用于肺部传递给药的组合物的制作方法

专利名称：用于肺部传递给药的组合物的制作方法
用于肺部传递给药的组合物本发明涉及直接肺部传递多肽例如域抗体的方法，并涉及适于直接肺部传递的特 定多肽组合物。本发明还涉及这样的组合物在药物中的用途，所述药物例如用于治疗和诊 断肺病，例如用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
背景技术：
治疗剂或诊断剂经常不能渗透入组织或器官中，因而不能在特别需要的位置产生 所需的治疗或诊断作用。因此，需要将这样的治疗剂或诊断剂直接给予组织或器官的方法，例如直接给予 到肺组织，使该药剂产生较长的治疗窗。还需要包含这样的治疗剂或诊断剂的特定组合物，所述组合物尤其适于直接给予 特定的组织或器官，例如需要包含特别适合于直接给予到肺的治疗剂或诊断剂的组合物。 这样的组合物可用于疾病的治疗、诊断或预防，例如用于呼吸道疾病的治疗、诊断或预防， 其中所述药剂被配制用于直接局部给予至肺组织。这样的药剂的实例为域抗体(dAb)。业已发现，结合肺组织中的靶的域抗体(dAb)可用于生产治疗或预防呼吸道疾病 的组合物，其中所述组合物适于局部给予到肺组织。在一个实施方案中，可以使用多达约 10mg/kg的结合肺组织靶的dAb。在另一个实施方案中，肺组织的靶介导肺部炎症或肺病 (参见W02007049017的公开内容，其内容通过引用结合到本文中)。一个令人感兴趣的靶是肿瘤坏死因子(TNF- α )途径，人们相信该途径与肺病(如 C0PD)和哮喘的发病有关。已产生了一些抑制TNFRl的域抗体(dAb)，对这些域抗体(dAb)已有描述(例如在 WO 2007049017和WO 06038027中)，它们可有效治疗肺部炎症或呼吸道疾病，例如慢性阻 塞性肺病(COPD)。TNF-α具有与COPD相关的广谱炎性作用，通过释放蛋白酶导致嗜中性粒细胞、 单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞粘液分泌的活化和肺实质的破坏(Barnes PJ等人，Chronic obstructive pulmonary disease :molecular and cellular mechanisms. Eur Respir J. 2003 年 10 月；22 (4) :672-88)。已公布的研究表明，与一般吸烟者和哮喘患者相比，TNF- α在COPD患者的诱导痰
(Keatings VM ^A, Differences in interleukin-8 and tumor necrosis factor-alpha in induced sputum from patients with chronic obstructive pulmonary disease or asthma. Am J Respir Crit Care Med. 1996 年 2 月；153 (2) 530-4)。另外，增加的TNF-α表达可能暂时与COPD患者的病情恶化相关(Calikoglu M等 人’ Leptin and TNF-alpha levels in patients with chronic obstructive pulmonary disease and their relationship to nutritional parameters. Respiration. 2004 年 1 月-2 月；71(1) :45-50)。TNFRl的表达似乎在分离自COPD患者的外周T细胞上增加(Hodge. G.等人， Increased intracellular T helper 1 proinflammatory cytokine production inperipheral blood, BAL and intraepithelial T cells of COPD subjects. Clin. Exp. Immunol. 2007. 150(1). 22-29)。此外，升高的外周可溶性TNFRl水平与急性肺损伤患者和呼吸机诱导性肺损伤患 者的发病率和死亡率密切相关(Parsons，P. E.等人，Elevated plasma levels of soluble TNF receptors are associated with morbidity and mortality in patients with acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005. 288 :L426_L431)。肿瘤坏死因子α是一种在病理状况下的体液中以低浓度存在的多效性细胞因 子。它是免疫学和病理生理反应的主要介导物。TNF-α主要由活化的巨噬细胞和单核细胞 产生，但也由许多其它细胞类型产生，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞和成纤维细胞。TNF-a 一般以^kDa前体合成，其以膜结合形式储存于细胞上。在由细胞释放之前，前体形式转变 为可溶性的17kDa TNF-a，并由TNF-α转化酶(TACE)或其它基质金属蛋白酶活化。TNF-a是结合两种不同的细胞表面受体的同三聚体，两种受体为55_60kDa TNFRl 链和70-80kDa TNFR2链，它们均以非共价结合的同三聚体受体复合物存在。TNFR由广泛的 细胞表达。例如，迄今还没有在体内发现不表达TNFRl的细胞类型，而TNFR2主要由免疫细 胞和内皮细胞表达。TNFRl和TNFR2是主要在它们的胞外结构域中具有同源性的单跨膜糖蛋白， 它们包含4个串联重复的富半胱氨酸基序。它们包含几个具有已知功能意义的基序。TNFRl 和TNFR2均包含胞外前配体结合装配结构域(PLAD)(与配体结合区不同)，其预复合受体， 特别是在被TNF-α配体活化时促进三聚化。TNFRl包含至受体的羧基末端约80个氨基酸 长度的死亡结构域(DD)基序，对TNFRl的死亡诱导活性很关键。于0°C的结合研究确定了 TNF- α对两种TNFR的高亲和性结合，对TNFRl的Kd值约 为 300-600ρΜ，对 TNFR2 的 Kd 值约为 70_200pm (MacEwan DJ.等人，TNF receptor subtype signalling :differences and cellular consequences. Cell Signal. 2002年6月；14(6) 477-92)。然而，TNFRl (而不是TNFR2)于生理温度时是可溶性TNF-α的高亲和性受体(Kd = 19ρΜ)，这主要由TNF-α对TNFRl的非常慢的离去速率驱动。TNF-a与TNFRl的复合物非 常稳定，平均存活时间为大约48分钟，更有可能被内化(相比于解离)，产生在胞内持续存 在的信号转导复合物。TNFRl和TNFR2均还能够结合与TNF-a同源(30%氨基酸同一性) 的淋巴毒素。淋巴毒素在男性中的功能性作用很大程度上是未知的。膜结合型TNF-a结合并活化TNFRl和TNFR2 二者。而可溶性TNF_a不结合 TNFR2，相比于膜结合型TNF-a对TNFR2的活化，随后的信号转导显著降低。TNFR2 — 旦被活化，就被基质金属蛋白酶(MMP)切割为可溶性形式，其仍能够结合TNF-a配体 (Pennica D 等人，Biochemical properties of the 75~kDa tumor necrosis factor receptor. Characterization of ligand binding, internalization, and, receptor phosphorylation. J Biol Chem. 1992 年 10 月 15 日；267(29) :21172-8)。多个实验方案已揭示，TNF-Rl启动TNF-α的大部分生物活性。TNF-α与TNF-Rl 的结合触发一系列胞内事件，其最终导致两种主要转录因子的活化核因子kB(NF-kB)和 c-Jun。这些转录因子的作用是诱导表达对于不同生物学过程都重要的基因，所述生物学过 程包括细胞的生长及死亡、发育、瘤形成和免疫、炎症以及应激反应。对于单核细胞增生李斯特菌或结核分枝杆菌的感染，TNFRl缺陷的转基因小鼠显示出更高的敏感性，但却能抵抗 TNF-α或白介素-1介导的体内致命性，并且能抵抗由脂多糖和D-半乳糖胺诱导的内毒素 休克模型。还已经表明，TNFRl能控制早期移植物抗宿主病。使用TNFR2缺陷的转基因小鼠的研究已表明，TNFR2在几种有益的免疫学过程中 起重要作用。已表明TNFR2在以下方面起作用抗原驱动的T细胞应答和增殖(The type 1 receptor(CD120a) is the high-affinity receptor for soluble tumor necrosis factor. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 年 1 月 20 日；95 (2) :570-5.)、抗肿瘤作 用(Zhao X 等人，Tumor necrosis factor receptor 2-mediated tumor suppression is nitric oxide dependent and involves angiostasis. Cancer Res. 2007 年 5 月 1 日；67(9) :4443-50)、缺血诱导的新血管化(Goukassian DA，等人，Tumor necrosis factor-alpha receptor p75 is required in ischemia-induced neovascularization. Circulation. 2007年2月13日；115(6) :752-62)、树突细胞-天然杀伤细胞交扰朗格汉斯 细胞迁移° 最后，Higuchi Y 等人(Higuchi, Y.等人，Tumor necrosis factor receptors 1 and 2 Differentially Regulate Survival, Cardiac Dysfunction, and Remodeling in Transgenic Mice With Tumor Necrosis Factor Induced Cardiomyopathy. Circulation. 2004 ；109 :1892-1897)表明，经由TNFR2的信号转导可以在细胞因子介导的 心力衰竭发病机理中起保护心脏的作用。TNFRl的特异性阻断可以潜在地使TNF-α经由 TNFR2的信号转导发挥出其某些有益的免疫功能，同时消除TNFRl信号转导的有害作用。临床前研究和临床研究已鉴定并验证，在许多免疫介导的炎性疾病中，TNF-α为 关键的疾病分子和免疫治疗干预的治疗靶。临床适应症包括类风湿性关节炎、克罗恩氏病、 强直性脊柱炎和银屑病。最近的临床发现表明，许多慢性炎性疾病共有某些致病途径，而 其它疾病限于具体的疾病表型。使用抗-TNFa剂作为探测剂，已证实TNF-α能调节其它 促炎细胞因子例如IL-Ia和IL-I β、向关节的炎性细胞募集、基质金属蛋白酶和滑液血管
(Taylor PC 等人，Tumour necrosis factor alpha as a therapeutic target for immune-mediated inflammatory diseases. Curr Opin Biotechnol.2004年 12 月；15 (6) 557-63)。TNF-α可以在肺病如COPD和哮喘中起关键作用，并增强炎性反应，通过蛋白酶的 释放导致上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞粘液分泌的活化以及肺实质的破 坏。COPD的特征在于缓慢进行性发展的气管狭窄，这是完全不可逆的。传统意义上， COPD包括慢性支气管炎和肺气肿两方面的临床表现或病理表现。在临床上，慢性支气管炎 定义的基础是引起痰性咳嗽的粘液产生，而肺气肿是肺泡破坏的病理过程。除了显著的炎 性浸润以外，在诊断患有COPD的患者的气管中，粘液细胞增生增加和肥大均是明显的。尽 管临床上相关的粘液分泌的主要部位仍是较大的气管，但大部分气流阻塞被认为存在于非 软骨的膜细支气管和末端气管中。小气管的长期炎症导致上皮下纤维化、细支气管壁厚度 增加以及粘液性气道阻塞。与一般吸烟者和哮喘患者相比，在COPD患者的诱导痰中存在较高浓度的 TNF- α (Keatings VM 等 人’ Differences in interleukin-8 and tumour necrosis factor-alpha in induced sputum from patients with chronic obstructive pulmonarydisease or asthma. Am J Respir Crit Care Med. 1996年 2 月；153 (2) :530-4)。另夕卜，增加 WTNF-Ci表达可能暂时与COPD患者的病情恶化相关(先前援引的Calikoglu等人，2004)。 尽管似乎还没有研究肺组织中的TNFRl和TNFR2表达，但已表明外周可溶性TNFR2水平在 COPD患者中增加，而TNFRl的表达似乎在分离自COPD患者的外周T细胞上增加(Hodge. G.等人，Increased intracellular T helper 1 proinflammatory cytokine production in peripheral blood, BAL and intraepithelial T cells of COPD subjects. Clin. Exp. Immunol. 2007. 150 (1). 22-29.)。而且，升高的外周可溶性TNFRl水平与急性肺损 伤患者和呼吸机诱导性肺损伤患者的发病率和死亡率密切相关(Parsons，P. Ε.等人， Elevated plasma levels of soluble TNF receptoes are associated with morbidity and mortality in patients with acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005. 288 :L426_L431)。在伴有体重减轻和骨骼肌减少的COPD患者中，TNF-α的血清浓度和外周单核细 胞的诱导性TNF-α生产增加。这意味着在恶病质病因学中TNF-α通常与严重COPD相关。因此，已产生了抗-TNFRl域抗体来抑制TNFRl靴(参见例如W02007049017和 W006038027中的公开内容)。尤其需要通过直接肺部传递这样的抗TNFRl域抗体，来实现例如治疗或预防肺病 的TNFRl靶的局部抑制，因此，需要包含可抑制TNFRl靶的药剂(例如抗TNFRl域抗体)的 组合物，所述组合物尤其适于直接给予到肺组织。这样的组合物可用于治疗或预防呼吸道 疾病，例如COPD或哮喘或肺结节病。短语“免疫球蛋白单可变结构域”是指独立于其它不同的V区或结构域，特异性结 合抗原或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VJ。免疫球蛋白单可变结构域可以与其它可变区 或可变结构域以一定形式(例如同多聚体或异多聚体)存在，其中所述其它区或结构域不 是单免疫球蛋白可变结构域进行抗原结合所需要的(即其中免疫球蛋白单可变结构域独 立于其它不同的可变结构域结合抗原)。“域抗体”或“dAb”与本文使用的术语“免疫球蛋 白单可变结构域”相同。在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域是人抗体可变结构 域，但也包括其它物种如啮齿类动物(例如WO 00/29004中所公开的，其内容整体通过引用 结合到本文中)、护士鲨和骆驼类Vhh dAb的单抗体可变结构域。骆驼类Vhh是免疫球蛋白 单可变结构域多肽，其来源于包括骆驼、无峰驼、羊驼、单峰驼和原驼的物种，产生天然缺少 轻链的重链抗体。“结构域”是折叠的蛋白结构，其具有与蛋白的其它部分无关的三级结构。一般而 言，结构域形成蛋白的独立功能特性，在许多情况下，可以添加、除去或转移至其它蛋白，而 不丧失蛋白和/或结构域的其余部分的功能。“单抗体可变结构域”是折叠的多肽结构域， 其包含特征为抗体可变结构域的序列。因此其包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结 构域，例如其中一个或多个环已被不以抗体可变结构域为特征的序列替代，或者已被截短 或包含N末端或C末端延长的抗体可变结构域，以及保留全长结构域的至少结合活性和特 异性的可变结构域的折叠片段。发明概述我们现在已开发了包含以下或由以下组成的组合物(a)多肽，例如抗体(例如单 克隆抗体)或免疫球蛋白多肽，例如域抗体(dAb)，或者例如纳米抗体，以及(b)药学上可接受的缓冲液，其中所述组合物包含液滴，且在所述组合物中存在的液滴中，约40%或以上 (例如50%或以上)的液滴小于约6微米，例如约1微米至约6微米，例如小于约5微米， 例如约1微米至约5微米。这些组合物例如尤其适于通过直接局部肺部传递给予患者。例 如，这些组合物可以直接给予到肺，例如通过吸入，例如通过使用喷雾器装置。因此，本发明提供包含以下或由以下组成的组合物(a)多肽，例如免疫球蛋白多 肽，例如域抗体(dAb)或例如纳米抗体组合物，以及(b)药学上可接受的缓冲液，其中所述 组合物包含液滴，且在所述组合物中存在的液滴中，约40%或以上(例如50%或以上)的 液滴小于约6微米，例如约1微米至约6微米，例如小于约5微米，或例如约1微米至约5 微米，例如通过直接局部肺部传递给予患者。这些组合物可以包含生理学上可接受的缓冲 液，其具有约4至约8的pH范围，例如约7至约7. 5，并且其粘度约等于约2%至约10% PEG 1000在含1.2% (重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。在所述组合物中存在的液滴中，至少40%的液滴、例如50%或以上、例如80%或 以上的液滴的大小小于约6微米，例如约1微米至约6微米。小于约6微米的液滴大小范 围可以为例如约1微米至约6微米，例如约2微米至约5微米，对于传递至深肺，其可优选 为例如约2微米至约3微米。目前已知的药学上可接受的缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、 乙酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液。所述缓冲液还可以包含添加剂，例如(a)增加粘度的物质， 例如PEG，例如PEG 1000 ；糖，例如蔗糖、甘露糖、Iutrol (例如Iutrol 44)，和/或(b)稳定 剂，例如洗涤剂。本发明进一步涉及如上所述的组合物，其还进一步包含药学上可接受的载体、稀 释剂或赋形剂。所述多肽可以包含以下或由以下组成例如治疗性、预防性或诊断性多肽，其需要 向受试者传递，例如至多约150个氨基酸的所述多肽。所述多肽可以为例如抗体(例如单克隆抗体)或免疫球蛋白多肽，或者它们可以 为例如多肽结构域，例如单体，例如至多约150个氨基酸。所述多肽可以包含以下或由以下组成例如域抗体(“dAb”)，例如域抗体(dAb)单体。所述多肽还可以包含以下或由以下组成非IgG样的骨架，例如亲和体 (affibody) 0本文使用的术语“多肽”或域抗体(“dAb”)还用于指例如与其它分子融合或缀合 或结合的多肽或dAb，例如需要将其传递给患者，例如Albudab，其中dAb与人血清白蛋白结 合，以延长半衰期(参见例如WO 2005118642和WO 2006059106，其教导通过引用结合到本 文中)。所述多肽，例如域抗体分子，例如dAb单体，可以结合目标靶，例如存在于肺组织 中的靶，所述靶可以为例如在肺病症或肺疾病或肺障碍中起作用的靶，例如，所述靶可以为 TNF受体，例如TNFRl。所述多肽还可以结合一个以上的靶，例如它们可以为双重靶向dAb， 例如在W02004058821中所述那些。dAb可以结合任何目标靶分子。dAb还可以为具有一定形式或格式(formatted) 的dAb，例如它们可以为dAb-FC融合蛋白，或者它们可以连接至另一个基团，例如PEG基团。dAb还可以为连接另一个分子的基团，例如作为融合蛋白，例如连接至结合靶的另一个 分子。本发明还涉及如上所述的组合物的用途，例如域抗体(dAb)组合物，例如其结合 肺组织中的靶，用于通过直接局部肺部传递给予患者。还提供本文所述的组合物，例如本文所述的dAb组合物，用于药物，所述药物用于 例如治疗、预防或诊断呼吸道疾病或肺疾病或肺障碍，例如COPD或哮喘或肺结节病。本发明还涉及组合物(例如上述的dAb组合物)在生产用于治疗、预防或诊断呼 吸道疾病或肺疾病或肺障碍的药物中的用途。在一个实施方案中，可以使用至多约IOmg结 合肺组织中的靶的dAb。肺组织中的靶可以为介导肺炎症或肺疾病的靶。还提供治疗、预防或诊断疾病或病症(例如呼吸道病症或肺疾病或肺障碍)的方 法，其包括给予患者一定量(例如治疗有效量)的本文所述组合物，例如dAb组合物。作 为日剂量给予的剂量范围可以在约5mg/Kg患者体重至约0. 005mg/Kg患者体重，例如约 0. 5mg/Kg至约0. lmg/Kg患者体重。在某些实施方案中，将组合物直接给予到肺组织，例如 通过吸入，例如通过使用喷雾器、鼻内装置或吸入装置。本发明进一步涉及传递装置，例如喷雾器、吸入器或鼻内传递装置，以及其用途， 其用于向患者提供一定剂量(例如计量剂量)的本文所述组合物(例如dAb组合物)，以治 疗或预防或诊断疾病或病症(例如呼吸道疾病或病症)，其中吸入器或鼻内传递装置装有 dAb制剂，并且例如提供计量的日剂量，例如包含至多IOmg dAb。可以依据本发明使用不同 类型的喷雾器装置，例如喷射式喷雾器装置，如PARI，以及例如振荡筛喷雾器，例如eFlow 和Aeroneb，还有例如超声装置，例如DeVilbiss和Kun-88。本发明还提供生产本发明的组合物的方法，其包括以下步骤混合(a)多肽，例如 域抗体(dAb)和(b)药学上可接受的缓冲液，例如这样的缓冲液其具有约4至约8的pH 范围，例如约7至约7. 5，并且其粘度约等于约2%至约10% PEG 1000在含1.2% (重量/ 体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。还可以加入添加剂，例如药学上可接受 的稀释剂、载体或赋形剂，和/或增加粘度的药剂，和/或稳定剂。本发明还涉及本文所述的组合物(例如本文所述的域抗体(dAb)组合物)用于诊 断目的(例如用于造影)的用途，其中免疫球蛋白样分子(例如域抗体)的重链部分或轻 链部分可以有利地包含可检测标记。适宜的可检测标记和用于标记药剂的方法是本领域众 所周知的。适宜的可检测标记包括例如放射性同位素(例如铟-111、锝_99m或碘-131)、 正电子发射标记(例如氟-19)、顺磁离子(例如钆(Gadlinium) (III)、锰(II))、表位标记 (标签)、亲和标记(例如生物素、抗生物素蛋白)、自旋标记、酶、荧光基团或化学发光基团。 当不使用标记时，可以通过表面等离子体共振或其它适宜的方法测定复合物形成。本发明还涉及本文所述的组合物(例如本文所述的域抗体(dAb)组合物)在制备 喷雾器、吸入器或鼻内传递装置中的用途，用于提供局部传递至肺的长效吸入dAb制剂。本发明还涉及将组合物(例如本文所述的域抗体(dAb)组合物，其结合肺组织中 的靶)给予患者以在肺组织中产生长治疗窗的方法，该方法包括向所述患者的肺组织局部 给予有效量的所述组合物，例如本文所述的所述域抗体(dAb)组合物。本发明还涉及生产多肽组合物如dAb组合物的方法，所述组合物用于例如治疗、 预防或诊断肺病症或肺疾病，所述方法包括混合(a)多肽和(b)生理学上可接受的缓冲液，所述缓冲液具有约4至约8的pH范围，并且其粘度约等于约2%至约10% PEG 1000在含 1. 2% (重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。本发明进一步涉及生产多肽组合物如dAb组合物的方法，其包括以下步骤(a)混 合多肽和生理学上可接受的缓冲液，所述缓冲液例如这样的缓冲液其具有约4至约8的 PH范围，并且其粘度约等于约2%至约10% PEG 1000在含1.2% (重量/体积)蔗糖的 50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度，然后(b)，使得自步骤(a)的多肽和缓冲液组合物通过 喷雾器、吸入器或鼻内传递装置。本发明还进一步涉及生理学上可接受的缓冲液在制备例如用于肺部传递的多肽 组合物(例如dAb组合物)中的用途，所述缓冲液具有约4至约8的pH范围，并且其粘度 约等于约2%至约10% PEG 1000在含1. 2% (重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中 的溶液的粘度。本发明还涉及将所需分子传递入系统循环中的方法，所述方法包括首先通过吸入 (例如使用喷雾器、鼻内装置或吸入装置)将本文所述的组合物给予到肺。本发明还涉及本文所述的dAb以及本文所述包含这些dAb的组合物，涉及如上所 述的dAb的用途，以及制备这些dAb组合物的方法，并且还涉及例如如上所述的喷雾器或吸 入器装置，其包含这些dAb组合物。附图简述

图1 显示了针对TNFRl的Domlh-131前导域抗体的氨基酸序列。图2 显示了在人TNFRl受体结合测定中的TNF-α剂量曲线。每种样品均以4份 复制品测试。图 3 显示了 D0M1H-131-202、D0M1H-131-206 和 D0M1H-131-511 在人 TNFRl 受体 结合测定中的抑制。每种样品均以4份复制品测试。图 4 显示了 D0M1H-131-202、D0M1H-131-511 和 D0M1H-131-206 的蛋白酶稳定性数据。图5 显示了缓冲液和装置对GSK 1995056Α(511)的雾化液滴大小的影响。图6:显示了在各种装置中雾化后依据通过SEC检测的二聚体形成评价的 D0M1H-131-511(511)稳定性。图7 显示了使用Pari LC装置对206AT 40mg/ml至多1小时的SEC追踪。图8 显示了 RBA结果，表明D0M1H-131-511 (511)在雾化后保留活性。图 9 显示了 D0M1H-131-202Q02)、D0M1H-131-206Q06)和 D0M1H-131-511 (511) 在Pari E-flow和LC+中的喷雾器测试。在Britton-Robinson或配制缓冲液中的蛋白浓 度为5mg/ml。标准品(药物X)作为对照以其自身用于传递的配制缓冲液测试。图10 显示了在使用振荡筛喷雾器(E-flow，Pari)雾化前和雾化后对 D0M10-53-474 的 SEC 追踪。图11 显示了在使用喷射式喷雾器(LC+，Pari)雾化前和雾化后对D0M10_53_474 的SEC追踪。图显示了以下的氨基酸序列(a)毒蜥外泌肽4(G4S)3D0M^i-14融合蛋 白(DAT0115)、(b)D0M10-53-474(抗 IL_13dAb)、(c)D0M10-275-78 (抗 IL_13dAb)、(d) D0M4-130-202(抗 IL-1R1)和(e)D0M4-130-201(抗 IL-1R1)。
图 13a-d 显示了某些抗 TNFRl dAb 的氨基酸序列(a)Domlh-131_201、(b)Dom lh-131-203、 (c)Dom lh_131_204、 (d)Domlh-131-205。图 14a_i :显示了 某些抗 VEGF dAb 的氨基酸序列(a) Doml5-26_593、(b) Dom 15-26-501、 (c)Dom 15-26-555、 (d)Dom 15-26-558、 (e)Dom 15-26-589、 (f) Dom 15-26-591dAb、(g)Dom 15-26-594、(h)Dom 15-26-595、(i)DMS 1529 (VEGF dAb 1546-593-Fc 融合蛋白)。发明详述定义短语“免疫球蛋白单可变结构域”是指独立于其它V区或结构域、特异性结合抗原 或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VJ。免疫球蛋白单可变结构域可以与其它可变区或可变 结构域以一定形式(例如同多聚体或异多聚体)存在，其中其它区或结构域不是单免疫球 蛋白可变结构域进行抗原结合所需要的(即其中免疫球蛋白单可变结构域独立于其它的 可变结构域结合抗原)。“域抗体”或“dAb”与本文使用的术语“免疫球蛋白单可变结构域” 相同。在某些实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域为人抗体可变结构域，但也包括其它物 种如啮齿类动物(例如WO 00/29004中所公开的，其内容整体通过引用结合到本文中)、护 士鲨和骆驼类Vhh dAb的单抗体可变结构域。骆驼类Vra是免疫球蛋白单可变结构域多肽， 其来源于包括骆驼、无峰驼、羊驼、单峰驼和原驼等物种，产生天然缺少轻链的重链抗体。“结构域”是折叠的蛋白结构，其具有与蛋白的其它部分无关的三级结构。一般而 言，结构域形成蛋白的独立功能特性，在许多情况下可以添加、除去或转移至其它蛋白，而 不丧失蛋白和/或结构域的其余部分的功能。“单抗体可变结构域”是折叠的多肽结构域， 其包含特征为抗体可变结构域的序列。因此其包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结 构域，例如其中一个或多个环已被不以抗体可变结构域为特征的序列替代，或者已被截短 或包含N末端或C末端延长的抗体可变结构域，以及保留全长结构域的至少结合活性和特 异性的可变结构域的折叠片段。术语“多肽”是指任何种类的多肽，例如肽；人蛋白；人蛋白片段；非人来源的蛋白 或蛋白片段；工程改造形式的蛋白或蛋白片段；酶；抗原；药物；涉及细胞信号转导的分子 如受体分子；抗体，包括免疫球蛋白超家族的多肽，例如抗体多肽或T-细胞受体多肽。所述多肽例如可以为抗体或免疫球蛋白多肽，或者它们可以为例如多肽结构域， 例如单体，例如至多约150个氨基酸。所述多肽可有用地包含以下或由以下组成例如域抗体(“dAb”)，例如dAb单体。所述多肽还可以包含以下或由以下组成非IgG样骨架，例如亲和体。本文使用的术语“多肽”或域抗体(“dAb”)还用于指例如与其它分子融合或缀 合或结合的多肽或dAb。例如，所述多肽例如dAb可被PEG化，PEG化的dAb例如描述于 W02004081(^6。所述多肽例如dAb可以与血清白蛋白结合，例如它们可以为W02005118642 和W02006059106中所述的连接血清白蛋白的dAb (Albudab)。有利的是，所述抗体多肽可以包含重链(Vh)多肽和轻链(VJ多肽，或者包含重链 (Vh)多肽或轻链(Vl)多肽的单域抗体库(single domain antibody repertoires)。本文 使用的抗体多肽是修饰的或未修饰的抗体或抗体组成部分的多肽。因此，术语抗体多肽包 括重链、轻链、重链-轻链二聚体、Fab片段、F(ab' )2片段、重链单结构域、轻链单结构域、Dab片段或Fv片段(包括单链Fv(SCFV))。构建这样的抗体分子和编码它们的核酸的方法 是本领域众所周知的。本文所述包含多肽(如域抗体)的组合物可以结合肺组织中的靶，所述靶选自 TNFRl、IL-I、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、 IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα 1、IL_13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、 IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、 CD56、CD 138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、凝乳酶、 FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性粒细胞趋化因子(例如嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性 粒细胞趋化因子_2、嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、GM-CSF、ICAM-I、I COS, IgE、IFNa、1-309、 整联蛋白、L-选择素、MIF、MIP4、MDC、MCP-U MMPs、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、骨桥蛋白、 0X-40、PARC、PD-U RANTES, SCF、SDF-I、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素8、TARC, TGFb, 疑血醇、Tim-I、TNF、TNFRl、TRANCE、类姨蛋白醇、VEGF, VLA—4、VCAM、 α 4 β 7、CCR2、CCR3、 CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、α ν β 6、α ν β 8、cMET 禾口 CD8。本文所述包含多肽(如域抗体)的组合物还可以结合系统性靶，例如所述靶可以 为GLP-1、毒蜥外泌肽和干扰素。在一个实施方案中，本文所述的包含多肽(如域抗体)的组合物可以结合选自 TNF信号转导级联中的蛋白的靶。在某些实施方案中，该蛋白靶选自TNFa、TNFi3、TNFR2、 TRADD、FADD、半胱天冬酶-8、TNF受体相关因子(TRAF)、TRAF2、受体互作蛋白(RIP)、Hsp90、 Cdc37、IKK α、ΙΚΚβ、NEMO、kB抑制剂(IkB)、NF_kB、NF-kB必需调节物、凋亡信号调节性 激酶-1 (aSMase)、中性神经磷脂酶(nSMase)、ASKl、组织蛋白酶-B、生发中心激酶(GSK)、 GSK-3、死亡结构域蛋白相关因子(FADD)、中性神经磷脂酶活化相关因子(FAN)、FLIP、 JunD, NF-kB激酶抑制剂(IKK)、MKK3、MKK4、MKK7、IKK γ、有丝分裂原活化的蛋白激酶/ Erk 激酶激酶(MEKK)、MEKKl、ΜΕΚΚ3、NIK、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、PKC- ζ、RelA, Τ2Κ、TRAFU TRAF5、死亡效应子结构域(DED)、死亡结构域(DD)、死亡诱导信号转导复合物 (DISC)、凋亡蛋白抑制剂(IAP)、c-Jim N-末端激酶(JNK)、有丝分裂原活化的蛋白激酶 (MAPK)、磷酸肌醇-30H 激酶(PI3K)、蛋白激酶 A(PKA)、PKB、PKC、PLAD, PTEN、rel 同源结 构域(RHD)、真正令人感兴趣的新基因(RING)、应激激活的蛋白激酶(SAPK)、TNF α转化酶 (TACE)、死亡结构域蛋白沉默子(SODD)和TRAF相关的NF_kB活化剂(TANK)。关于这些优 选的靶，参考W004046189、W004046186和W004046185 (通过引用结合到本文中)，这些文献 为如何选择用于靶向胞内靶的抗体单可变结构域提供了指引。本发明尤其涉及TNFRl拮抗剂，其为如本文所述配制的域抗体，并涉及其在制备 用于治疗、抑制或预防肺部炎症和/或呼吸道疾病例如COPD或哮喘的药物中的用途。还提供本文所述用于肺部传递的组合物，其包含结合IL-13的分子例如dAb，例如 用于治疗哮喘。这些dAb的实例描述于例如W02007/085815，在本文也称为D0M10-275-78 和 D0M10-275-78。本发明进一步提供本文所述的用于肺部传递的组合物，其包含结合IL-13的免疫 球蛋白单可变结构域，例如用于治疗哮喘，其具有与图12b (Dom 10-53-474)或图12c (Dom 10-275-78)中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者其与图12b或图12c中公开的 氨基酸序列具有例如80%的同一性，例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或 97% 的同一性。本发明进一步提供本文所述的用于肺部传递的组合物，其包含结合IL-IRl的免 疫球蛋白单可变结构域，例如用于治疗炎性病症，例如肺部炎症或肺病或类风湿性关节炎， 并具有与图12d(Dom 4-130-202)或图12e(Dom 4-130-201)中公开的氨基酸序列相同的 氨基酸序列，或者其与图12d或图12e中公开的氨基酸序列具有例如80%的同一性，例如 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或 97%的同一性。还提供用于肺部传递的本文所述组合物，其包含与Dom4-130-202的氨基酸序列 (示于图12d)至少97%相同的氨基酸序列。还提供本文所述用于肺部传递的组合物，其包含与Dom4-130-202的氨基酸序列 (示于图12e)至少98%相同的氨基酸序列。还提供本文所述用于肺部传递的组合物，例如用于治疗癌症，所述组合物包含结 合VEGF的分子，例如dAb，例如W02007080392和W02007066106中的任何实例。本发明进一步提供本文所述的用于肺部传递的组合物，其包含结合VEGF的免疫 球蛋白单可变结构域，例如用于治疗癌症，其具有与图14中公开的氨基酸序列相同的氨 基酸序列，或者其与图14中公开的氨基酸序列具有例如80%的同一性，例如85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或 97%或 98%、99% 的同一性。还提供本文所述的用于肺部传递的组合物，其包含抗VEGF免疫球蛋白单可变结 构域，该结构域包含的氨基酸序列与D0M15-26-593的氨基酸序列(示于图14a)至少97% 相同。还提供本文所述的用于肺部传递的组合物，其包含抗VEGF免疫球蛋白单可变结 构域，该结构域包含的氨基酸序列与D0M15-26-593的氨基酸序列(示于图14a)至少97% 相同，且其还包含抗体恒定区的结构域。本发明还提供本文所述的用于肺部传递的组合物，其包含抗VEGF免疫球蛋白单 可变结构域，该结构域包含的氨基酸序列选自D0M15-26-593的氨基酸序列(示于图14a) 和D0M15-26-593-Fc融合蛋白的氨基酸序列(DMS1529 ；示于图14i)。本发明的组合物尤其适于直接传递至肺，因此所述组合物可用于治疗、抑制、预防 或诊断肺或呼吸道病症或疾病，例如在传递部位或接近传递部位。然而，所述组合物虽然能够首先传递至肺，但却可以用于治疗机体其它部分的疾 病，例如系统疾病。这是因为组合物首先被传递至肺，随后可能被吸收入系统循环，因此能 够治疗肺病之外的疾病。例如，结合GLP受体的分子可传递至肺，这些分子可用于治疗诸如 糖尿病或肥胖的疾病。这些分子的实例包括在W02006/059106中所述那些分子，以及连接 至albudab的毒蜥外泌肽-4的分子(在本文被描述为毒蜥外泌肽4 (G4Q 3D0M^i-14融合 蛋白(DAT0115))，或任何与datOl 15氨基酸序列具有例如80%同一性(例如85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%或97%、98%或99%同一性)的分子。可以使用本发明的药物、组合物以及制剂和方法治疗、抑制或预防的呼吸道病症 或疾病包括肺部炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、过敏性肺炎、带有嗜酸粒细胞增多的 肺部浸润、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺高血压、肺血 栓栓塞、胸膜疾病、纵隔疾病、横隔膜疾病、肺换气不足、换气过度、睡眠呼吸暂停、急性呼吸 窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主疾病、肺癌、变应性鼻炎、过敏、石绵沉着病、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸性粒细胞性肺炎、特发 性肺纤维化、侵袭性肺炎球菌疾病、流感、非结核性分枝细菌、胸腔积液、肺尘症、肺囊虫病 (pneumocytosis)、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉着症、肺炭疽、肺水肿、肺栓塞、肺部炎症、 肺组织细胞增多病X、肺高血压、肺诺卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞性疾病、类风湿性肺病、肉 样瘤病、Wegener氏肉芽肿病和非小细胞肺癌。因此，本发明提供本文所述的用于肺部传递的组合物，其包含免疫球蛋白单可变 结构域，该结构域结合TNFR1，并具有与图1或图13中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序 列，或者其与图1或图13中公开的氨基酸序列具有例如80%的同一性，例如85%、86%、 87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%^； 97%的同一性。本发明还提供本文所述的用于肺部传递的组合物，其包含抗TNFCI受体1型 (TNFR1 ；p55)免疫球蛋白单可变结构域，该结构域包含与D0Mlh-131-206的氨基酸序列 (示于图1)至少93%相同的氨基酸序列。本发明还提供本文所述的用于肺部传递的组合物，其包含抗TNFa受体1型 (TNFR1 ；p55)免疫球蛋白单可变结构域，该结构域包含与DOMlh-131-511的氨基酸序列 (示于图1)至少95%相同的氨基酸序列。可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构 域，其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域与本文公开的抗TNFRl dAb的氨基酸序列 的差异不超过25个氨基酸位置，并具有与本文公开的抗TNFRl dAb的CDRl序列具有至少 50%同一性的⑶Rl序列。可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域， 其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFRl dAb的氨 基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置，并具有与本文公开的抗TNFRl dAb的CDR2序列 具有至少50%同一性的⑶R2序列。可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构 域，其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFRl dAb 的氨基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置，并具有与本文公开的抗TNFRl dAb的CDR3 序列具有至少50%同一性的⑶R3序列。可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构 域，其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFRl dAb 的氨基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置，并具有分别与本文公开的抗TNFRl dAb的 ⑶Rl或⑶R2序列具有至少50%同一性的⑶Rl序列和⑶R2序列。可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域， 其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFRl dAb的氨 基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置，并具有分别与本文公开的抗TNFRl dAb的CDR2 或⑶R3序列具有至少50%同一性的⑶R2序列和⑶R3序列。可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构 域，其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFRl dAb 的氨基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置，并具有分别与本文公开的抗TNFRl dAb的 ⑶Rl或⑶R3序列具有至少50%同一性的⑶Rl序列和⑶R3序列。
可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域， 其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列与本文公开的抗TNFRl dAb的氨 基酸序列的差异不超过25个氨基酸位置，并具有分别与本文公开的抗TNFRl dAb的CDR1、 ⑶R2或⑶R3序列具有至少50%同一性的⑶Rl序列、⑶R2序列和⑶R3序列。可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域， 其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域具有与本文公开的抗TNFRl dAb的CDRl序列 具有至少50%同一性的⑶Rl序列。可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构 域，其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域具有与本文公开的抗TNFRl dAb的CDR2序 列具有至少50%同一性的⑶R2序列。可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构 域，其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域具有与本文公开的抗TNFRl dAb的CDR3序 列具有至少50%同一性的⑶R3序列。可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域， 其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域具有分别与本文公开的抗TNFRl dAb的CDRl 和⑶R2序列具有至少50%同一性的⑶Rl和⑶R2序列。可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域， 其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域具有分别与本文公开的抗TNFRl dAb的CDR2 和⑶R3序列具有至少50%同一性的⑶R2和⑶R3序列。可用于本发明的组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构 域，其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域具有分别与本文公开的抗TNFRl dAb的 CDRl和CDR3序列具有至少50%同一性的CDRl和CDR3序列。可用于本发明组合物的域抗体可以包含结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域， 其中结合TNFRl的免疫球蛋白单可变结构域具有分别与本文公开的抗TNFRl dAb的CDRl、 CDR2和CDR3序列具有至少50%同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列。可用于本发明肺部传递组合物的多肽、免疫球蛋白单可变结构域和拮抗剂可以抵 抗以下的一种或多种丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、基质 金属蛋白酶、羧肽酶(例如羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋 白酶、弹性蛋白酶、溶菌酶(leukozyme)、胰酶、凝血酶、纤溶酶、组织蛋白酶(例如组织蛋白 酶G)、蛋白酶(例如蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶幻、嗜热菌蛋白酶、凝乳酶、肠肽酶、半胱天 冬酶(例如半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶9、半胱天 冬酶12、半胱天冬酶1 、钙激活中性蛋白酶、无花果蛋白酶、梭菌蛋白酶、奇异果蛋白酶、 菠萝蛋白酶和分离酶。在具体的实施方案中，所述蛋白酶为胰蛋白酶、弹性蛋白酶或溶菌酶 (leucozyme)。所述蛋白酶还可以由生物提取物、生物勻化物或生物制备物提供。在一个实 施方案中，所述蛋白酶为存在于痰、粘液(例如胃粘液、鼻涕、支气管粘液)、支气管肺泡灌 洗液、肺勻化物、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液中的蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋 白酶为在眼睛和/或泪液中存在的蛋白酶。这种存在于眼睛中的蛋白酶的实例包括半胱天 冬蛋白酶、钙激活中性蛋白酶、基质金属蛋白酶、解整合素样金属蛋白酶(ADAM)和具有血 小板反应蛋白基序的ADAM、蛋白体、组织纤溶酶原激活物、分泌酶、组织蛋白酶B和D、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、丝氨酸蛋白酶rassi、遍在蛋白蛋白酶体途径(UPP)。在一个实施方案 中，所述蛋白酶为非细菌蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶为动物(例如哺乳动物， 例如人)蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶为GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶，例如在 人中存在的GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶。本文列出的这样的蛋白酶还可以用于本文所述 方法，包括将文库所有组成部分与蛋白酶接触。—方面，本发明的组合物包含蛋白酶抗性的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述 可变结构域在以下条件下抗蛋白酶与i)至少10yg/ml浓度(c)的蛋白酶于37°C温育 至少1小时的时间⑴时；或者与(ii)至少40yg/ml浓度(c’ )的蛋白酶于30°C温育至 少1小时的时间(t)时。在一个实施方案中，蛋白酶(例如胰蛋白酶)对可变结构域的比 率(mol/mol)为8，000-80，000蛋白酶可变结构域，例如当C为10 μ g/ml时，所述比率为 800-80, 000蛋白酶可变结构域；或者当C或C’为100 μ g/ml时，所述比率为8，000-80, 000 蛋白酶可变结构域。在一个实施方案中，蛋白酶(例如胰蛋白酶)对可变结构域的比率 (基于重量/重量，例如yg/yg)为16，000-160，000蛋白酶可变结构域，例如当C为 10 μ g/ml时，所述比率为1，600-160，000蛋白酶可变结构域；或者当C或C’为IOOyg/ ml时，所述比率为1，6000-160，000蛋白酶可变结构域。在一个实施方案中，所述浓度(c 或c’)为至少100或1000 μ g/ml蛋白酶。在一个实施方案中，所述浓度(c或c’)为至少 100或1000 μ g/ml蛋白酶。参考本文关于在用肽或多肽的库或文库工作时适于所用蛋白 质水解活性的条件的描述(例如重量/重量参数)。这些条件可用于确定某种具体的免疫 球蛋白单可变结构域的蛋白酶抗性的条件。在一个实施方案中，时间(t)为或约为1、3或 M小时或过夜(例如约12-16小时)。在一个实施方案中，可变结构域在条件(i)下是抗 性的，且浓度(c)为或约为10或100 μ g/ml蛋白酶，时间⑴为1小时。在一个实施方案 中，可变结构域在条件(ii)下是抗性的，且浓度(c’)为或约为40 μ g/ml蛋白酶，时间⑴ 为或约为3小时。在一个实施方案中，所述蛋白酶选自胰蛋白酶、弹性蛋白酶、溶菌酶和胰 酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶为胰蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶为在痰、 粘液(例如胃粘液、鼻涕、支气管粘液)、支气管肺泡灌洗液、肺勻化物、肺提取物、胰腺提取 物、胃液、唾液或泪液或眼睛中存在的蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶为在眼睛和/ 或泪液中存在的蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶为非细菌蛋白酶。在一个实施方 案中，所述蛋白酶为动物(例如哺乳动物，例如人)蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋白 酶为GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶，例如在人中存在的GI道蛋白酶或肺组织蛋白酶。本文 列出的这些蛋白酶还可以用于本文所述的方法，包括将文库所有组成部分与蛋白酶接触。在一个实施方案中，可变结构域抗胰蛋白酶和/或至少一种选自以下的其它蛋白 酶弹性蛋白酶、溶菌酶和胰酶。例如，抗性针对胰蛋白酶和弹性蛋白酶；胰蛋白酶和溶菌 酶；胰蛋白酶和胰酶(pacreatin)；胰蛋白酶、弹性蛋白酶和溶菌酶；胰蛋白酶、弹性蛋白酶 和胰酶；胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰酶和溶菌酶；或者胰蛋白酶、胰酶和溶菌酶。在一个实施方案中，可变结构域在条件(i)或(ii)下温育时展示在噬菌体上，例 如以106-1013(例如IO8-IO12)复制单位(感染性病毒体)的噬菌体文库大小。在一个实施方案中，可变结构域在于条件(i)或(ii)下温育后特异性结合其靶， 例如使用BiaCore TM或ELISA进行评价，例如噬菌体ELISA或单克隆噬菌体ELISA。在一个实施方案中，本发明的可变结构域特异性结合A蛋白或L蛋白。在一个实施方案中，在条件(i)或(ii)下温育后存在对A或L蛋白的特异性结合。在一个实施方案中，本发明的可变结构域例如在条件(i)或(ii)下温育后，在 ELISA (例如噬菌体ELISA或单克隆噬菌体ELISA)中可具有至少0. 404的OD45tl读数。在一个实施方案中，本发明的可变结构域在凝胶电泳中展示(基本上)单一条带， 例如在条件⑴或(ii)下温育后。本文所述的组合物包含(a)多肽，例如域抗体(dAb)，和(b)生理学上可接受的缓 冲液，例如具有约4至约8的pH范围，并且其粘度约等于约2%至约10% PEG 1000在含 1. 2% (重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度的缓冲液；其中所述组合 物包含液滴，在所述组合物中存在的液滴中，约40%或以上(例如50%或以上)的液滴小 于约6微米，例如约1微米至约6微米的范围，例如小于约5微米，例如约1微米(或约2 微米)至约5微米。对于深肺传递，有益的粒径可为约1微米至约3微米。可按照本发明使用的适宜的缓冲液为生理学上可接受的缓冲液，例如可安全给予 到肺的缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐或组氨酸缓冲液。pH范围在一个实施方案中，所述缓冲液的pH优选在约4至约8的范围内，例如 约7至约7. 5，或者约5至约6。在某些实施方案中，缓冲液的粘度优选约等于约2%至约10% PEG 1000在含 1.2% (重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。粘度可以使用本领域已 知的标准技术检测，例如锥板法或磁珠微流变仪法。组合物中存在的液滴的大小可以使用用于检测粒径的标准方法检测，例如使用 Malvern激光扫描装置或者例如使用多级冲击采样器，例如Dekatie冲击采样器装置或 Malple冲击采样器装置。可将例如添加剂加入至缓冲液，以改变粘度，有用的添加剂可为例如聚乙二醇 (PEG)，例如PEG 1000，或糖，例如蔗糖、甘露糖，其它添加剂可以包含例如稳定剂，例如洗涤 剂，例如吐温。用于如本文所述的直接肺部传递的制剂的多肽，例如dAb，可以有用地为例如抗 TNFRl结合剂，例如结合抗TNFRl的dAb，例如，其可以为显著拮抗性的抗TNFRl dAb，例如WO 2007/049017(其内容和讲述具体地通过引用结合到本文中)中公开的拮抗性抗TNFRldAb， 例如其可以具有如在WO 2007/049017的SEQ ID 1_650的任一个中描述的编码序列，所有 这些序列都具体地通过引用结合到本文中。这样的抗TNFRl dAb组合物可以为治疗呼吸道 疾病例如COPD和哮喘的有效治疗剂。对组合物的多肽例如dAb还可能有利的是具有高解链温度(Tm)。例如已经表明， 具有较高解链温度(Tm)的dAb更加抗剪切力、升高的温度和长期储存稳定性诱导的聚集。 剪切力和热应力在雾化过程中对诱导聚集形成起显著作用，所以选择具有高Tm的dAb是有 利的。实现此目标的一种方法应是产生dAb的噬菌体展示文库，并使用蛋白酶(例如胰蛋 白酶)选择和鉴定抗所述酶的作用的分子。通过该方法产生的蛋白酶抗性dAb具有较高的 解链温度，这已经归因于增加蛋白的核心稳定性的dAb序列的改变，使得所述分子的肽骨 架不大容易被所述酶水解。蛋白酶抗性域抗体和选择它们的方法例如进一步描述于USSN60/933，632(其教 导通过引用结合到本文中)。
dAb的Tm的升高还可以例如通过在选择过程中加热dAb实现。因此，当本发明的 组合物包含域抗体时，dAb具有约例如55°C至约例如90°C (例如约80°C至约例如90°C )的 Tm可能是理想的。Tm可以使用标准技术例如差异扫描量热法(DFC)来确定。可用于本文所述组合物的多肽浓度(例如dAb)可以在约lmg/ml直至约40mg/ml 的范围内。例如dAb的较高浓度，例如约20mg/ml至约40mg/ml，对于改善向肺的传递可能 是有益的。在以下的实施例中，仅通过举例来进一步描述本发明 实施例以下详述了针对人TNFRl的域抗体的前导分子的选择和表征产生的域抗体来源于Domantis的噬菌体文库。对被动吸附的人TNFRl的可溶性 选择和淘选按照相关的标准Domantis方法进行。人TNFRl作为可溶性重组蛋白由R&D系 统(目录号636-R1-025/CF)或P印rotech(目录号310-07)购买，或者直接使用(在被动 选择的情况下)，或者在使用经伯胺的偶联生物素化之后，继之以生物测定质控其活性，并 通过质谱分析其分子量和生物素化程度。通常，利用降低之后每一轮的抗原水平进行3轮 选择。通过噬菌体ELISA筛选关于抗TNFRl结合克隆的存在情况的选择输出。DNA分离 自这些噬菌体选择，并亚克隆入表达载体，用于表达可溶性dAb片段。可溶性dAb片段在96 孔板中表达，使用采用抗c-myc检测的直接结合ELISA，或者使用链霉抗生物素蛋白/生物 素化TNFRl BIAcore 芯片的BIAcore ，使用上清液筛选抗TNFRl结合dAb的存在情况，并 按照解离速率排列。下述的前导分子来源于亲代dAb，称为DOMlh-131。该分子在使用60nM生物素化 抗原进行3轮选择后选自噬菌体展示文库。链霉抗生物素蛋白或中性链亲和素包被的Dyna 珠交替作为每轮选择的捕获试剂，以防止选择针对链霉抗生物素蛋白或中性链亲和素的结 合剂。据MRC-5成纤维细胞/IL-8释放细胞测定检测，前导分子DOMlh-131在该阶段的效 力在低ymol范围内。依据BIAcore 测定的结合动力学通常展示出快速结合/快速解离 速率。作为C-末端myc标记的单体的该DOMlh-131前导分子的大肠杆菌(E. coli)表达水 平在8mg/l的区域内。前导分子的亲和成熟将DOMlh-131进行进一步的亲和成熟，以产生具有较高效力和改善的生物物理特 征的突变体(参见图1的DOMlh-131衍生的前导分子的氨基酸序列)。在使用错配PCR 聚合酶(Genemorph II，Stratagene)产生错配文库(每个dAb序列的氨基酸改变数平均 为1，文库大小为8X107)后，利用这些错配文库进行7轮选择。该策略使得分离出克隆 D0Mlh-131-8，依据MRC-5测定检测，该分子中的4个氨基酸改变(1个在构架1 (FRl)中，1 个在⑶Rl中，1个在⑶R3中，1个在FR4中)产生了约100倍的效力改善(约^M)。为了进一步改善效力，单个氨基酸位置通过寡聚物引导的诱变在由错配前导分 子共有信息提示的关键位置多样化。在该过程中，通过BIAcore 筛选分离改进形式的 D0Mlh-131-8克隆D0Mlh-131-24(在修正之前最初命名为D0Mlh_131-8_2)，其具有单个 K94R氨基酸突变(按照Kabat进行氨基酸编码)和200_300ρΜ的RBA效力。
基于该前导分子和由其获得的NNS文库产生进一步的错配文库，并使用热处理对 其进行3轮噬菌体选择(关于方法参见Jespers L等人，Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation. Nat Biotechnol. 2004 年 9 月；22(9) :1161-5)。在该选择过程中，合并文库，来源于第二轮选择的克隆产生dAb，例 如D0Mlh-131-53，其热稳定性更好。推测这些克隆应具有更好的生物物理特征。将克隆 D0Mlh-131-53中的某些构架突变种系化，获得克隆D0Mlh-131-83。以该克隆为基础使用 如上所述的噬菌体展示选择或使用采用乳浊液的体外区室化技术，经由寡聚物引导的单个 ⑶R诱变进一步多样化。噬菌体展示策略产生前导分子DOMlh-131-117和DOMlh-131-151。 体外区室化技术产生DOMlh-131-511。在该阶段，以生物物理测定和生物学测定比较这3个前导分子，DOMlh-131-511为 具有最佳特性的分子。此外，在胰蛋白酶或溶菌酶存在下，测试这些分子对蛋白酶剪切的抗 性。溶菌酶(leucozyme)由囊性纤维化患者的合并痰液组成，其含有高水平的弹性蛋白酶 和其它蛋白酶，用其代表肺病的体内状况。该数据表明，所有3种前导分子DOMlh-131-117、 DOMlh-131-151和DOMlh-131-511在胰蛋白酶或溶菌酶存在下都快速降解。该发现使人们 对DOMlh-131-511在患者体内持续存在更为担心，并开发了选择提高对胰蛋白酶抗性的策 略。推测这样改善的胰蛋白酶抗性，对所述分子的其它生物物理特性可能具有有益作用。 从根本上修改标准噬菌体的选择方法，以允许在抗原选择之前在蛋白酶存在下选择。为此 工程改造新的噬菌体载体，其中缺失c-myc标签，以允许在胰蛋白酶存在下选择，而不切割 离开噬菌体的展示的dAb。产生基于DOMlh-131-511的错配文库，并克隆入新的pD0M33载 体中。由该文库产生的噬菌体母液用胰蛋白酶预处理，随后加入蛋白酶抑制剂，以封闭胰 蛋白酶活性，然后在相关抗原上选择。进行4轮选择。使用BIAcore 评价可溶性表达的 TNFRl结合dAb对TNFRl的结合能力(在有或没有蛋白酶存在下)。这使得分离出两种前 导分子D0Mlh-131-202和D0Mlh-131-206，由BIAcore 抗原结合实验证实，它们的蛋白酶抗 性提高。值得指出的是，D0Mlh-131-202相比于DOMlh-131-511在CDR2中仅包含1个突变 (V53D，所有的氨基酸编码都依据Kabat)，而D0Mlh-131_206仅包含两个突变第一个突变 与D0Mlh-131-202相同(在CDR2中的V53D突变)，第二个突变为FR3中的Y91H突变(参 见图1)。FR3中的该Y91H突变确实出现在3-20人种系基因中，表明该残基存在于人抗体 中。3个克隆DOMlh-131-511、D0Mlh-131-202和D0Mlh-131-206具有如图1所示的氨基酸 序列。如下测定所述分子的活性D0M1H-131-202、D0M1H-131-511 和 D0M1H-131-206 结合人 TNFRl 的 BIAcore 结 合亲和性评价。通过BIAcore 分析评价 D0M1H-131-202、D0M1H-131-511 和 D0M1H-131-206 结 合人重组大肠杆菌表达的人TNFRl的结合亲和力。使用生物素化人TNFRl进行分析。将 1400RU的生物素化TNFRl包被至链霉抗生物素蛋白(SA)芯片。使用温和的酸洗脱条件将 表面再生回基线。使用50μ 1/分钟的流速于限定的浓度使D0M1H-131-202、D0M1H-131-511 和D0M1H-131-206通过该表面。在BIAcore 3000机器上进行工作，并分析数据，将数据拟 合为结合的1 1模型。对于所有测试分子结合数据都良好地拟合为1 1模型。所有的 Kd值都由k。n和k。ff速率计算。于25°C实施BIAcore 运行。
以下的数据由3个独立实验产生。在每个实验中，结果都使用kd的最高dAb浓度 和较低的ka浓度通过平均众多拟合来计算。数据以结果的平均值和标准偏差(在括号中) 提供(表1)。表1 :D0M1H-131-202、D0M1H-131-511 和 D0M1H-131-206
结合人 TNFRl 的 BIAcore 数据
权利要求
1.一种包含以下物质或由以下物质组成的组合物(a)多肽和(b)生理学上可接受的 缓冲液，其中所述组合物包含液滴，并且所述组合物中存在的液滴中，约40%或以上的液滴 小于约6微米。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物中存在的液滴中，约40%或以上液滴的大小 为约1微米至约6微米。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述组合物中存在的液滴中，约40%或以上的液滴 小于约5微米。
4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述多肽包含多肽结构域或由多肽结构域组 成，所述多肽结构域例如为单体。
5.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述多肽包含免疫球蛋白分子或由免疫球蛋 白分子组成。
6.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述多肽包含至多150个氨基酸或由至多 150个氨基酸组成。
7.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述多肽包含域抗体(dAb)或由域抗体 (dAb)组成。
8.权利要求1-4中任一项或权利要求6的组合物，其中所述多肽包含非Ig骨架或由非 Ig骨架组成，所述非Ig骨架例如为亲和体。
9.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述多肽例如域抗体具有约55°C至约90°C 的解链温度(TM)。
10.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲液具有约4至约8的PH范围。
11.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲液的粘度约等于约2%至约10% PEG 1000在含1. 2% (重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。
12.一种包含以下物质或由以下物质组成的组合物(a)多肽和(b)生理学上可接受的 缓冲液，其中所述缓冲液具有约4至约8的pH范围，并且其粘度约等于约2%至约10% PEG 1000在含1. 2% (重量/体积)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。
13.权利要求12的组合物，其中所述多肽包含多肽结构域或由多肽结构域组成，例如 其中所述多肽结构域作为单体存在。
14.权利要求12或13的组合物，其中所述多肽包含免疫球蛋白分子或由免疫球蛋白分 子组成。
15.权利要求12-14中任一项的组合物，其中所述多肽包含至多150个氨基酸或由至多 150个氨基酸组成。
16.权利要求12-15中任一项的组合物，其中所述多肽包含域抗体(dAb)或由域抗体 (dAb)组成。
17.权利要求12-13或15的组合物，其中所述多肽包含非Ig的骨架或由非Ig骨架组 成，所述非Ig骨架例如为亲和体。
18.权利要求12-17中任一项的组合物，其中所述多肽具有约55°C至约90°C的解链温 度( )。
19.权利要求12-18中任一项的组合物，其中在所述组合物中存在的液滴中，约40%或 以上的液滴小于约6微米。
20.权利要求19的组合物，其中在所述组合物中存在的液滴中，约40%或以上的液滴 大小为约1微米至约6微米。
21.权利要求19或20的组合物，其中在所述组合物中存在的液滴中，约40%或以上的 液滴小于约5微米。
22.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲 液、柠檬酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液，并任选地进一步包含(a)增加粘度的添加剂和/或 (b)稳定剂。
23.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述多肽例如dAb可以结合靶分子，例如在 肺组织中存在的靶分子。
24.权利要求23的组合物，其中所述靶分子选自TNF受体、TNFRUIL-U IL-1R、 IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、 IL-13Rα 1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、 IL-25、CD2、CD4、CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、 FcERU TGFb, CCL2、CCL18、CEA, CR8、CTGF, CXCL12 (SDF-I)、凝乳酶、TOF、弗林蛋白酶、内皮 素-1、嗜酸性粒细胞趋化因子(例如嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子_2、 嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、GM-CSF、ICAM-U I COS, IgE、IFNa、1_309、整联蛋白、L-选择 素、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMPs、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、骨桥蛋白、0X-40、PARC、PD-I、 RANTES, SCF、SDF-I、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-UTNF, TNFR1、TRANCE、类胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α 4 β 7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、 ανβ6、ανβ8、οΜΕΤ 禾口 CD8。
25.权利要求M的组合物，其中所述多肽为抗TNF受体结构域抗体(dAb)。
26.权利要求25的组合物，其中所述抗TNF受体dAb选自Domlh-131、Domlh_131_8、 Dom lh-131-24、Dom lh-131-53、Domlh-131-70、Dom lh-131-83、Dom lh-131-117、 Dom lh-131-151、Dom lh-131-511、Dom lh_131_202、Dom lh_131_206、Domlh-131-201、 lh-131-203、lh-131-204 和 lh_131_205。
27.权利要求沈的组合物，其中所述抗-TNF受体dAb包含与D0Mlh-131-206的氨基酸 序列(示于图1)至少93%相同的氨基酸序列。
28.权利要求沈的组合物，其中所述抗-TNF受体dAb包含与DOMlh-131-511的氨基酸 序列(示于图1)至少95%相同的氨基酸序列。
29.权利要求M的组合物，其中所述dAb结合IL-13，并包含例如与图12b(Dom 10-53-474)或图12c (Dom 10-275-78)中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者其包 含与在图12b或图12c中公开的氨基酸序列具有例如80%同一性的序列，例如85^^86%、 87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%^； 97%的同一性。
30.权利要求M的组合物，其中所述dAb结合IL-1R1，并包含例如与在图12d(Dom 4-130-202)或图12e(Dom 4-130-201)中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者其包 含与在图12d或图12e中公开的氨基酸序列具有例如80%同一性的序列，例如85^^86%、 87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%^； 97%的同一性。
31.权利要求30的组合物，其中所述dAb包含与Dom4-130-202的氨基酸序列(示于 图12d)至少97%相同的氨基酸序列。
32.权利要求30的组合物，其中所述dAb包含与Dom4-130-202的氨基酸序列(示于 图12e)至少98%相同的氨基酸。
33.权利要求M的组合物，其中所述dAb结合VEGF，并包含例如与图14中公开的氨基 酸序列相同的氨基酸序列，或者其包含与图14中公开的氨基酸序列具有例如80%同一性 的序列，例如 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%的同一性。
34.权利要求33的组合物，其中所述dAb包含与D0M15-26-593的氨基酸序列(示于图 14a)至少97%相同的氨基酸序列。
35.权利要求33的组合物，其中所述dAb包含与D0M15-26-593的氨基酸序列(示于图 14a)至少97%相同的氨基酸，且所述dAb还包含抗体恒定区的结构域。
36.权利要求M的组合物，其中所述dAb结合IL-13，且包含例如与图12b(Dom 10-53-474)或图12c(Dom 10-275-78)中公开的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者所述 dAb包含与图12b或图12c中公开的氨基酸序列具有例如80%同一性的序列，例如85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或 97% 的同一性。
37.权利要求23的组合物，其中所述多肽例如dAb可以结合系统靶分子，例如选自以下 的系统靶分子人或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体、用于酶的酶辅因子或DNA结合蛋 白，例如ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌营养素_1、EGF、EGF受体、ENA-78、嗜酸性粒细胞趋化因 子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、EX0dus-2、Ep0R、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞 生长因子、成纤维细胞生长因子 _10、FLT3 配体、Fractalkine (CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、 GF-β 1、胰岛素、IFN-Y、IGF-I, IGF-I I, IL-I α、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8 (72 个氨基酸)、IL-8 (77 个氨基酸)、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13, IL-15、 IL-16、IL-17、IL-18 (IGIF)、抑制素 α、抑制素 β、ΙΡ-10、角化细胞生长因子-2 (KGF-2)、 KGF、苗条蛋白、LIF、淋巴细胞趋化因子、苗勒氏管抑制物、单核细胞集落抑制因子、单核细 胞引诱蛋白、M-CSF、MDC (67 个氨基酸)、MDC (69 个氨基酸)、MCP-I (MCAF)、MCP-2、MCP-3、 MCP-4、MDC (67 个氨基酸)、MDC (69 个氨基酸)、MIG、MIP-I α、MIP-I β、ΜΙΡ-3 α、ΜΙΡ-3 β、 ΜΙΡ-4、髓样祖细胞抑制因子-1 (MPIF-I)、ΝΑΡ-2、Neurturin、神经生长因子、β -NGF, ΝΤ-3、 ΝΤ-4、制癌蛋白 M、PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4、RANTES, SDFl α、SDFl β、SCF、SCGF、 干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β 2、TGF-β 3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、 TNF-β、TNF 受体 I、TNF 受体 II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF 受体 1、VEGF 受体 2、VEGF 受体 3、GCP-2、GR0/MGSA、GR0-3、GR0-γ、HCC1、1-309、HER UHER 2, HER 3 和 HER 4、毒蜥外泌 肽和GLP-I。
38.权利要求13的组合物，其中所述dAb可以结合人白蛋白，且其连接至毒蜥外泌肽或 GLP分子。
39.权利要求13的组合物，其中多肽分子包含毒蜥外泌肽4(G4Q3D0M^i-14融合蛋白 (DAT0115)或与dat0115氨基酸序列具有例如80%同一性的任何分子，例如85%,90%, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的同一性。
40.前述权利要求中任一项的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂 或赋形剂。
41.前述权利要求中任一项的组合物，所述组合物用于药物。
42.权利要求1-40中任一项的组合物，所述组合物用于将多肽例如dAb传递至肺，或者 例如用于多肽的系统性传递。
43.权利要求1-40中任一项的组合物，所述组合物用于肺或呼吸道病症或疾病的治 疗、预防或诊断。
44.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述dAb是格式化dAb，例如其为dAb-Fc融合蛋白ο
45.权利要求1-40中任一项的组合物在制备用于治疗、预防或诊断肺或呼吸道病症或 疾病的药物中的用途。
46.权利要求12的组合物在制备用于治疗、预防或诊断深肺病症或疾病的药物中的用途。
47.权利要求12的组合物用于传递多肽至深肺组织的用途。
48.一种将所需分子传递给患者的方法，所述方法包括将权利要求1-40中任一项的组 合物直接给予到患者的肺。
49.一种治疗、预防或诊断肺病或呼吸道疾病的方法，所述方法包括将权利要求1-40 中任一项的组合物直接给予到患者的肺组织。
50.权利要求35或36的方法，其中所述组合物以日剂量约5mg/Kg体重至约0.005mg/ Kg体重给予受治疗者。
51.权利要求48-50中任一项的方法，其中所述组合物使用喷雾器、吸入器或鼻内装置 给予患者。
52.一种喷雾器、吸入器或鼻内装置，所述喷雾器、吸入器或鼻内装置装有权利要求 1-40中任一项的组合物。
53.权利要求39的喷雾器、吸入器或鼻内装置用于将权利要求1-40的组合物传递至患 者的肺组织的用途。
54.一种生产药物组合物的方法，所述药物组合物用于例如治疗、预防或诊断肺病症或 疾病，所述方法包括混合(a)权利要求1-40中任一项的组合物和(b)药学上可接受的载 体、稀释剂或赋形剂。
55.一种生产多肽组合物的方法，所述多肽组合物用于例如治疗、预防或诊断肺病症或 疾病，所述方法包括混合(a)多肽和(b)生理学上可接受的缓冲液，所述缓冲液具有约4至 约8的pH范围，并且其粘度约等于约2%至约10% PEG 1000在含1.2% (重量/体积)蔗 糖的50mM磷酸缓冲液中的溶液的粘度。
56.权利要求55的方法，其中所述多肽包含域抗体(dAb)或由域抗体(dAb)组成。
57.一种生产权利要求1-40的组合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)混合多肽和 生理学上可接受的缓冲液，然后(b)，使步骤(a)的多肽和缓冲液组合物通过喷雾器、吸入 器或鼻内传递装置。
58.权利要求57的方法，其中所述生理学上可接受的缓冲液具有约4至约8的pH范 围，并且其粘度约等于约2%至约10% PEG 1000在含1.2% (重量/体积)蔗糖的50mM磷 酸缓冲液中的溶液的粘度。
59.一种生理学上可接受的缓冲液的用途，所述缓冲液用于制备多肽组合物，例如肺部 传递的多肽组合物，所述缓冲液具有约4至约8的pH范围，并且其粘度约等于约2%至约10% PEG 1000在含1. 2% (重量/体积)蔗糖的50mM磷酸缓冲液中的溶液的粘度。
60.权利要求47的用途，其中所述多肽组合物包含域抗体(dAb)或由域抗体(dAb)组成。
全文摘要
本发明涉及直接肺部传递多肽(例如域抗体)的方法，并涉及适于直接肺部传递的特定多肽组合物。本发明还涉及这样的组合物在药物中的用途，所述药物例如用于治疗和诊断肺病，例如用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
文档编号C07K16/28GK102131827SQ200880127160
公开日2011年7月20日 申请日期2008年12月11日 优先权日2007年12月13日
发明者A·巴斯兰, C·A·斯帕克斯, N·D·布鲁伊斯 申请人:葛兰素集团有限公司