案的一个方面提供诱导组织的离体形成的方法，该方法包括 (a)提供本发明的基质或水凝胶；(ii)用处于适合细胞的增殖、分化和/或迁移的培养基中 的细胞接种该基质或水凝胶，从而诱导组织的形成。本发明一些实施方案的一个方面提供诱导组织的体内形成的方法，该方法包括将 本发明的基质或水凝胶植入受试者体内，从而诱导组织的形成。本发明一些实施方案的一个方面提供治疗具有以组织患病、损伤或损失为特征的 病状的受试者的方法，该方法包括将本发明的基质或水凝胶植入在受试者的患病、损伤或 损失的组织处或附近，从而诱导组织的形成和治疗受试者。根据本发明的一些实施方案，多糖是透明质酸。根据本发明的一些实施方案，组成物还包含抗氧化剂。根据本发明的一些实施方案，抗氧化剂是超氧化物歧化酶(SOD)。根据本发明的一些实施方案，层粘连蛋白多肽为SEQ ID N0:3所示。根据本发明的一些实施方案，层粘连蛋白多肽由SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列 组成。根据本发明的一些实施方案，超氧化物歧化酶包含SEQ ID NO 4所示的氨基酸序 列。根据本发明的一些实施方案，组成物是经交联的。根据本发明的一些实施方案，多糖、抗氧化剂和/或多肽是经交联的。根据本发明的一些实施方案，透明质酸、超氧化物歧化酶(SOD)和多肽是经交联 的。根据本发明的一些实施方案，该方法还包括将组成物进行交联。根据本发明的一些实施方案，交联是用选自EDC-N_(3-二甲基(dimenthy)-氨基 丙基(amin0pr0phyl))-N-乙基碳二亚胺、DVS-二乙烯基砜和京尼平的交联剂来实现。根据本发明的一些实施方案，悬浮液包含至少95%水。根据本发明的一些实施方案，透明质酸以在水凝胶中约0. 5-1. 5%的浓度范围提{共。根据本发明的一些实施方案，多肽以在水凝胶中约20-100yg/ml的浓度范围提{共。根据本发明的一些实施方案，超氧化物歧化酶以在水凝胶中约5_40μ g/ml的浓 度范围提供。根据本发明的一些实施方案，基质或水凝胶还包含细胞。根据本发明的一些实施方案，组织是神经组织。根据本发明的一些实施方案，细胞是干细胞。根据本发明的一些实施方案，干细胞当接种在基质或水凝胶中时分化成神经元细 胞。根据本发明的一些实施方案，水凝胶为冻干形式。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语的含义与本发明所属技 术领域普通技术人员通常理解的含义相同。下文描述的是示例性的方法和/或材料，不过 与本文所述的这些方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于实施或试验本发明的实施方案。如有冲突，将以本发明说明书(包括定义在内)为准。另外，材料、方法和实施例 仅仅旨在说明本发明，并不表示必定限制本发明。
本文仅以举例的方式参照以下附图描述了本发明的一些实施方案。现将具体详细 地说明附图，不过要强调的是附图所示的细节仅以举例方式给出，目的是对本发明的实施 方案进行说明性讨论。这样，将说明书与附图相结合，能使本领域技术人员清楚明白如何可 以实施本发明的实施方案。本专利或申请文件含有至少一张彩色制作的图画。在提出请求并支付必要费用 后，专利局可提供带彩色图画的本专利或专利申请公开说明书的拷贝。附图中图1是现有技术的示意图，描绘了超氧化物歧化酶(SOD)同源物的氧化还原活性 位点，该位点包括包围着催化活性金属阳离子(在这里是铜Cu)的三个组氨酸残基(His 26、74和163)和一个天冬氨酸残基(Asp 159)。另选的金属阳离子有锌(Zn)、锰(Mn)和铁 (Fe)。图2A-F是各种培养条件下用博迪恩氏胶体银染色法(图2A-C)或结晶紫染色法 (图2D-F)进行染色的原代细胞的显微照片。衍自大鼠胚胎(妊娠16-18天)的大脑半球 的原代胎鼠脑细胞在塑料平皿上在Eagle培养基(补加2mM谷氨酰胺和5mg/ml葡萄糖的 Eagle基础培养基)存在下培养3天，然后用水凝胶[1. 2%透明质酸水凝胶(图2B)或透 明质酸超氧化物歧化酶_层粘连蛋白肽(SEQ ID NO 3)水凝胶(图2C-F)]或用Eagle培 养基覆盖细胞，再培养12天后进行染色和拍照。图2A-在Eagle培养基存在下培养的用 博迪恩氏胶体银染色法进行染色的原代细胞。注意细胞为单层，不存在分化细胞的聚集体 (放大倍数，xlOO)；图2B-用1.2%透明质酸水凝胶覆盖和用博迪恩氏胶体银染色法进行 染色的原代细胞。注意细胞聚集体(放大倍数，xlOO)；图2C-用透明质酸-超氧化物歧化 酶-层粘连蛋白肽(SEQ ID NO :3)水凝胶覆盖和用博迪恩氏胶体银染色法进行染色的原代 细胞。注意分化的神经元细胞，为典型的神经元生长，细胞结合成聚集体和聚结体，具有密 集的轴突出芽(放大倍数，x200)。图2D-F-用透明质酸-超氧化物歧化酶-层粘连蛋白肽 (SEQ ID NO 3)水凝胶覆盖下生长和用结晶紫染色法进行染色的原代细胞。注意具有密集 的轴突出芽的分化神经元细胞。图2D和E的放大倍数为x200，图2F的放大倍数为x400。图3是描绘本发明的新型层粘连蛋白肽的序列(SEQ ID NO 3)的示意图，该序列 由两个分别包含SEQ ID NO :1和2所示的氨基酸序列(以红色显示)的五肽(加框表示的 序列)和以下3个另外的二聚体组成在N末端位置的二聚体(KS)、在两个五肽之间的第 二二聚体(RS)和在尾部羧基末端的第三二聚体(CV)。本发明具体实施方案的描述本发明在其一些实施方案中涉及包含新型层粘连蛋白多肽的组合物，更具体涉及 但不唯独涉及包含该组合物的基质和水凝胶以及使用该组合物进行组织形成、再生和/或 修复的方法。在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明在其应用上并不一定 局限于以下描述中提出的或实施例所例示的细节内容。本发明还能有其他的实施方案，或者能以多种方式实施或执行。本发明人在将本发明付诸实施时设计了能够支持细胞(如神经元细胞)的增殖、 分化和/或迁移的新型层粘连蛋白多肽(SEQ ID NO :3)。该新型层粘连蛋白多肽包括两个 层粘连蛋白五肽IKVAV(SEQ IDNO 1)和YIGSR(SEQ ID NO 2)以及以下三个被设计作为潜 在的交联位点的二聚体在N末端位置的二聚体(KS)、在两个五肽之间的第二二聚体(RS) 和在羧基末端的第三二聚体(CV)。因此，如下文的实施例部分所示，本发明人产生了包含新型层粘连蛋白多肽和抗 氧化剂(超氧化物歧化酶)的多糖(透明质酸)_基水凝胶。该水凝胶当与干细胞混合时 能够诱导神经元细胞分化(实施例2和图2C-F)。相反，没有新型层粘连蛋白多肽的透明质 酸基水凝胶不能支持神经元细胞分化(实施例2，图2B)。另外，用京尼平对水凝胶组分进 行交联并没有降低水凝胶支持细胞增殖和分化的能力(实施例2)。因此，本发明的一个方面提供包含SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的分离多肽。术语“多肽”或“肽”在本文中可互换使用，涵括天然肽(降解产物、合成法合成的 肽或重组肽)和模拟肽(通常为合成法合成的肽)以及作为肽类似物的拟肽和半拟肽，所 述肽类似物可具有例如能使肽在体内时更稳定或更能够渗透到细胞中的修饰。这种修饰包 括但不限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S = 0、0 =C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S = C_NH、CH = CH或CF = CH)、主链修饰和残基修饰。制备模拟 肽化合物的方法是本领域公知的，在例如Quantitative Drug Design, C. A. Ramsden Gd., Chapter 17. 2，F. Choplin Pergamon Press (1992)中有详细说明，该文献通过引用并入本 文，犹如在本文中全文给出。这个方面的更多细节在下文提供。肽当中的肽键(-C0-NH-)可例如被以下的键取代N-甲基化键(_N(CH3)_C0_)、酯 键(-C (R) H-C-O-O-C (R) -N-)、酮亚甲基键(-C0-CH2-)、α -氮杂键(-ΝΗ-Ν (R) -C0-)，其中 R为任何烷基，例如甲基、carba键(-CH2-NH-)、羟亚乙基键(-CH(OH) -CH2-)、硫代酰胺键 (-CS-NH-)、烯烃双键(-CH = CH-)、反酰胺键(-NH-C0-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-C0-)，其中 R为天然呈现在碳原子上的“正常”侧链。这些修饰可出现在肽链上的任何键，甚至同时出现在几个(2-3个)键。天然芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe可用合成的非天然酸如TIC、萘基丙氨酸(Nol)、 Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或ο-甲基-Tyr取代。除以上之外，本发明的肽还可包括一个或多个修饰氨基酸或一个或多个非氨基酸 单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。术语“氨基酸”理解为包括20个天然氨基酸；常在体内进行翻译后修饰的氨基酸， 例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他非常见氨基酸，包括但不限于2-氨基 己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-和 L-氨基酸。下表1和2列出了可用于本发明的天然氨基酸(表1)或修饰氨基酸(例如合成 氨基酸，表2)。表 权利要求
一种多肽，其包含SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
2.一种组成物，其包含多糖和权利要求1的多肽。
3.权利要求2的组成物，其中所述多糖是透明质酸。
4.权利要求2的组成物，其还包含抗氧化剂。
5.一种组成物，其包含透明质酸、层粘连蛋白多肽和抗氧化剂。
6.权利要求4或5的组成物，其中所述抗氧化剂是超氧化物歧化酶(SOD)。
7.权利要求5的组成物，其中所述层粘连蛋白多肽为SEQIDNO :3所示。
8.一种组成物，其包含透明质酸、超氧化物歧化酶(SOD)和权利要求1的多肽。
9.权利要求6或8的组成物，其中所述超氧化物歧化酶包含SEQIDNO :4所示的氨基 酸序列。
10.权利要求2-7和9中任一项的组成物，其中所述多糖、所述抗氧化剂和/或所述多 肽是交联的。
11.权利要求8的组成物，其中所述透明质酸、所述超氧化物歧化酶(SOD)和所述多肽 是交联的。
12.—种基质，其包含权利要求2-11中任一项的组成物。
13.—种水凝胶，其包含权利要求2-11中任一项的组成物。
14.一种产生水凝胶的方法，所述方法包括将权利要求2-9中任一项的组成物悬浮于 水中以获得包含至少80%水的悬浮液，从而产生水凝胶。
15.权利要求14的方法，其还包括使所述组成物交联。
16.权利要求15的方法，其中所述交联是用选自EDC-N-(3- 二甲氨基丙基)-N-乙基碳 二亚胺、DVS- 二乙烯基砜和京尼平的交联剂来实现。
17.权利要求14的方法，其中所述悬浮液包含至少95%水。
18.权利要求13的水凝胶或权利要求14的方法，其中所述透明质酸以在所述水凝胶中 约0. 5-1. 5%的浓度范围提供。
19.权利要求13的水凝胶或权利要求14的方法，其中所述多肽以在所述水凝胶中约 20-100 μ g/ml的浓度范围提供。
20.权利要求13的水凝胶或权利要求14的方法，其中所述超氧化物歧化酶以在所述水 凝胶中约5-40 μ g/ml的浓度范围提供。
21.权利要求12的基质或权利要求13的水凝胶，其还包含细胞。
22.—种诱导组织的离体形成的方法，其包括(a)提供权利要求12的基质或者权利要求13、18、19和20中任一项的水凝胶，和；( )用在适于所述细胞的增殖、分化和/或迁移的培养基中的细胞接种所述基质或所 述水凝胶，从而诱导组织的形成。
23.一种诱导组织的体内形成的方法，所述方法包括将权利要求12的基质或者权利要 求13、18、19和20中任一项的水凝胶植入受试者体内，从而诱导组织的形成。
24.一种治疗具有以组织患病、损伤或损失为特征的病状的受试者的方法，所述方法包 括将权利要求12的基质或者权利要求13、18、19和20中任一项的水凝胶植入在受试者的 患病、损伤或损失的组织处或附近，从而诱导组织的形成和治疗受试者。
25.权利要求22、23或24的方法，其中所述组织是神经组织。
26.权利要求21的基质或水凝胶，或者权利要求22的方法，其中所述细胞是干细胞。
27.权利要求26的基质、水凝胶或方法，其中所述干细胞当接种在所述基质或所述水 凝胶中时分化成神经元细胞。
28.权利要求13、18、19和20中任一项的水凝胶，其为冻干形式。
全文摘要
本发明公开了包含SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的新型层粘连蛋白多肽。还公开了包含多糖(例如透明质酸)和该新型层粘连蛋白多肽或者包含透明质酸、层粘连蛋白多肽和抗氧化剂(如超氧化物歧化酶)的组成物，以及包含所述组成物的、可用于离体或体内组织形成和用于治疗以组织患病、损伤或损失为特征的病状的基质和水凝胶。
文档编号C07K14/78GK101965357SQ200880112384
公开日2011年2月2日 申请日期2008年8月13日 优先权日2007年8月15日
发明者S·罗克金德, Z·尼沃 申请人:特拉维夫大学拉莫特有限公司;特拉维夫医疗中心医学研究基础设施和保健服务基金会