专利名称：一种新的载脂蛋白a-ⅱ的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组蛋白质及其制备，特别是涉及在巴斯德酵母中表达重组人载脂蛋 白A-II (rhApoA-II)，以及优化的高密度发酵生产重组人载脂蛋白A-II的方法。
背景技术：
载脂蛋白A-lKapolipoprotein A-II, ApoA-II)由肝脏和小肠合成，人血浆中的 ApoA-II半衰期为4. 4天，是血清高密度脂蛋白(HDL)中第二种主要的载脂蛋白，约占HDL 中蛋白总量的20%。在乳靡微粒(CM)中它的含量可达总载脂蛋白的7% 10%，极低密度 脂蛋白(VLDL)中也有少量的ApoA-II存在，血浆中ApoA-II的浓度为0. 35 0. 5g/L(罗 静聪，刘秉文，蓝天鹤.人血浆载脂蛋白A-II的分离纯化及鉴定[J].生物化学杂志，1990， 6(2) 157-161)。ApoA-II是由两条各含77个氨基酸的肽链组成，单体分子量为8700D，在人血浆中 以二聚体形式存在，在不加还原剂的SDS-PAGE中测出相对分子质量约为17. 5kD。ApoA-II 有多态性存在，最主要的多态性等电点为4.9。人ApoA-II mRNA长473个碱基，含有一个 58bp的5’不翻译区。人类和鼠的ApoA-II定位于1号染色体上。其基因结构与ApoA_I、 A-IV、C-II、C-III及E的基因结构颇为相似，含有4个外显子和3个内含子。内含子I长 169bp，插入基因组5’不翻译区；内含子II长293bp，插入紧邻信号肽基因酶切位点的密码 区；内含子III插入成熟肽的编码区。ApoA-II具有多种生理功能①维持HDL结构=ApoA-II肽段12 31和肽段50 77具有与磷脂的结合能力，经二级结构分析认为，残基17 30和51 62形成的双性螺 旋结构是人ApoA-II与脂质结合的分子基础；②激活肝脂酶(h印atic lipase，HL)，用以水 解CM和VLDL中的三酰甘油和磷脂；③抑制凝血酶原活性；④抑制卵磷脂胆固醇酰基转移 酶(LCAT)活性，从而阻碍细胞内胆固醇的运出，酯化和转移；⑤其他=ApoA-II还具有置换 HDL颗粒中的ApoA-I，识别HDL受体、结合脂蛋白和部分拮抗低密度脂蛋白对内皮细胞的损 伤作用，从而保持内皮细胞膜的完整性等功能。ApoA-II的多种生物学活性使其在脂质代谢调控中起着十分重要的作用。现阶 段，对ApoA-II的检测多限于试验研究，对某些疾病的诊断或研究起到辅助作用。目前， ApoA-II多是从血浆中分离并纯化得到的，成本高而产量低。因此，有必要建立和发展重组 表达和纯化ApoA-II的方法，以便满足实验室研究的需求。甲基营养酵母，特别是巴斯德毕赤酵母是已被深入研究的真核表达系统，并已被 用于表达许多有用的蛋白质。例如，美国专利5，324，639公开了在甲基营养酵母特别是巴 斯德毕赤酵母细胞中生产胰岛素样生长因子1的方法；美国专利5，330，901公开了使用 巴斯德毕赤酵母系统表达人血清白蛋白的方法；美国专利5，965，389提供了在甲基营养 酵母中表达L-谷氨酸脱羧酶(GAD65)的DNA构建体以及由之制备纯的GAD65的方法；美 国专利公开了在巴斯德毕赤酵母中表达血小板衍生的细胞因子(PDGF)的方法；美国专利 6，780，615描述了使用重组巴斯德毕赤酵母生产应乐果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未见关 于使用巴斯德毕赤酵母生产人载脂蛋白A-II的报道。
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发明目的本发明的一个目的是提供一种使用甲基营养酵母生产重组人载脂蛋白 A-II(rhApoA-II)多肽的方法，该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营 养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作连接的元件的DNA构建体转化的 (1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码载脂蛋白A-II的DNA片段；(3)转录终止子和(4) 可选择标志，从而以至少50mg/L培养基的浓度产生载脂蛋白A-II多肽。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母， 并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOXl基因。本发明的另一个目的是提供用于表达重组人载脂蛋白A-II的甲基营养酵母，该 酵母能够依靠作为碳源和能源的甲醇生长，并且是被包括甲基可诱导的转录启动子、编码 载脂蛋白A-II的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母， 并且甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOXl基因。本发明的再一个目的是提供用于在巴斯德毕赤酵母中表达重组人载脂蛋白A-II 多肽的DNA构建体，该构建体包括可操作地连接的元件甲基可诱导的转录启动子、编码载 脂蛋白A-II的DNA片段、转录终止子和可选择标志。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母， 并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOXl基因。本发明的再一个目的是提供使用巴斯德毕赤酵母大规模生产重组人载脂蛋白 A-II多肽的优化的发酵培养条件，特征在于其中发酵温度维持在28°C 30°C，所使用的pH 值为6. 0 6. 5，并且培养基中添加有0. 5% (W/V)的蛋白胨。
发明内容
本发明涉及蛋白质生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达载脂 蛋白A-II的方法。巴斯德毕赤酵母(P. Pastoris)是20世纪80_90年代发展起来的极具潜力的酵母 表达系统，由于其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点而得到越来越广泛的应用。作为真核表达系统，巴斯德毕赤酵母具有许多其它蛋白表达系统所不具备的优 点①属于单细胞生物，故保留了易于操作和生长速度快的特点；②营养要求低，培养基成 分简单，生产成本低，特别适用于工业化大规模生产；③通过同源重组，可将表达载体稳定 地整合到宿主染色体中，连续传代中不易丢失；④具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOX)启 动子，可严格调控外源基因的表达；⑤表达量高，许多蛋白的产率可达到每升克以上水平； ⑥表达的蛋白质既可存在于胞内又可分泌至胞外，巴斯德毕赤酵母自身蛋白质的分泌量很 低，十分有利于目的产物纯化；⑦作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的正确加 工和修饰；⑧糖基化程度低。毕赤酵母表达系统由一个外源基因表达框和AOXl启动子、多克隆位点(MCS)和 一个从AOXl基因上拷贝下来的终止序列(TT)组成。同时，大多数载体都包含作为筛选标 记的HIS4基因和为拷贝增殖而存在的序列(如ColEI复制起始点和抗氨苄青霉素基因)。替代或插入方式整合到染色体的AOXl部位的A0X13’非编码 区序列。本发明所使用的载体是由启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点等元件构 成。另外分泌型载体还需要有信号序列。最常用的启动子是AOXl启动子，它的甲醇诱导性很强，因而它控制下的外源基因 能得到较高的表达。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力是由AOXl提供的。当在以葡萄糖或 甘油为碳源的培养基上生长时，AOXl转录受到抑制；而在以甲醇为唯一生长碳源时，则可 诱导AOXl基因的转录和蛋白质表达。选择标记(HIS4) —般是对应于营养缺陷型受体的野 生型基因。巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白质很少，所以分泌表达是一种理想的表达方式。 同时，胞外表达更有利于蛋白质的提取和纯化。本发明优选的信号肽是a因子(aMF)。a因 子信号序列由87个氨基酸组成，来自于啤酒酵母(S. cerevsia)的a性成熟因子前导序列， 并且已将这段序列编码的信号肽插人到巴斯德毕赤酵母的表达载体中。本发明的巴斯德毕赤酵母表达载体可以是胞内表达的，也可以是分泌表达的。这 些载体都包括一个由0.9kb的5' AOXl序列片段和约0.3kb的转录终止基因的3'序列组 成的表达盒。分泌型表达载体可以是pPIC9、pPIC9k、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6E6等；胞 内表达的载体可以是 pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHW010E121、pGAPZ、pGAPZa 等。本 发明优选的是pPICZa。一般用于外源基因表达的巴斯德毕赤酵母菌株包括Y-11430、M_6100_3、GSl 15、 KM7U SMDl 168等，本发明优选的是巴斯德毕赤酵母X_33菌株。得到携带载脂蛋白A-II基因的重组表达载体后，可使用锂盐法、PEG法、原生质球 法和电穿孔法等方法转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞。其中，本发明优选的转化方法是电穿 孑L法(Sambrook，ed. Molecular Cloning :A Laboratory Manul(2nd. ed.)，Vols. 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory,1998)。导入酵母体内的重组表达载体只有与酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染 色体上，外源基因才能够稳定存在并得以表达。本发明中，为了稳定地表达目的基因，可以 在His或5' AOXl的单酶切位点将质粒载体线性化(Sac I)，使之通过单交换整合到酵母 细胞染色体中，从而得到表型为Mut+并具有高甲醇利用能力的转化子。用于本发明的巴斯德毕赤酵母含有典型高等真核生物的许多翻译后修饰功 能。这些功能包括信号肽的加工、蛋白质折叠、二硫键的形成、0-及N-型糖基化和酰化 等。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白质的糖基化链参与细胞识别、激素受 体结合、蛋白质定位及宿主_微生物间相互作用。糖基化过程是经一系列剪接并产生由 Mans-6-GluNAC2(高甘露糖型)组成的寡核糖的反应。巴斯德毕赤酵母能够将碳水化合物 连接到分泌表达的外源蛋白质上。巴斯德毕赤酵母修饰糖链的平均长度为8 14甘露糖， 而且外链不含a_l，3甘露糖，所以其表达的糖蛋白特别适于治疗应用。由于本发明中充分优化了发酵pH值、搅拌速率、营养补给等培养条件，所以可使 酵母菌高密度生长，从而导致产物的高效表达。例如，在5L摇瓶培养条件下，本发明的重组 载脂蛋白A-II多肽表达产率可达到50mg/L。绝大多数情况下，巴斯德毕赤酵母(P. Pastoris)中整合多拷贝外源基因会提高 重组蛋白表达产量，所以本发明优先选择分泌型、高拷贝标记和易操作的穿梭载体，特别是
5PPICZa作为ApoA-II多肽的表达载体。另外，由于在His位点整合时，染色体突变的His位点可与表达盒的HIS4基因位 点之间发生基因交换会导致表达盒的丢失，故一般优先选择AOXl位点。本发明中，发酵培养所使用的培养基可以是BMGY/BMMY，BMG/B匪，MGY/MM等培养 基，但优选的是成分中含有缓冲液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培养基。作为唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般为培养体积的0. 5-1. 0% (V/V)。发酵培养过程中，可使用已知的方法检测由被转化细胞分离物所产生的ApoA-II 多肽含量，并从中选择有高产率的细胞分离物，用于放大生产。可使用饱和硫酸铵盐析、离子交换层析、亲合层析等方法分离并纯化所需ApoA-II 多肽。本发明首次在酵母(毕赤酵母X-33)中高效分泌表达了 rhApoA-II，建立了稳定 WrhApoA-II毕赤酵母高效表达体系。与在大肠杆菌中的表达相比，本发明的方法具有如 下特点①表达体系稳定，含目的基因的表达盒通过同源重组整合进入酵母的染色体中，菌 种稳定，不存在质粒丢失的问题；②有效的分泌表达，目的蛋白质的表达受醇氧化酶启动子 的严格控制，可在甲醇诱导下启动表达并将表达产物分泌到培养基中，而且毕赤酵母本身 的蛋白很少分泌到培养基中，使目的蛋白更易于纯化；③表达产量高，rhApoA-II在毕赤酵 母中的摇瓶规模表达量可高达50mg/L ；④不存在内毒素污染问题；⑤大规模发酵生产成本低。在rhApoA-II纯化方面，因为hApoA-II的等电点约为4.9，所以本发明采用 PH3. O条件下进行阳离子交换层析可很好的避免核酸和内毒素的污染，并且有利于保持 rhApoA-II的稳定，防止其降解。本发明建立了在酵母中高效分泌表达rhApoA-II的方法，同时建立了联合使用阳 离子交换层析和疏水层析技术纯化rhApoA-II产物的方法。使用SDS-PAGE以及蛋白质 N-端测序分析，证实按照本发明方法生产的rhApoA-II具有与天然ApoA-II相同的序列和 理化性质，从而为进一步检测其体内外生物学活性提供了必要条件。结果显示，本发明建立的毕赤酵母工程菌高密度发酵生产重组人载脂蛋白A-II 的产量约为50mg/L发酵液、产物回收率约为68%、产物的纯度高达94. 3%。本发明的这些 研究结果无疑将为重组人载脂蛋白A-II的工业化生产和临床应用提供必要的基础。
图1显示重组质粒pPICZa/hApoA-II转化酵母菌的PCR鉴定电泳图谱。其中泳道 9是DNA分子量标志物(DL2000)；泳道1是空白质粒pPICZa转化的酵母菌基因组DNA的 PCR产物；泳道2 8和10 12是不同酵母菌转化子基因组DNA的PCR扩增产物。图2显示不同纯化阶段rhApoA-II的SDS-PAGE图谱(考马斯亮蓝染色)。其中泳 道1是甲醇诱导表达120h发酵上清；泳道3是Takara蛋白质分子量标志物；泳道2是经 SP Sepharose XL阳离子层析纯化的rhApoA-II ；泳道4是经SP Sepharose XL阳离子层析 和Source 30疏水层析纯化的rhApoA-II。图3显示pH对rhApoA-II表达的影响(SDS-PAGE分析)。其中泳道1是甲醇诱 导表达Oh发酵上清；泳道2 10分别为pH 3. 2,3. 6,4. 0,4. 4,4. 8,5. 2,5. 6,6. 0、6· 5诱导表达120h上清；泳道11是Takara蛋白质分子量标志物。
具体实施例方式以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本 发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。实施例1 人载脂蛋白A-II基因(hApoA-II)的克隆和扩增(1)Trizol法从人肝组织中提取总RNA将新鲜分离的人肝组织切成IOOmg的大小，立即放入液氮中速冻。按下列方法从 组织中提取总RNA。取出冰冻的组织300mg放入盛有液氮的研钵中，将组织碾碎。将碾碎 的组织移入50ml离心管中，加入约5ml Trizol,于室温用勻浆器高速勻浆15 30s。加 Λ 1. Oml氯仿(200 μ 1/ml Trizol)，充分振荡摇勻，室温下放置5min。4°C离心(12000" min)15min后将上层水相移至另一离心管中。加入等体积异丙醇，振荡摇勻，室温沉淀 10min，4°C离心(12000r/min) 15min，弃上清。加入75%乙醇Iml洗涤沉淀2次，4°C离心 (12000r/min) 5min,室温下空气蒸发残存乙醇。将总RNA沉淀溶于50 μ IDEPC处理过的水 中，-80°C保存备用。取1 μ 1样品稀释100倍后经紫外分光光度计测定Α260和Α280，计算其浓度和纯 度，琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性。RNA含量按下面公式计算RNA 浓度(μ g/ μ 1) = Α260 X 40 X 稀释倍数 /1000Α260/Α280 = 1. 8 2. 0 表示纯度合格(2)hApoA-II 基因的克隆(RT-PCR 法)RT 反应在0. 2ml EP管中加入上述提取的总RNA 1 μ g，1 μ 1 OligodT，70°C变性lOmin，冰 浴lmin，然后加入下列反应液MgCl24 μ 110 X RNAPCR 缓冲液2 μ 1RNA 酶抑制剂0. 5 μ 1dNTP(10mmol/L)2μ 1AMV逆转录酶1 μ 1无RNA酶灭菌超纯水 加至终体积20 μ 1于PCR仪上42°C反应60min，然后99°C 5min灭活逆转录酶，合成cDNA用于下一步 PCR反应。PCR反应
向上述0. 2ml EP ■f中加入以下反应体系
10 X LAPCR缓冲液8μ 1
LATaq1 μ 1
上游引物1 μ 1
下游引物1 μ 1
灭菌超纯水加至终体积100 μ 1
在PCR仪上进行循环扩增。扩增程序为①94°C 2min②94°C 30s, 57°C 30s, 72°C lmin, 30 个循环(3) 72°C IOmin此PCR反应引物序列如下上游引物5，-ATGAAGCTGCTCGCAGCAACTGT-3，(SEQID NO 1)下游引物5，-TTATCACTGGGTGGCAGGCTGT-3，(SEQID NO 2)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察片段大小是否与预期结果吻合，确定是否 得到正确目的基因。(3)克隆载体的构建、转化与扩增回收PCR扩增的hApoA-II基因片段进行琼脂糖凝胶电泳分析。回收后，将 hApoA-II基因片段与T载体16°C连接30分钟。连接反应体系包括hApoA-II基因片段 0. 1 0. 3pmol ；T载体0. 03pmol ；溶液I (含DNA连接酶和连接缓冲液，见Takara公司T载 体试剂盒)5 μ 1 ；灭菌超纯水至终体积10 μ 1。按照常规方法，从37°C培养16小时的XL1-Blue阴性培养板上(不含抗生素的LB 琼脂平板)挑取单个菌落(直径2 3mm)，接种于含有100ml LB培养基的IL培养瓶中，以 制备感受态大肠杆菌细胞，并于-80°C冻存备用。取一份冻存的感受态细胞融化后，加入上述连接产物，进行常规转化。然后取 200 μ 1已转化的感受态细胞涂布于含X-Gal、IPTG ( 二者可在涂菌前半小时涂于LB琼脂平 板表面)和氨苄青霉素(100yg/ml)的LB琼脂平板上，37°C培养箱中培养12 16小时。(4)重组载体的鉴定随机挑取转化后的白色单菌落(“蓝白筛选”)，接种于含氨苄青霉素(100yg/ml) 的LB培养基中，37°C强烈震荡培养过夜，然后常规提取质粒DNA。取1 μ 1溶解的DNA沉淀 物进行琼脂糖凝胶电泳定量分析和酶切鉴定。37°C Xho I.EcoR I双酶消化2小时，1 %琼脂 糖凝胶电泳后根据内切酶谱鉴定正确克隆。挑选酶切鉴定正确的克隆，提取质粒，用于DNA 测序。实施例2 :hApoA-II毕赤酵母分泌型表达载体pPICZa/hApoA-II的构建和宿主细 胞转化取上述测序鉴定正确的携带hApoA-II基因的质粒50ng，按上述比例在0. 2ml EP 管中建立PCR反应体系。利用上述PCR反应体系和条件，借助上游引物5’-AACCTCGAGAAGAG ACAGGCAAAGGAGCCATGT-3’ (SEQ ID NO 3)引入酵母a因子信号肽的部分序列和XhoI位点， 并利用下游引物5，-GCGTCTAGATCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3，(SEQ ID NO 4)引入 EcoR I 位点。PCR引入上述序列和酶切位点后，回收目的片段。用相应酶切后，连入用同样酶切后 的质粒pPICZa，构建毕赤酵母表达载体pPICZa/hApoA-II，然后转化大肠杆菌，提取质粒并 进行酶切鉴定和DNA序列测定分析。取测序正确的培养菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA并用琼脂糖凝胶 电泳法进行定量分析。取10 15 μ g pPICZa/hApoA-II重组质粒经SacI酶消化(线性 化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用10 μ 1超纯水溶解后置冰上备用。从毕赤酵母Χ-33的YPD阴性培养板上(不含抗生素的YPD琼脂平板)挑取单个菌落，接种于5ml YPD培养基中，250rpm，3(TC震荡培养8小时，以常规方法制备酵母感受态 细胞。然后取80 μ 1上述感受态菌，与10 15 μ g线性化的重组表达质粒混合，移入 0. 2cm电转化杯内进行电转化。取50 100 μ 1转化后的菌液涂布于含Zeocin (100 μ g/ml) 的YPD平板上，30°C培养箱培养2 3天，观察转化子的生长状况。然后用PCR方法筛选转化酵母菌。离心回收菌体后，提取酵母基因组DNA并进行 PCR鉴定，鉴定结果如附图1所示。实施例3 =ApoA-II多肽的表达和纯化(1)重组人载脂蛋白A-II(rhApoA-II)的表达取上述鉴定结果阳性的克隆接种IOml BMGY(pH6.0)培养基中，30°C震荡培养24 小时，至0D_达到2. 0 6. 0时收集细胞。用等体积(IOml)BMMY(pH6. 0)重悬细胞沉淀， 30°C震荡培养，诱导表达。诱导过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5%，同时补充 灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变。在培养的第0、24、48、72、96、120、144、168小时等 时间点各取0. 5ml发酵液，离心取上清用于蛋白质分析(SDS-PAGE，N-端氨基酸序列分析
寸乂 O(2) rhApoA-II 的纯化发酵液经高速大容量离心机(5000r/min)连续离心分离发酵液上清。上清经 SPSepharose XL阳离子柱层析(缓冲液为20mmol · L—1 HAc-NaAc缓冲液，洗脱液为含 0. 5mol · L-1NaCl 的 20mmol · Γ1 HAc-NaAc 缓冲液)和 Source 30RPC 反相疏水柱层析(洗 脱液为含0. 1% TFA的50%甲醇)后用升降恒温浴锅37°C减压蒸馏甲醇洗脱液，脱甲醇浓 缩，获得纯化的rhApoA-II。SDS-PAGE分析结果显示，如此纯化的rhApoA_II至少达到电泳纯，且产物的的收 率和纯度分别达到约68%和94. 3% (参见附图2)。实施例4 =ApoA-II多肽的理化性质鉴定(I)Tricine-SDS-PAGE 分析用Tricine-SDS-PAGE进行蛋白质分子量的测定和粗略定量分析。方法如下1)制胶按如下比例灌制分离胶和浓缩胶。
0097]①15%分离胶的配制
0098]超纯水0. 34ml
0099]30% 丙烯酰胺4.7ml
0100]3. Omol · L^1Tris-HCl (ρΗ8· 45)3. Oml
0101]甘油0.95ml
0102]10% 过硫酸铵0.03ml
0103]TEMED0. 006ml
0104]②浓缩胶的配制
0105]超纯水3. 12ml
0106]30% 丙烯酰胺0.64ml
0107]3mol · L^1Tris-HCl (ρΗ8· 45)1. 24ml
0108]10% 过硫酸铵0.03ml
9
TEMED0.006ml2)分别取2处、4811、7211、9611、12011培养上清按4 1比例加入5XSDS样品缓冲 液，混勻后，煮沸5min。3)取出上述样品，冷却至室温后，离心(10000r/min)30S，取上清每孔加样50μ 1。4)50V电泳至浓缩胶与分离胶交界处，调整电压到100V，恒压电泳分离。5)考马斯亮蓝染色、脱色后，观察分析结果。(2)表达产物的氨基酸序列分析蛋白质的一级结构是其高级结构的基础，用基因重组技术表达分泌型蛋白时，表 达的异源蛋白在加工成熟过程中容易出现信号肽错误切割现象，继而影响表达蛋白的高级 结构和生物活性的发挥。因此，在SDS-PAGE确定分子量正确的情况下，应对所表达的重组 蛋白进行蛋白质N-末端的氨基酸序列测定，以确定其一级结构的正确性。测序结果表明， 按照本发明方法制备的重组人载脂蛋白A-II具有与野生型载脂蛋白A-II完全相同的氨基 酸序列。实施例5 :rhApoA-II发酵最佳pH的确定毕赤酵母对培养基的pH适应范围很广，在pH 3. 0 6. 0都能很好地生长，但是 在发酵表达外源蛋白的过程中，发酵液PH对外源蛋白的表达有很大的影响，在大规模发 酵细胞高密度培养时尤为明显。因此，在进行大规模发酵前，在摇床水平进行了发酵表达 rhApoA-II的pH优化，为rhApoA-II的大规模发酵表达提供必要参数。选取表达量高的rhApoA-II毕赤酵母工程菌接种于IOml YPD培养基中，30°C、 250r/min震荡培养24 36h。取上述培养的菌液Iml接种于100ml BMGY培养基中30°C、 250r/min震荡培养24 36h。分别取上述菌液IOml置于50ml离心管中，室温离心(3000r/ min) IOmin,弃上清。各管分别加入未加缓冲液的BMMY 9ml，加入Imol · L^1Na2HPO4和 0. 5mol · Γ1柠檬酸配制成不同pH的BMMY诱导表达(hApoA-II工程菌分别在pH为3. 2、 3. 6,4. 0,4. 4,4. 8,5. 2,5. 6,6. 0,6. 5的条件下诱导表达，确定rhApoA-II发酵的最适pH)， 30°C,250r/min震荡培养，诱导过程中每24h补充甲醇至终浓度为0. 5%，同时补充灭菌去 离子水，使发酵液总体积保持不变。在培养72、96、120、144、168小时等时间点各取0. 5ml 发酵液，离心取上清进行蛋白质定量分析(Tricine-SDS-PAGE法)。结果显示在pH低于4.0的发酵液上清中，几乎检测不到rhApoA-II ；在pH值 6. 0 6. 5条件下，rhApoA-II表达量最高，确定pH 6. 0为rhApoA-II发酵的最佳pH条件 (参见附图3)。序列表<110>吉林圣元科技有限责任公司<120> 一种新的载脂蛋白A-II的制备<140><141><160>4<210>1<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>1ATGAAGCTGC TCGCAGCAAC TGT<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>2TTATCACTGG GTGGCAGGCT GT<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。<400>3AACCTCGAGAAGAGACAGGC AAAGGAGCCA TGT<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。<400>4ATTGAATTCT CACTGGGTGG CAGGCTGTGT TCC
权利要求
一种使用甲基营养酵母生产重组人载脂蛋白A II多肽的方法，该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作连接的元件的DNA构建体转化的(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码人载脂蛋白A II的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而以至少50mg/L培养基的浓度得到重组人载脂蛋白A II多肽。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的 甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵AOXl基因。
3.根据权利要求1的方法，用于表达重组人载脂蛋白A-II的甲基营养酵母能够依靠作 为碳源和能源的甲醇生长，并且该酵母是被包括甲基可诱导的转录启动子、编码人载脂蛋 白A-II的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。
4.用于在甲基营养酵母中表达重组人载脂蛋白A-II的DNA构建体，该构建体包括可操 作连接的元件甲基可诱导的转录启动子、编码人载脂蛋白A-II的DNA片段、转录终止子和 可选择标志。
5.根据权利要求4的构建体，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且甲基 可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOXl基因。
6.纯化载脂蛋白A-II的方法，特征在于依次使用阳离子交换层析和疏水层析技术分罔ο
全文摘要
本发明涉及重组蛋白质及其生产、纯化、鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达重组人载脂蛋白A-II(rhApoA-II)，以及优化的高密度发酵生产和纯化重组人载脂蛋白A-II的方法。
文档编号C07K1/20GK101928723SQ20091006715
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月22日 优先权日2009年6月22日
发明者苏曼曼, 颜炜群 申请人:吉林圣元科技有限责任公司