胶原肽,二肽及疾病抑制剂的制作方法

专利名称：胶原肽,二肽及疾病抑制剂的制作方法
胶原肽，二肽及疾病抑制剂
技术领域：
本发明涉及胶原肽，二肽及疾病抑制剂。详细是涉及含有有特定的结构的二肽作为必须的二肽的胶原肽，有新颖的结构的二肽，以上述二肽作为必须的有效成分的，对于骨质疏松症，变形性关节炎，褥疮等的抑制(在本发明，而所说的用语“抑制”含作为抑制症状的发症的”预防”的意味，抑制发症的症状的“治疗”作为的意味的双方。)有效的疾病抑制剂。
背景技术：
骨质疏松症是指虽然发生骨的绝对量的减少，但不伴随骨的质的变化的状态。骨不断被吸收，形成，且吸收率与形成率产生差，且骨形成成为负的平衡，则发生骨质疏松。骨的吸收由破骨细胞进行，且破骨细胞的分化及活化越是显著，骨的吸收率越变高。另一方面，骨的形成由成骨细胞进行，且成骨细胞的分化及活化越是显著，骨的形成率越变高。变形性关节炎是关节同时发生慢性的退行性变化及增殖性变化，且关节的形态变化的疾病。关节软骨渐渐磨耗或缺损，且骨露出。关节软骨不存在血管系统，且特别是，关节摺动部软骨细胞及肋软骨组织的修复·再生与存在血管的骨组织相比困难。特别是，支持关节软骨的骨组织变疏(骨质疏松症)，则导致关节部的功能障碍，且作为结果，而变形性关节炎(Osteoarthritis)发症。褥疮是指，长时间卧床时，骨的突出的部位的皮肤及软部组织，由于骨与病床之间长时间的压迫，引起循环障碍，且成坏死的状态。作为对于如上所述的症状的肽的效能而言，对于变形性关节炎的效能被报告，且例如，已知作为有效成分含胶原肽，葡萄糖胺盐，且pH2 5的关节强化饮料(专利文献1 参照)，由用胶原酶分解胶原成分或明胶成分被得到，以氨基酸序列Gly-X-Y的三肽作为有效成分的慢性类风湿性关节炎或变形关节症的改善剂(专利文献2参照)，以含有从胶原及胶原肽可选的至少1种，从氨基糖，粘多糖类及糖醛酸可选的至少1种作为特征的经口关节障碍治疗剂或功能性食品(专利文献3参照)等。专利文献1特开2002-125638号公报专利文献2特开2002-255847号公报专利文献3特开2003-48850号公报

发明内容发明要解决的技术课题但是，上述以往的技术仅示对于变形性关节炎的预防至治疗，胶原或，是各种各样的肽分子的混合物的胶原肽，或特定的三肽有效，且对于预防至治疗不仅是变形性关节炎， 且也含骨质疏松症，褥疮等的广的意味的疾病有效的肽结构至今未知。从而，作为本发明要解决的课题在于，变以往的着眼点，找出对于骨质疏松症，变形性关节症，褥疮等的各种疾病的抑制有效的肽分子的本体，尤其是，向肠管的体内的吸收容易而新颖的二肽，且提供含有上述二肽作为必须的有效成分的疾病抑制剂及含有上述二肽作为必须的二肽的胶原肽。解决课题的技术方案本发明人为了解决上述课题而进行锐意研究。其结果，本发明人发现新颖发现的有Hyp-Gly的结构的二肽，在肠管的体内吸收容易，并且，作为疾病抑制剂的有效成分起作用，具体而言，例如，抑制破骨细胞的分化与活化，且亢进成骨细胞的分化与活化，且抑制软骨细胞的变性而调节其分化，且发现对于骨质疏松症，变形性关节症的抑制有效的同时，发现此二肽使皮肤真皮中的原胶原量恢复，也抑制褥疮，且确认这些事实，而完成本发明。S卩，本发明涉及的胶原肽以包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的二肽作为特征。本发明涉及的二肽以有Hyp-Gly的结构作为特征。本发明涉及的疾病抑制剂以包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的有效成分作为特征。发明效果由本发明可有效抑制骨质疏松症，变形性关节症，褥疮等的症状。实施方式以下，虽然对于本发明涉及的胶原肽，二肽及疾病抑制剂详细说明，但本发明的范围不被这些说明约束，而对于以下的例示以外，在不损害本发明的趣旨的范围内可适宜实
施变更。〔二肽，胶原肽〕本发明涉及的二肽有Hyp-Gly的结构。本发明涉及的胶原肽含有上述二肽作为必须的二肽。例如，可如后述由酶处理胶原或明胶得到。有Hyp-Gly的结构的二肽，羟基脯氨酸单位及/或甘氨酸单位被化学修饰也可，而对于羟基脯氨酸单位而言，羟基被化学修饰也可。以上，在本发明而言，“有Hyp-Gly的结构的二肽”是指含化学修饰的，也含未化学修饰的。另外，以下中，有将“有Hyp-Gly的结构的二肽”单表示为“Hyp-Gly”时(对于其他肽也同样)。Hyp-Gly被化学修饰时，可在从弱酸性到中性溶解，且也可期待与后述的其他有效成分的相溶性升高等。具体而言，对于羟基脯氨酸残基的羟基而言，可举0-乙酰化等的化学修饰，对于甘氨酸残基的α-羧基而言，可举酯化，酰胺化等的化学修饰。对应于后述的其他有效成分的种类等，而选择适宜的化学修饰即可。上述Hyp-Gly，例如，如后述，可由将胶原或明胶分成2阶段酶处理，或从氨基酸合成得到，且对于化学修饰而言，可举如后述的公知的手段。但是，本发明涉及的二肽也可通过这些方法以外的方法得到，而例如，代替下述2阶段酶处理法，而省略1次酶处理的方法或，同时进行1次酶处理及2次酶处理的方法也可。<胶原或明胶的2阶段酶处理>将胶原或明胶通过一般的方法1次酶处理之后，作为2次酶处理，由使用有羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶反应的2阶段酶处理，而可得含Hyp-Gly的胶原肽。
由此2阶段酶处理，则由1次酶处理，而有用于介经口免疫宽容机制的骨 软骨组织的炎症缓和的分子量比较大的肽生成，且由2次酶处理，而例如，是有x-Hyp-Gly的结构的肽(χ表示脯氨酸以外的氨基酸残基。)，则Hyp-Gly残基与χ残基间的肽结合(Hyp的氨基与χ的羧基源于的肽结合)被切断而Hyp-Gly生成。作为上述胶原而言，虽然当然不是特别限定，但可举例如，牛或猪等的哺乳动物来源的胶原或鲨或鲷等的鱼类来源的胶原，且这些从上述哺乳动物的骨，皮部分或上述鱼类的骨，皮，鳞部分等可得。具体而言，对上述骨，皮，鳞等实施脱脂 脱灰处理，提取处理等的以往公知的处理即可。上述明胶由将上述胶原通过热水提取等的以往公知的方法处理可得。作为上述胶原或明胶的2阶段酶处理中用的酶而言，虽然不特别限定，但考虑将得到的二肽在特定保健用食品中利用的情况等，则优选用病原性微生物来源的酶以外的酶。作为1次酶处理的处理条件而言，例如，可对于胶原或明胶100重量份用酶0. 1 5重量份，且于30 65°C处理1 72小时。由上述胶原或明胶的1次酶处理得到的胶原肽的平均分子量优选为200 2000， 更优选为200 1800。平均分子量在上述范围，则可认为充分生成分子量比较大的肽。1次酶处理后，应必要使酶失活也好，作为这时的失活温度而言，例如，是70 100°C。作为用于上述1次酶处理的酶而言，是可切断胶原或明胶的肽结合的酶，则不特别限定，而通常，可用被称为蛋白分解酶或蛋白酶的酶。具体而言，可举例如，胶原酶，巯基蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，酸性蛋白酶，碱性蛋白酶，金属蛋白酶等，且可将这些单独地，或多个组合使用。作为上述巯基蛋白酶而言，已知植物来源的木瓜凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，无花果蛋白酶，动物来源的组织蛋白酶，钙依赖性蛋白酶等。另外，作为上述丝氨酸蛋白酶而言，已知胰蛋白酶，组织蛋白酶D等，作为上述酸性蛋白酶而言，已知胃蛋白酶， 胰凝乳蛋白酶等。而且，2次酶处理中，例如，作为酶，而用曲霉属来源的有羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性及氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶的酶反应进行。由此反应，1次酶处理物中未被含的 Hyp-Gly 生成。作为2次酶处理的处理条件而言，例如，可对于1次酶处理物100重量份用酶 0. 01 5重量份，且于30 65°C处理1 72小时。由上述2次酶处理得到的胶原肽的平均分子量优选为200 1500，更优选为 200 900。此2次酶处理以Hyp-Gly的生成作为主要目的，且优选由1次酶处理得到的胶原肽中，比较大的肽不被过量水解完地，成上述平均分子量的范围地进行2次酶处理。2次酶处理后有必要使酶失活，而作为失活温度而言，是例如，70 100°C。由于由上述2阶段酶处理得到的水解物，或由上述2阶段酶处理及发酵得到的发酵生成物是也含Hyp-Gly以外的氨基酸或肽成分的混合物，所以得Hyp-Gly或者其盐时，则应必要，也可使如进行分级分离、纯化。作为分级分离 纯化的方法而言，不特别限制，而使例如，超滤或，凝胶过滤层析，离子交换层析，逆相层析，亲和层析等的各种液相层析或，使这些组合的方法等的以往公知的方法即可。具体而言，例如，可如以下分级分离 纯化。艮口，首先，将上述水解物或发酵生产物的约2g/10mL分成2次负荷到离子交换柱(例如，DEAE T0Y0PEARL 650M柱(东^ 一社制)或SP T0Y0PEARL 650M柱(东^ 一社制)等)，而回收被用蒸留水洗脱的空体积级分。接下来，将回收的级分负荷于有与上述离子交换柱相反的离子交换基的柱(例如，SP T0Y0PEARL 650M柱(东乂一社制)或DEAE T0Y0PEARL 650M 柱(东〃一社制)等)，而回收被用蒸留水洗脱的空体积级分。接下来，将此级分负荷于凝胶过滤柱(例如，SEPHADEX LH-20柱(Pharmacia社制)等)，且用30%甲醇水溶液洗脱与是化学合成品的Hyp-Gly洗脱的位置相当的级分回收。对于本级分而言，供于装填逆相柱 (例如，μ Bondasphere 5 μ C18 300Α柱(Waters社制)等)的高效液相色谱(HPLC)，且由含0. 三氟醋酸的32%以下的乙腈水溶液的直线浓度梯度分级分离。然后，将回收的 Hyp-Gly级分由减压干燥，而可得高纯度的Hyp-Gly。<从氨基酸的合成>可从氨基酸合成Hyp-Gly。作为Hyp-Gly的合成法而言，一般有(1)固相合成法与(2)液相合成法(例如，特开2003-183^8号公报参照)，且前者的情况中，再已知(A)Fmoc法与(B)Boc法的方法，而 Hyp-Gly通过任何方法合成也可。以下以固相法作为一例详细说明。可将羟基脯氨酸固定于载质聚苯乙烯，且由作为氨基的保护使用Fmoc基或Boc 基的公知的固相合成法合成。即，将表面用氨基修饰的直径0. Imm左右的聚苯乙烯高分子凝胶的珠作为固相使用，且由作为缩合剂用二异丙基碳二亚胺(DIC)的脱水反应，向 Fmoc(fluorenyl-methoxy-carbonyl)基保护氨基的羟基脯氨酸结合甘氨酸(肽结合)之后，将固相用溶剂洗好，且除去残留的甘氨酸等。此后，由除去与固相结合的羟基脯氨酸残基的保护基(脱保护)，可合成Hyp-Gly。<化学修饰>Hyp-Gly可被施化学修饰。化学修饰的具体的手段或处理条件可适用通常的肽的化学修饰技术。对于羟基脯氨酸残基的羟基的化学修饰而言，可例如，0-乙酰化是由在水溶剂中或非水溶剂中使无水醋酸作用等进行。甘氨酸残基的α -羧基的化学修饰对于，例如，酯化可由向甲醇的在悬浊后通气干燥氯化氢气体等进行，且酰胺化可由使碳二亚胺等作用来进行。作为化学修饰的其他具体例，可适用特公昭62-44522号公报或特公平5-79046号公报等中记载的化学修饰技术。〔疾病抑制剂〕本发明涉及的疾病抑制剂作为必须的有效成分包含具有Hyp-Gly的结构的二肽。 作为疾病抑制剂而言，可适宜举骨质疏松症抑制剂，变形性关节炎抑制剂，褥疮抑制剂等。本发明涉及的疾病抑制剂除了含本发明涉及的二肽作为有效成分之外，以本发明涉及的胶原肽含的本发明涉及的二肽作为有效成分也可。然后，在这时，上述疾病抑制剂不仅是，含有从氨基酸化学合成的Hyp-Gly或，从是胶原或明胶的水解物的胶原肽单离的 Hyp-Gly的实施方式，而也可是不从上述胶原肽单离Hyp-Gly地直接以胶原肽的形含有的实施方式。本发明涉及的疾病抑制剂，如此，也含使直接以胶原肽含有的形态，而是以本发明涉及的二肽作为有效成分，且也可包括将这些二肽在胶原肽的形中用的情况而联用。对于上述本发明涉及的疾病抑制剂全量，优选将上述Hyp-Gly以0. 001重量份以上的比例配合。更优选以0.01重量份以上的比例配合。不足0.001重量份，则有本发明的效果不被充分表达的担忧。而且，将本发明涉及的疾病抑制剂直接注入患部而用时，上述Hyp-Gly的含量优选是lmmol/L以上。本发明涉及的疾病抑制剂也可将Hyp-Gly在生理盐水等中稀释，而可充分得本发明的效果，而上述Hyp-Gly以外，在不损害本发明的效果的范围，也可使含有适宜其他有效成分或制剂用的成分。作为上述其他有效成分而言，葡萄糖胺及/或其盐，可举软骨素硫酸等，且可将这些以1种或2种以上组合使用。其中也是，葡萄糖胺及/或其盐由于有使由Hyp-Gly的疾病抑制效果升高的作用而优选。另外，作为上述其他有效成分，而也可含Hyp-Gly以外的肽或氨基酸，而例如，分子量比较大的肽，对于慢性类风湿性关节炎等，由于奏被称缓和由经口免疫宽容机制的骨 软骨组织的炎症的效果，所以有用。为了使含有Hyp-Gly以外的肽或氨基酸，则水解胶原或明胶而得到含有Hyp-Gly的胶原肽之后，将此胶原肽不单离Hyp-Gly地直接使用即可。而且，作为上述其他有效成分，以促进骨盐沉着的目的，可用钙或糖转移橙皮苷等，且以胶原的合成、沉着促进等的目的，也可用维生素C等。作为上述其他有效成分的配合量而言，对于疾病抑制剂全量，优选以0. 001 20 重量份用，而更优选以0. 01 20重量份的比例用。特别是，将葡萄糖胺及/或其盐的配合量，对于疾病抑制剂全量，优选作为5 15重量份。不足5重量份，则有使Hyp-Gly的效果升高的效果不被充分发挥的担忧，且超15重量份，则被排出到尿或粪中，且有成过量摄取的担忧。作为用于制剂化的成分而言，例如，可用结晶性纤维素等的赋形剂等，且对应于其形态等设定适宜的量即可。作为本发明涉及的疾病抑制剂的使用形态而言，可举例如，由经口施用摄取，或者向患部直接注入，或者所说的形态。Hyp-Gly,由于在肠管迅速被吸收，且向氨基酸的分解也几乎不发生，适宜由经口施用的摄取。经口施用的情况中，则将Hyp-Gly与上述其他有效成分或制剂用的成分混合而通过以往公知的方法，由打锭成型作为锭剂，或者也可以其他，颗粒剂，散剂，胶囊剂等的固态剂，溶液剂，悬浊剂，乳剂等的液剂，冷冻干燥制剂等的任意的形态制备。向患部直接注入时，则将Hyp-Gly用生理盐水等稀释而使用，而应必要，而且，也可用上述其他有效成分，而作为其浓度而言，如上述，优选将Hyp-Gly的含量作为lmmol/L 以上。在本发明涉及的疾病抑制剂中作为必须的有效成分含有的二肽有Hyp-Gly的结构，与有氨基酸，Hyp-Gly以外的结构的二肽，向Hyp-Gly结合其他氨基酸的三肽以上的肽等则相异。通过使包含上述具有Hyp-Gly的结构的二肽，表达出优良的疾病抑制效果(骨质疏松症，变形性关节炎，褥疮等的症状的抑制效果)。以上者将在后述的实施例中的性能评价试验中被具体立证。
〔与其他二肽的联用〕Hyp-Gly的疾病抑制效果有可通过与其他二肽联用协同提高的情况。例如，通过将Hyp-Gly与ftx)-Hyp联用，可协同提高Hyp-Gly的疾病抑制效果。而且，例如，对于变形性关节炎等的疾病而言，通过联用Ala-Hyp，可协同提高其效能。作为本发明涉及的胶原肽，例如，为了得共同含Hyp-Gly与ftx)-Hyp的胶原肽，基本上，通过与对于Hyp-Gly说明的2阶段酶处理法同样的方法，仅变更2次酶处理中用的酶的种类即可。作为这样的酶而言，可举例如，有曲霉属等来源的氨酰基脯氨酸二肽酶活性及羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶。在本发明涉及的疾病抑制剂中，而将Hyp-Gly与ftO-Hyp联用时，两者的含有比率的优选的范围是，两者的合计作为100重量％时，Hyp-Gly 50 90重量％，Pro-Hyp 10
50重量％。另外，将Hyp-Gly与其他二肽联用时，对于上述本发明涉及的疾病抑制剂全量的二肽的配合比例优选例如，二肽的合计量，0. 001重量份以上的比例。更优选以0.01重量份以上的比例配合。而且，将本发明涉及的疾病抑制剂直接注入患部使用时，二肽的合计含量优选是ΙΟμπιοΙ/L以上。对于由联用其他二肽的协同效果，以本发明的疾病抑制剂可抑制的代表的上述症状，即，骨质疏松症，变形性关节炎，褥疮作为例而具体说明。骨质疏松症是，如前述，骨的吸收由破骨细胞进行，且破骨细胞的分化及活化越是显著，骨的吸收率越变高的同时，另一方面，骨的形成由成骨细胞进行，且成骨细胞的分化及活化越是显著，骨的形成率越变高。因此，通过抑制破骨细胞的分化及活化，且亢进成骨细胞的分化及活化，可抑制骨质疏松症。然后，根据本发明人的了解，则Hyp-Gly，Pro-Hyp 在破骨细胞，成骨细胞的分化及活化中示如下的作用。S卩，首先，对于破骨细胞的分化及活化的机制说明，则首先，(i)多个前体破骨细胞融合而分化成多核巨细胞。催化此分化的酶是TRAP(Tertaric Acid Resistant Acid !Phosphatase :酒石酸抗性酸性磷酸酯分解酶)。接下来，(ii)将上述多核巨细胞(破骨细胞)骨组织溶解、分解。在上述机制，Hyp-Gly作为主要而抑制(i)，且Pro-Hyp抑制⑴， ( )的两方。因此提示，由联用Hyp-Gly，Pro-Hyp，这些协同作用，而发挥更优良的效果。另外，成骨细胞合成、分泌骨基质(I型胶原)，且由ALP (Alkaline Phosphatase 碱性磷酸酯分解酶)石灰化(Caltl(PO4)6(OH)2 氢氧化磷灰石)此骨基质，亢进骨化。此时， Hyp-Gly,亢进上述ALP活性，且通过再联用ftx)-Hyp，由协同效果促进Hyp-Gly的亢进效果， 且可使表达相比单独地用分别的二肽都优良的亢进效果。变形性关节炎依次分成，⑴细胞增殖期，(ii)软骨细胞分化/成熟期，(iii)向肥大化软骨细胞的分化(变性)期，(iv)石灰化及经此之后的凋亡(程序化的细胞死亡) 的4期，而在(i)，(ii)而言，主要ftx)-Hyp亢进向软骨细胞的分化及贡献于其维持，且再 (ii)，调节Hyp-Gly前体关节软骨细胞的分化，且催化向肥大化软骨细胞的分化(变性)，并且，由抑制也是特异标记物的ALP (Alkaline Phosphatase 碱性磷酸酯分解酶)的活性，抑制向(iii)的移行。其中，根据本发明人的见解，则通过再联用Ala-Hyp，在(ii)的Hyp-Gly 的作用，即，前体关节软骨细胞的分化的调节，和ALP活性的抑制协同升高。如此提示，通过CN 102177173 A
说明书
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联用Hyp-Gly、ftx)-Hyp，且再优选也联用Ala-Hyp，抑制协同软骨细胞的变性，且由使维持关节细胞的表现型，贡献于变形性关节症的抑制。褥疮的发症与治愈过程依次分成⑴炎症反应期，(ii)增殖期(肉芽形成期)， (iii)稳定期的3期。S卩，接受皮肤损伤，则在(i)的炎症反应期发生组织的断裂与血管的断裂，且局部出血，而由血液中的凝固因子等的作用与血管的收缩止血。接下来，淋巴细胞，单核细胞等作为浸出液从血管渗出，且向伤口移动(细胞迁移)。其中，Pro-Hyp发挥促进淋巴细胞及单核细胞的细胞迁移的功能。单核细胞成为巨噬细胞，且这再放出各种各样的化学物质，而成以下信号的发生源。另外，由内因性胶原酶(例如，MMP-13)而皮肤真皮中的胶原线维被分解。接下来，在(ii)的增殖期，由巨噬细胞的作用被释放的化学物质或由前述的内缘性胶原酶发生的胶原分解片段肽(例如，Pro-Hyp与Hyp-Gly)被刺激，且成纤维细胞被募集，且胶原线维(胶原原胶原主成分)生成。成纤维细胞，毛细血管，胶原进行共同作业， 且向伤口进出，且封缺损面，且愈合创面(肉芽组织形成)。其中，Pro-Hyp与Hyp-Gly的两者协同亢进胶原合成，而促进肉芽组织形成，而特别是，( )的增殖期的初期过程中主要 Pro-Hyp发挥生理功能，且在后期过程，主要Hyp-Gly发挥生理功能。肉芽组织被形成，则基底层以外的非增殖细胞移动而形成一层的上皮细胞层。然后，在此层下，从创缘基底层的细胞移动、增殖，且形成多层的上皮的结果，完成上皮化。最后，(iii)的过程中，成纤维细胞的活性回到平常，且胶原的生成变少，且保持生成量与分解量平衡的同时，以定常状态移行，而完成治愈。含于本发明涉及的胶原肽的二肽的上述的作用从在后述的实施例中的性能评价试验的各种效果的证实也被提示。(Pro-Hyp)上述的ftx)-Hyp不仅在与Hyp-Gly联用时，而在单独地用时，也有抑制骨质疏松症，变形性关节炎，褥疮等的症状的作用。以下中，对于此ftx)-Hyp详细说明，而由于与关于Hyp-Gly的上述的说明重复的内容多，对于主要差异点说明。Pro-Hyp也可脯氨酸单位及/或羟基脯氨酸单位被化学修饰，而特别是，对于羟基脯氨酸单位而言，羧基与羟基的任何，或，两方被化学修饰也可。以上，在本说明书，“有ftx)-Hyp的结构的二肽”，或，将其略记而称为“ftx)-Hyp” 时，此包括化学修饰的，也包括未化学修饰的。Pro-Hyp被化学修饰时，可在从弱酸性到中性溶解，且也可期待与其他有效成分的相溶性升高等。具体而言，对于脯氨酸残基的α-氨基而言，可举聚肽基化，琥珀酰化，马来酰化，乙酰化，脱氨基化，苯甲酰化，烷基磺酰基化，烯丙基磺酰基化，二硝基苯基化，三硝基苯基化，氨甲酰化，苯基氨甲酰化，巯基化等的化学修饰；对于羟基脯氨酸残基的α-羧基而言，可举酯化，酰胺化等的化学修饰；对于羟基脯氨酸残基的羟基而言，可举0-乙酰化等的化学修饰。对应于其他有效成分的种类等，而选择适宜的化学修饰即可。将上述ftx)-Hyp配合到疾病抑制剂的比例或，而且，对于在将此疾病抑制剂作为向关节局部的注入用而使用时的ftx)-Hyp的含量而言，与Hyp-Gly中述的比例或含量同样即可。上述ftx)-Hyp与Hyp-Gly同样，由例如，将胶原，明胶分成2阶段酶处理，或从氨基酸合成可得，且对于化学修饰而言，可举如后述的公知的手段。作为用于得到ftx)-Hyp的酶处理法而言，基本上，通过与对于Hyp-Gly说明的2阶段酶处理法同样的方法即可，而2次酶处理中，使如使用例如，有曲霉属等来源的氨基肽酶 P及氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶。Pro-Hyp，与Hyp-Gly同样，可从氨基酸合成，而这时，在以上说明的Hyp-Gly的合成法中，单，代替羟基脯氨酸用脯氨酸，且代替甘氨酸用羟基脯氨酸即可。如前述，Pro-Hyp也可被施化学修饰。化学修饰的具体的手段或处理条件可适用通常的肽的化学修饰技术。对于脯氨酸残基的α -氨基的化学修饰，例如，聚肽基化由与N-碳酸酐等的反应， 琥珀酰化或马来酰化由使在ΡΗ8附近与琥珀酸酐或马来酸酐等反应，乙酰化由使在中性附近与N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯等反应，脱氨基化由使亚硝酸等作用，苯甲酰化由使苯甲酰氯或安息香酸酐等作用，烷基磺酰基化或烯丙基磺酰基化由使与苯磺酰基氯，P"甲苯磺酰基氯，甲磺酰基氯等反应，二硝基苯基化或三硝基苯基化由使2，4_ 二硝基氟苯，2，4，6_三硝基苯磺酸等作用，氨甲酰化或苯基氨甲酰化由使氰酸等作用，巯基化由使N-乙酰高胱氨酸硫代内酯，S-乙酰巯基琥珀酸酐，硫代仲康酸，S-乙酰硫代衣苹酸酐等作用来进行即可。对于羟基脯氨酸残基的α -羧基的化学修饰，例如，酯化由向甲醇通气悬浊后干燥氯化氢气体等，酰胺化由使碳二亚胺等作用来进行即可。对于羟基脯氨酸残基的羟基的化学修饰而言，例如，0-乙酰化由在水溶剂中或非水溶剂中使醋酸酐作用等来进行即可。作为化学修饰的其他具体例，而可适用特公昭62-44522号公报或特公平5-79046 号公报等中记载的化学修饰技术。对于作为有效成分含ftx)-Hyp的疾病抑制剂的详细而言，由于与关于作为有效成分含Hyp-Gly的疾病抑制剂的叙述相同，所以省略说明。(Ala-Hyp)上述的Ala-Hyp，不仅在与Hyp-Gly联用时，而在单独使用时，也有抑制变形性关节炎等的症状的作用。以下中，对于此Ala-Hyp详细说明，而由于与关于Hyp-Gly或ftx)-Hyp的上述的说明重复的内容多，对于主要差异点说明。Ala-Hyp也可丙氨酸单位及/或羟基脯氨酸单位被化学修饰，而特别是，对于羟基脯氨酸单位而言，羧基与羟基的任何，或，两方被化学修饰也可。以上，在本说明书中，“有Ala-Hyp的结构的二肽”，或，将其略记为“Ala-Hyp”时， 此包括化学修饰的，也包括未化学修饰的。Ala-Hyp被化学修饰时，可在从弱酸性到中性溶解，且也可期待与其他有效成分的相溶性升高等，基本上，与上述的ftx)-Hyp同样的化学修饰即可。即，对于丙氨酸残基的 α -氨基而言，与在上述的ftx)-Hyp的脯氨酸残基的α -氨基同样的化学修饰，对于羟基脯氨酸残基的α -氨基及羟基而言，与在上述的ftx)-Hyp的羟基脯氨酸残基的α -氨基及羟基同样的化学修饰即可。对应于其他有效成分的种类等，而选择适宜的化学修饰即可。
对于将上述Ala-Hyp配合到疾病抑制剂的比例或，而且，在将此疾病抑制剂作为向关节局部的注入用而使用时的Ala-Hyp的含量而言，与Hyp-Gly中述的比例或含量同样即可。上述Ala-Hyp，与Hyp-Gly同样，由例如，将胶原，明胶分成2阶段酶处理，或从氨基酸合成可得，且对于化学修饰而言，可举如后述的公知的手段。作为用于得到Ala-Hyp的酶处理法而言，基本上，通过与对于Hyp-Gly说明的2阶段酶处理法同样的方法即可，而2次酶处理中，使用例如，有曲霉属等来源的蛋白酶活性及羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶。Ala-Hyp，与Hyp-Gly同样，可从氨基酸合成，而这时，在以上说明的Hyp-Gly的合成法中，单，代替羟基脯氨酸用丙氨酸，且代替甘氨酸用羟基脯氨酸即可。如前述，且Ala-Hyp也可被施化学修饰。化学修饰的具体的手段或处理条件可适用通常的肽的化学修饰技术。对于丙氨酸残基的α -氨基而言，与在上述的ftx)-Hyp的脯氨酸残基的α-氨基同样，对于羟基脯氨酸残基的α-氨基及羟基而言，与在上述的ftx)-Hyp 的羟基脯氨酸残基的α-氨基及羟基同样化学修饰即可。对于作为有效成分含Ala-Hyp的疾病抑制剂的详细而言，由于与关于作为有效成分含Hyp-Gly的疾病抑制剂的叙述相同，所以省略说明。
实施例以下，由本发明涉及的二肽或将其含的胶原肽的性能评价试验，以上述二肽作为有效成分的疾病抑制剂的配合例，而更具体说明本发明，而本发明不限定于这些。以下中， 为方便，将“重量份”简称为“份”，将“重量％ ”简称为“ ％ ”。〔二肽〕〈实施例1>由前述的固相法合成Hyp-Gly。BP,由将表面用氨基修饰的直径0. Imm左右的聚苯乙烯高分子凝胶的珠作为固相用，且作为缩合剂用二异丙基碳二亚胺(DIC)IO份的脱水反应，使向用 Fmoc (fluorenyl-methoxy-carbonyl)基保护氨基的羟基脯氨酸45份结合甘氨酸45份(肽结合)之后，将固相用溶剂(乙醇)洗好，且除去残留的甘氨酸等。此后，通过将与固相结合的羟基脯氨酸残基的保护基由三氟醋酸的温育除去(脱保护)合成Hyp-Gly。此二肽合成中，使用Liberty肽合成系统(CEM社制)。〈实施例2>实施例1的Hyp-Gly，及后述的参考例1_1的ftx)-Hyp的1 1混合物(重量基准)作为实施例2。〈实施例3>实施例1的Hyp-Gly，后述的参考例1_1的ftx)-Hyp，及后述的参考例1_2的 Ala-Hyp的1 1 1混合物(重量基准)作为实施例3。〈参考例1-1 >在上述Hyp-Gly的合成法，将羟基脯氨酸变更为脯氨酸，甘氨酸变更为羟基脯氨酸的以外，同样地合成ftO-Hyp，且将其作为参考例1-1。
〈参考例1-2>在上述Hyp-Gly的合成法，将羟基脯氨酸变更为丙氨酸，甘氨酸变更为羟基脯氨酸变更为的以外，同样地合成Ala-Hyp，且将其作为参考例1_2。<比较例1>在上述Hyp-Gly的合成法中，将羟基脯氨酸变更为亮氨酸，甘氨酸变更为羟基脯氨酸以外，同样地合成Leu-Hyp，且将其作为比较例1。〈比较例2>在上述Hyp-Gly的合成法中，将羟基脯氨酸变更为苯丙氨酸，甘氨酸变更为羟基脯氨酸以外，同样地合成Wie-Hyp，且将其比较例2作为。〈比较例3>在上述Hyp-Gly的合成法中，将羟基脯氨酸变更为丝氨酸，甘氨酸变更为羟基脯氨酸以外，同样地合成kr-Hyp，且将其作为比较例3。〔三肽〕〈比较仿Ij4>在上述Hyp-Gly的合成法中，将羟基脯氨酸变更为脯氨酸，甘氨酸变更为实施例1 中合成的Hyp-Gly以外，同样地合成Pro-Hyp-Gly，且将其作为比较例4。〔氨基酸〕〈比较例5，6>是氨基酸的脯氨酸作为比较例5，羟基脯氨酸作为比较例6。〔胶原肽〕〈实施例4>根据示于以下的方法，而得到含有Hyp-Gly的猪皮来源的胶原肽(PC)，且将其作为实施例4。使是猪皮来源胶原的热变性物的明胶(I型胶原)Ikg溶解于75V的温水4L，且温度调节到60°C之后，作为1次反应，而添加黄色曲霉来源蛋白酶10g，且由pH5. 0 6. 0， 于温度45 55°C保持120分钟酶来进行水解处理。接下来，作为2次酶反应，向其中添加有羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的米曲霉提取酶至终浓度1. 5%，且将其可溶化之后，使于 50°C反应6小时。反应后，此反应液在100°C加热处理10分钟，且之后，冷却至60°C，且用活性炭与过滤助剂(硅藻土)过滤，且对得到的母液于120°C高温杀菌处理3秒钟。然后， 将杀菌后的母液喷雾干燥，且得到猪皮来源的胶原肽(PC)。将此PC供于薄层层析(TLC)。即，向TLC板(商品名"Cellulose F”，Merck社制)滴下10 μ g可溶化于水的PC(斑原点)，使干燥之后，用溶剂(η-丁醇醋酸水= 4:1:幻展开。将此板风干之后，由将靛红-醋酸锌发色液(将靛红lg，醋酸锌1.5g加温溶解于异丙醇IOOmL,且冷却后加醋酸ImL调节)喷雾到同板，确认上述中得到的PC的蓝色的斑的Rf值([从斑原点至发色斑的距离]+ [从斑原点至溶剂展开前沿的距离])，与是点斑到相同板的内部标记物的Hyp-Gly与ftx)-Hyp中Hyp-Gly的蓝色斑的Rf值一致，即， 此 PC 含 Hyp-Gly。再有，计数氨基酸序列已知的猪皮来源的I型胶原(重量(X) g)中含的Hyp-Gly 的序列的和(Y)，且由下述式求出该I型胶原全体中的理论含有量时，是20. 0重量％。
((Hyp-Gly的数(Y)) X (Hyp-Gly的重量(分子量)))/(全序列的重量(X))从以上来看，上述PC理论上含Hyp-Gly最大20. 0重量％。〈实施例5>用鱼鳞来源明胶以外，由与上述PC的制备同样的操作，得到含有Hyp-Gly的鱼鳞来源的胶原肽(FC)，且将其作为实施例5。将此FC与上述PC的情况中同样由TLC分析时，确认出Hyp-Gly的存在。再有，计数氨基酸序列已知的鱼鳞来源的I型胶原(重量(X) g)中含的Hyp-Gly 的序列的和(Y)，且由下述式求出该I型胶原全体中的理论含有量时，是23. 5重量％。((Hyp-Gly的数(Y)) X (Hyp-Gly的重量(分子量)))/(全序列的重量(X))从以上来看，上述FC理论上含Hyp-Gly最大23. 5重量％。〈实施例6>根据示于以下的方法，得到含有Hyp-Gly的猪皮来源的胶原肽(PC-CP)，且将其作为实施例6。使猪皮来源胶原的热变性物是的明胶(I型胶原)Ikg向20mM Tris-HCl缓冲液 (pH7. 5) 4L在加温的同时溶解之后，冷却至40°C，且作为1次酶反应，而添加Ig的胶原酶 (新田明胶社制，Collagenase N2)后，由pH7. 0 7. 8，于40°C保持M小时进行酶分解处理。接下来作为2次酶反应，而向此反应液添加有羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的黑曲霉提取酶至终浓度1. 0%，且将其可溶化之后，使于pH4. 0，50°C反应6小时。反应后，将此反应液在100°C加热处理10分钟，且之后，冷却至60°C，且用活性炭与过滤助剂(硅藻土)过滤，且对得到的母液于120°C高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，得到 PC-CP。另外，将此PC-CP与上述PC的情况中同样由TLC分析时，确认出Hyp-Gly的存在。再有，计数氨基酸序列已知的猪皮来源的I型胶原(重量(X) g)中含的Hyp-Gly 的序列的和(Y)，且由下述式求出该I型胶原全体中的理论含有量时，是20. 0重量％。((Hyp-Gly的数(Y)) X (Hyp-Gly的重量(分子量)))/(全序列的重量(X))从以上来看，上述PC-CP理论上含Hyp-Gly最大20. 0重量％。〈实施例7>根据示于以下的方法，得到含有Hyp-Gly及ftO-Hyp的猪皮来源的胶原肽 (PC-PH)，且将其作为实施例7。使是猪皮来源胶原的热变性物的明胶(I型胶原)Ikg溶解于75V的温水4L，且将温度调节到60°C之后，作为1次酶反应，而添加黄色曲霉来源蛋白酶10g，且由pH5. 0 6. 0，于温度45 55°C保持120分钟酶进行水解处理。接下来，作为2次酶反应，而向其中添加有氨酰基脯氨酸二肽酶活性及羟基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的黑曲霉提取酶至终浓度1. 5 %，且将其可溶化之后，使于pH4. 5 5. 5，温度45 50 V反应6小时。反应后，此反应液在100°C加热处理10分钟，且之后，冷却至60°C，且用活性炭与过滤助剂(硅藻土) 过滤，且将得到的母液于120°C高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，得到 PC-PH。另外，将此PC-PH与上述PC的情况中同样由TLC分析时，确认出PC-PH的蓝色斑的Rf值与Hyp-Gly及ftO-Hyp的各蓝色斑的Rf值一致，且共含PC-PHHyp-Gly及ftO-Hyp。
〈比较例7>仅进行在上述的PC-CP的制备的1次酶反应，而得到均不含有Hyp-Gly，Pro-Hyp 的胶原肽(PC-CP-Cont)，且将其作为比较例7。S卩，使猪皮来源胶原的热变性物是的明胶(I型胶原)lkg加温的同时溶解在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7. 5)4L中之后，冷却至40°C，且作为1次酶反应，而添加Ig的胶原酶 (新田明胶社制，Collagenase N2)后，由pH7. O 7. 8，于40°C保持M小时进行酶分解处理。接下来，将酶水解处理中得到的溶液在100°C加热处理10分钟，且之后，冷却至60°C， 且用活性炭与过滤助剂(硅藻土)过滤，且对得到的母液于120°C高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，且PC-CP-Cont得到。另外，将此PC-CP-Cont与上述PC的情况中同样由TLC分析时，无法确认Hyp-Gly， Pro-Hyp的任何存在。〔性能评价试验〕用上述实施例1 7，参考例1-1、1-2、比较例1 7涉及的各二肽，三肽，氨基酸， 胶原肽进行的各性能评价试验的详细示于以下。<评价试验1-1 破骨细胞的分化及活化的抑制>基于Kobayashi Y.等的破骨细胞分化培养法[J. Bone Miner. Metab. (2004)22 p. 318-328]评价。即，用Hyp-Gly, Hyp-Gly及Pro-Hyp的1 1混合物，且将各自添加到小鼠初代骨髓细胞培养液至终浓度625 μ Μ,且从培养6天后研究是标记物酶的酒石酸抗性酸性磷酸酯水解酶(TRAP)的各抑制活性。同样地，研究用其他二肽(Pro-Hyp、Ala-Hyp、Leu-Hyp、 Phe-Hyp、kr-Hyp)，三肽(Pro-Hyp-Gly)，氨基酸(ftx^Hyp)时的 TRAP 抑制活性。而且，也研究作为对照，而未添加肽(空白)之时的TRAP抑制活性。另外，而且，各种肽，由氨基酸的破骨细胞的分化及活化的抑制度，以下由Pit测定评价。即，将破骨细胞在象牙片上培养的Pit测定基于Kakudo S，et al(1996). J. Bone Miner. Metab. 14 :129-136实施。具体而言如下。若令含有小鼠肠管骨来源的破骨细胞的前体细胞与骨髓间质细胞的悬浮液在 10% DMSO存在下，于_80°C冷冻保存，而使成熟破骨细胞死亡。将此细胞2. OX IO5接种于设置象牙片的96孔板的各孔，且将各被验肽添加到培养液，于37°C，5% CO2培养约1周。之后，用硅制橡胶POLICEMAN从象牙片除去细胞之后， 用酸苏木精溶液染色象牙片数分钟。此时，由TRAP染色测量TRAP染色阳性多核巨细胞(破骨细胞)数，且算出对照(空白)的对于其细胞数的相对数。之后，在显微镜下测量由破骨细胞的Pit数(吸收窝的数)，且由对于空白(对照)的相对比表示各被验肽的破骨细胞的活性抑制度。结果示于表1。[表1]
权利要求
1.胶原肽，其包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的二肽。
2.二肽，其具有Hyp-Gly的结构。
3.疾病抑制剂，其包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的有效成分。
4.权利要求3中所述的疾病抑制剂，其中成为上述有效成分的二肽作为胶原肽被含
5.权利要求3或4中所述的疾病抑制剂，其中作为有效成分也含葡萄糖胺及/或其盐。
6.权利要求3 5中任一项所述的疾病抑制剂，其是骨质疏松症抑制剂。
7.权利要求3 5中任一项所述的疾病抑制剂，其是变形性关节炎抑制剂。
8.权利要求3 5中任一项所述的疾病抑制剂，其是褥疮抑制剂。
9.权利要求3 8中任一项所述的疾病抑制剂，其是经口用抑制剂。
10.权利要求3 8中任一项所述的疾病抑制剂，其是向关节局部的注入用抑制剂。
全文摘要
本发明以提供对于骨质疏松症，变形性关节症，褥疮等的各种疾病的抑制有效的肽分子的本体，尤其是向肠管的体内的吸收容易的二肽，含有上述二肽作为必须的二肽的胶原肽及含有上述二肽作为必须的有效成分的疾病抑制剂作为课题，且作为解决涉及的课题的手段，而本发明涉及的胶原肽以包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的二肽作为特征。本发明涉及的二肽以有Hyp-Gly的结构作为特征。本发明涉及的疾病抑制剂以包含具有Hyp-Gly的结构的二肽作为必须的有效成分作为特征。
文档编号C07K5/06GK102177173SQ20088013093
公开日2011年9月7日 申请日期2008年11月14日 优先权日2008年9月30日
发明者中谷祥惠, 井上直树, 刘锦芳, 和田政裕, 小林永运, 小泉圣子, 杉原富人, 真野博, 高崎一 申请人:新田明胶株式会社