专利名称：采用多孔表面基底促进蛋白质晶体异相形核的方法
技术领域：
本发明涉及一种促进蛋白质异相形核的方法，特别是采用多孔表面基底促进蛋白质晶体 异相形核的方法，用于蛋白质结晶可重复性研究以及结晶条件的筛选。
背景技术：
三维结构的解析对于研究生物大分子的功能具有深远的意义。特别是作为药物的靶标， 这些研究也有利于更加合理的设计药物以及理解药物的作用机制。获取高质量及合适尺寸的 蛋白质晶体是完成结构解析的瓶颈，而促进蛋白质异相形核有利于获得高质量的晶体。
文献 1 " B.Segelke.(2001) Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening [J]. J Cryst Growth, ， 232(1-4): 553-562"研究表明蛋白质结晶条件筛选 成功率很低，大多数蛋白质筛选成功率仅为2%。
文献2 "Johanna M. Kallio, Nina Hakulinen, Juha P. Kallio， Merja H. Niemi, Juha Rouvinen (2009) The Contribution of Polystyrene Nanospheres towards the Crystallization of Proteins. PLoS ONE4(l):e4198."添加聚苯乙烯作为形核剂，用于筛选蛋白质结晶条件，并且发现晶体质量 提高。但文献2中是一种添加形核剂的方法，没有涉及结晶时表面基底的处理。
文献公开的获取蛋白质晶体的第一步通常是利用结晶筛选试剂，筛选合适的结晶条件。 悬滴法结晶广泛的应用在蛋白质筛选中。蛋白质结晶条件筛选普遍存在的问题是筛选成功率 比较低。
发明内容
为了克服现有技术蛋白质结晶条件筛选成功率低的不足，本发明提供一种促进蛋白质异
相形核的方法，在不改变蛋白质基本结晶方法的前提下，采用多孔表面基底，进行了蛋白质
结晶可重复性实验以及结晶条件筛选实验，实验结果证明，采用多孔表面基底，可以明显提
高蛋白质结晶条件筛选成功率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案
(a) 用体积比为70%， 60%， 50%, 40%的氢氟酸溶液处理盖玻片表面，依次得到四种 不同形貌的多孔表面基底材料；
(b) 用原子力显微镜扫描上述四种多孔表面基底材料形貌，得出四种表面粗糙度；
(c) 蛋白质溶液在经过上述步骤处理的多孔表面的盖玻片上形核以及生长；
(d) 在20"C温控箱中放置2天后取出，在显微镜下观察，统计出现蛋白质晶体在多孔 表面基底生长的的条件数目。本发明的有益效果是由于用多孔表面作为形核基底，蛋白质结晶筛选成功率由背景技 术的2%提高到46 76%。
下面结合实施例对本发明作详细说明。
具体实施例方式
实施例l:多孔表面基底用于溶菌酶蛋白可重复性实验。
第一步配置体积比为70%， 60%， 50%, 40%的氢氟酸溶液，不同塑料器皿分装。用竹 镊将18cm X18cm的盖玻片放入准备好的溶液中浸泡10秒钟，再放入饱和氢氧化钠溶液中浸 泡半小时后，取出加入少许清洗剂超声清洗l小时，用自来水冲洗5遍。放入控温为6CTC的烘 箱烘干1天。硅化液硅化后，取出再次加入少量清洗剂超声清洗l小时，用自来水冲洗10遍， 超纯水冲洗3遍。得到四种不同表面形貌的多孔表面基底。
第二步用型号为Pico ScanTM 2500原子力显微镜扫描四种不同表面形貌的多孔表面基 底以及作为对照的未经处理的普通盖玻片，得到三维表面形貌，再由原子力显微镜配置的相 关软件PicoScan5.3.3 Pclink计算出盖玻片表面的粗糙度。得到的均方根粗糙度分别为198.00、 166.49、 120.57、 80.81、 69.82，平均粗糙度分别为162.54、 130.14、 96.16 、 64.80、 60.17。
第三步将经过六次重结晶的日本Seikagaku公司的货号为100940的溶菌酶，溶于pH为 4.60， 0.1 mol/L的醋酸钠缓冲液中，使其终浓度为IO mg/ml 、 13 mg/ml 、 15 mg/ml、 17 mg/ml、 20 mg/ml。将氯化钠溶于溶于pH为4.60， 0.1 mol/L的醋酸钠缓冲液中，使其终浓度为20 mg/ml 、 25mg/ml 、 30mg/ml、 40mg/ml。用0.22 (xm的滤膜滤去杂质。
第四步将上步的蛋白质溶液和氯化钠溶液分别在四种不同粗糙度的多空表面基底以及 作为对照的未经处理的普通盖玻片上进行晶体生长。
第五步样品在温控箱中放置2天后，在显微镜下观察统计出现溶菌酶晶体的数目，并 统计出现蛋白质晶体在多孔表面基底生长的的成功率以及对照组的结晶成功率的数目。
经过统计得到如下结果体积比为70%的氢氟酸处理的盖玻片多孔基底表面得到的晶体
的成功率提高52%，体积比为60%的氢氟酸处理的盖玻片多孔基底表面得到的晶体的成功率 提高46%，体积比为50%的氢氟酸处理的盖玻片多孔基底表面得到的晶体的成功率提高54%， 体积比为40%的氢氟酸处理的盖玻片多孔基底表面得到的晶体的成功率提高54%。 实施例2:多孔表面基底用于蛋白酶K的结晶条件筛选实验。
第一步配置体积比为70%， 60%， 50%， 40%的氢氟酸溶液，不同塑料器皿分装。用竹 镊将18cmxl8cm的盖玻片放入准备好的溶液中浸泡10秒钟，再放入饱和氢氧化钠溶液中浸 泡半小时后，取出加入少许清洗剂超声清洗1小时，用自来水冲洗5遍。放入控温为60'C的 烘箱烘干1天。硅化液硅化后，取出再次加入少量清洗剂超声清洗1小时，用自来水冲洗IO遍，超纯水冲洗3遍。得到四种不同表面形貌的多孔表面基底。
第二步用型号为Pico ScanTM 2500原子力显微镜扫描四种不同表面形貌的多孔表面基 底以及作为对照的未经处理的普通盖玻片，得到三维表面形貌，再由原子力显微镜配置的相 关软件PicoScan5.3.3 Pclink计算出盖玻片表面的粗糙度。得到的均方根粗糙度分别为198.00、 166.49、 120.57、 80.81、 69.82，平均粗糙度分别为162.54、 130.14、 96.16 、 64.80、 60.17。
第三步将美国Sigma公司的货号为P6556的蛋白酶K，溶于pH为4.60， 0.1 mol/L的 HEPES钠缓冲液中，使其终浓度为20 mg/ml。用0.22 pm的滤膜滤去杂质。本实施例用Hampton 公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶缓冲液对蛋白酶K的结晶条件进行 筛选。
第四步将上步的蛋白质溶液和氯化钠溶液分别在四种不同粗糙度的多空表面基底以及 作为对照的未经处理的普通盖玻片上进行晶体生长。
第五步样品在温控箱中放置2天后，在显微镜下观察统计出现溶菌酶晶体的数目， 并统计出现蛋白质晶体在多孔表面基底生长的的结晶条件的个数以及对照组的结晶条件 的个数。
经过统计得到如下结果体积比为70%的氢氟酸处理的盖玻片多孔基底表面得到的晶体 的成功率为71%，体积比为60%的氢氟酸处理的盖玻片多孔基底表面得到的晶体的成功率
76%，体积比为50%的氢氟酸处理的盖玻片多孔基底表面得到的晶体的成功率67%，体积比 为40%的氢氟酸处理的盖玻片多孔基底表面得到的晶体的成功率60%,相对于文献1中大多 数蛋白质筛选成功率为2%有明显提高。
除上述的实施例外，还进行了多孔表面基底用于溶菌酶蛋白结晶条件筛选，结晶筛选成 功率也得到了明显的提高。
权利要求
1、一种促进蛋白质异相形核的方法，其特征在于包括以下步骤(a)用体积比为70％，60％，50％，40％的氢氟酸溶液处理盖玻片表面，依次得到四种不同形貌的多孔表面基底材料；(b)用原子力显微镜扫描上述四种多孔表面基底材料形貌，得出四种表面粗糙度；(c)蛋白质溶液在经过上述步骤处理的多孔表面的盖玻片上形核以及生长；(d)在20℃温控箱中放置2天后取出，在显微镜下观察，统计出现蛋白质晶体在多孔表面基底生长的的条件数目。
全文摘要
本发明公开了一种促进蛋白质异相形核的方法，首先用体积比为70％，60％，50％，40％的氢氟酸溶液处理盖玻片表面，依次得到四种不同形貌的多孔表面基底材料；蛋白质溶液在经过上述步骤处理的多孔表面的盖玻片上形核以及生长；在20℃温控箱中放置2天后取出，在显微镜下观察，统计出现蛋白质晶体在多孔表面基底生长的条件数目。由于用多孔表面作为形核基底，蛋白质结晶筛选成功率由背景技术的2％提高到46～76％。
文档编号C07K1/00GK101602788SQ20091002329
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月10日 优先权日2009年7月10日
发明者君 刘, 尹大川, 王玺凯, 郭云珠, 鹿芹芹 申请人:西北工业大学