专利名称：两根Arg-Gly-Asp-Val链通过Lys与一根脂肪醇链的偶联物、它们的合成及在医学中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽-脂肪醇偶联物，尤其涉及饱和脂肪醇CH3(CH2)nCH2OHfc = 6,8, 10，12)与Arg-Gly-ASp-Val-LyS(Arg-Gly-ASp-Val)的羧端偶联而得的偶联物，本发明还 涉及该偶联物的合成方法以及该偶联物作为抗血栓剂、药物载体或药物制剂材料的应用， 属于生物医药领域。
背景技术：
在未来的5年到10年基因治疗会有可把基因传送至细胞的理想载体。从生物制 剂的立场看，基因转导系统就是药物释放系统(DDS)。有多种化学合成的小分子构建的基因 转导系统受到关注，其中阳离子脂质构成的基因转导系统是关注热点。阳离子脂质在药学 领域遍用于构建脂质体运载小分子(包括多肽)药物。与在DDS中一样，在基因转导系统 中阳离子脂质体有明显好处，例如可通过电荷吸附与DNA形成复合物并有效避免被细胞内 溶酶体降解、可将DNA高效导入细胞、对DNA的尺寸没有限制、操作简便等。阳离子脂质的
基本构造如下，包括高级脂肪链构成的疏水臂和亲水的阳离子头。 阳离子脂质的基本构造细胞黏附在细胞黏附性疾病(癌转移、血栓形成、化学致炎和骨质疏松)的发展过 程中起关键作用。调节性糖蛋无例如RGD肽与整合素受体有很强的结合能力，可参与细胞 黏附过程。例如RGD肽与血小板、肿瘤细胞及骨基表面的GP Ilb/IIIa受体特异性结合可 干预血栓、癌转移和骨质疏松的发展过程。RGD肽的这种作用赋予了含RGD序列的化合物一 种重要性质，即含RGD序列的化合物可以向血栓、癌转移和骨质疏松的患病部位富集。在这 样一个前提下，把RGD肽与高级脂肪链偶联，便可以获得我们期待的偶联物。
发明内容
本发明目的之一是提供一类多肽_脂肪醇偶联物。本发明目的之二是提供一种合成上述多肽_脂肪醇偶联物的方法。本发明目的是通过以下技术方案来实现的两根Arg-Gly-Asp-Val链通过Lys与一根脂肪醇链的偶联物，该偶联物的通式为 Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)nCH3,其中 η = 6，8，10 或 12。一种上述多肽-脂肪醇偶联物的方法，包括
(1)合成 Arg-Gly-Asp-Val-Lys(Arg-Gly-Asp-Val)；(2)将 CH3 (CH2)nCH2OH 分别与保护基保护的 Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val)的羧端偶联，脱去保护基，即得；其中，η = 6,8,10或12。本发明结合了下述认识或依据完成了上述技术方案把基因传送至细胞的理想载 体(基因转导系统)是基因治疗的关键任务之一；从生物制剂的立场看基因转导系统与药 物释放系统(DDS)具有等同性；虽然有多种化学合成的小分子构建的基因转导系统都受到 关注但是阳离子脂质构成的基因转导系统应格外给予关注；阳离子脂质体可通过电荷吸附 与DNA形成复合物并有效避免被细胞内溶酶体降解；阳离子脂质体可将DNA高效导入细胞、 阳离子脂质体对DNA的尺寸没有限制；血小板、炎症组织、癌细胞和骨基质表明富含可识别 RGD序列的细胞黏附受体，含RGD序列的化合物可以向血栓、炎症、癌转移和骨质疏松的患 病部位富集。本发明人基于上述认识，把饱和脂肪醇CH3(CH2)nCH2OHfc = 6,8,10，12)，与Arg-G Iy-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val)肽的羧端偶联，使制得的分子获得四种性能，即依赖于 饱和脂肪醇CH3(CH2)nCH2OHfc = 6,8,10，12)烷基链的疏水性、依赖于RGD的胍基和α -氨 基质子化形成的阳离子性质和亲水性和依赖于RGD肽对GP Ilb/IIIa受体特异亲和作用获 得的靶向性。这样一来，RGD肽与饱和脂肪醇CH3 (CH2)nCH2OH(η = 6,8,10,12)偶联制得的 分子便成为我们所期待的偶联物。在大鼠血栓形成模型上的评价表明，本发明偶联物具有优秀的口服抗血栓活性， 可作为抗血栓剂应用；在水相检测了本发明偶联物自组装成为纳米颗粒的性能，试验结果 表明，本发明偶联物具有优秀的自组装性能，可作为制备微乳、脂质体等的制剂材料。由于 本发明偶联物的抗血栓活性来自R⑶肽对GP Ilb/IIIa受体特异亲和作用，所以这种抗血 栓活性又表征了本发明偶联物的靶向性，所以本发明偶联物可作为靶向制剂材料。本发明的又一目的是提供一种含有本发明偶联物的药物组合物，该药物组合物由 治疗上有效剂量的本发明偶联物与药学上可接受的赋型剂或者辅加剂组成；即将有效量 的本发明偶联物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制 备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他 的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等液体制剂 形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0. -99%重量，优选10-60%重 量的本发明偶联物。
图1本发明偶联物的合成路线图；i)DCC、HOBt, NMM ；ii)氯化氢/乙酸乙酯溶液 (4N) ；iii)5%钯碳和氢气。图2由透射电镜描述的本发明代表性化合物在水相组装的纳米球。图3由扫描电镜描述的本发明代表性化合物组装的纳米球。
具体实施例方式为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例 IArg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 12CH3 (9a)的制备l)Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制备将1. 674g(5. 25mmol) Boc-Arg (NO2)溶于 IOml 无水 DMF，加入适量 THF，力口 入
0.675g(5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，使其完全溶解。冰浴下加入1. 071g (6mmol) 二 环己基羰二亚胺(DCC)，直至有无色D⑶析出，得到反应液(I)，待用。称取0. 86g(5. Ommol) Gly-OBzl，WA IOml无水DMF溶解，用N-甲基吗啉(NMM)调pH 8-9，得到反应液(II)，待 用。将反应液(II)加入反应液(I)中，先冰浴下搅拌lh，再室温搅拌12h，TLC(氯仿/甲 醇，10 1)显示Boc-Arg(NO2)消失。滤除二环己基脲(D⑶)，吹干DMF。残留物用乙酸乙 酯溶解，依次用5% NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液、5% KHSO4水溶液和饱和NaCl水溶液 洗。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到1.956g(80% )目标化 合物，为淡黄色固体。ESI-MS (m/z) 489 [M+Na] +。2) Boc-Arg (NO2) -Gly 的制备将0. 466g(l. Ommol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 溶于 IOml 甲醇，冰浴下用 2N NaOH水 溶液调约PH12，搅2h，TLC (氯仿/甲醇，1 1)显示B0c-Arg(NO2)-Gly-OBzl消失。反应 液用饱和KHSO4水溶液调pH7，减压浓缩除甲醇。反应液用饱和KHSO4水溶液调pH2 3，用 乙酸乙酯萃取(30ml X 3)。合并有机相，用饱和NaCl水溶液洗至中性，无水Na2SO4干燥。过 滤，滤液减压浓缩至干，得0.3g(80%)目标化合物，为淡黄色固体。ESI-MS (m/z) 375 [M-H]+。 [a]o=-2.16(c=l, CH3OH) ο3) Boc-Lys (Boc)-OCH2-(CH2)12CH3 (la)的制备按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 1. 817g(5. 25mmol)Boc-Lys (Boc)和
1.07g(5mmol)CH3(CH2)12CH2OH 制得 2. 71g(100% )目标化合物，为无色油状物。ESI_MS(m/ z)543[M+H]+。[a]o=-16.73(c=l, CH3OH)οMp 29. 8-31. 6°C .4) Lys-OCH2-(CH2)12CH3 (2a)的制备将0. 542g (Immol) Boc-Lys (Boc) -OCH2- (CH2) 13CH3 溶解在 IOml 4mol/L 氯化氢-乙 酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC (氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失，减压浓缩抽干， 残留物反复加乙酸乙酯和乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后得到0.415g(99%)目 标化合物，为无色油状物，直接用于下一步反应。ESI-MS (m/z) 343 [M+H] +5) Boc-Val-Lys (Boc-Val)-OCH2-(CH2)12CH3 (3a)的制备按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 2. 278g(10. 5mmol)Boc-Val 和
2.075g(5. Ommol)Lys-OCH2-(CH2)12CH3 制得 3. 700g(99 % )标题化合物，为无色类固体。 ESI-MS(m/z)763[M+Na]+6) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)12CH3 (4a)的制备按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制备方法，从 0. 740g(l. Ommol)Boc-Val-Lys (Boc-Val )-OCH2-(CH2)12CH3 制得 0.613g (99% )标题化合物，为无色类固体。ESI-MS (m/z) 541 [M+H] +7) Boc-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Asp (OBzl) -ValJ-OCH2- (CH2) 12CH3 (5a)的制备按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 1. 357g(4. 2mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 226g(2. Ommol) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)12CH3 制得 1. 610(70% )标题化合物，为无色固 体。ESI-MS(m/z) 1173[M+Na]+。[c^0=-26.00(c=l, CH3OH)0Mp :136· 1 137. 7°C ·8) Asp (OBzl) -Val-Lys [Asp (OBzl) -ValJ-OCH2- (CH2) 12CH3 (6a)的制备
按照Lys-OCH2-(CH2)12CH3 的制备方法，从 1. 15g(l. Ommol)Boc-Asp (OBzl)-Val-Lys[Boc-Asp(OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)12CH3 制得 0. 91g(89% )标题化合物，为无色固体。 ESI-MS(m/z)951[M+H]+9) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -ValJ-O CH2-(CH2)12CH3 (7a)的制备按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 0. 79g(2. lmmol)Boc-Arg(N02)-Gly 禾口 1. 023g(l. Ommol)Asp (OBzl)-Val-Lys [Asp (OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)12CH3 制得 0. 666g(40 % )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z) 1689[M+Na]+。二-18.73(c=l， CH3OH), Mp :130. 8 131. 4°C。10) (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)12CH3 (8a)的 制备0. 333g(0. 2mmol) Boc-Arg (NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Val-Lys [Boc-Arg (NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Vall-OCH2-(CH2)12CH3用甲醇溶解，加入Pd/C适量，反应体系保持密闭，通入氢气反 复置换反应体系中的空气，保持氢气室温搅拌。反应不再吸氢后TLC检测反应进程。反应 完毕后，常压过滤去除Pd/C，滤液减压浓缩旋干，并用乙醚反复研磨得得0. 270g(97% )标 题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/z) 1397 [M+H] +11) Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 12CH3 (9a)的制备按照Lys-OCH2- (CH2) 12CH3 的制备方法，从 0. 279g (2. Ommol) (Boc-Arg-Gly-Asp-Va 1)-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)12CH3 制得 0. 239g(99% )标题化合物，为无色固
体。[ ]d=.23.53(c=1, ch30h)0 esi-ms (m/z) 1197 [m+h]mp :208 209°c。实施例2Arg-Gly-Asp-Val_Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 10CH3 (9b)的制备l)Boc-Lys (Boc)-OCH2-(CH2)ltlCH3 (lb)的制备按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 1. 817g(5. 25mmol)Boc-Lys (Boc)和
0.93g(5mmol)CH3(CH2)ltlCH2OH 制得 2. 570g(99% )目标化合物，为无色油状物。ESI_MS(m/ ζ) 537 [M+Na]+。[α^=-9.20(c=l, CH3OH)2) Lys-OCH2-(CH2)10CH3 (2b)的制备按照Lys-OCH2-(CH2)12CH3 的制备方法从 0. 5 14g (Immo 1) Boc-Lys (Boc)-OCH2-(CH2)ltlCH3制得0. 387g(99% )目标化合物，为无色油状物，直接用于下 一步反应。ESI-MS (m/z) 315 [M+H] +3) Boc-Val-Lys (Boc-Val)-OCH2-(CH2)ltlCH3 (3b)的制备按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 2. 278g(10. 5mmol)Boc-Val 和
1.935g(5. Ommol)Lys-OCH2-(CH2)ltlCH3 制得 3. 560g(99 % )标题化合物，为无色类固体。 ESI-MS(m/z)735[M+Na]+4) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)ltlCH3 (4b)的制备按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制备方法,从 0. 712g(l. Ommol)Boc-Val-Lys (Boc-Val )-OCH2-(CH2)ltlCH3 制得 0. 585g (99% )标题化合物，为无色类固体。ESI-MS (m/z) 513 [M+H] +5) Boc-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Asp (OBzl) -ValJ-OCH2- (CH2) 10CH3 (5b)的制备按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 1. 357g(4. 2mmol) Boc-Asp (OBzl)和
61. 170g(2. Ommol) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)ltlCH3 制得 1. 683(75% )标题化合物，为无色固 体。ESI-MS(m/z)l 144[M+Na]+。[a]^= -34.83(c=l, CH3OH)。Mp 140 142°C6) Asp (OBzl) -Val-Lys [Asp (OBzl) -ValJ-OCH2 (CH2) 10CH3 (6b)的制备按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制备方法，从 1. 122g(l. Ommol)Boc-Asp (OBzl) -Val -Lys[Boc-Asp(OBzl)-Val]-OCH2(CH2)ltlCH3 制得 0. 990g(99% )标题化合物，为无色固体。 ESI-MS(m/z)923[M+H]+7) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -ValJ-O CH2-(CH2)10CH3 (7b)的制备按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 0. 79g(2. lmmol)Boc-Arg(N02)-Gly 禾口 0. 995g(l. Ommol) Asp (OBzl)-Val-Lys [Asp (OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)10CH3 制得 0. 737g(45 % )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z) 1661 [M+Na]+。[a]g=-34.56(c=l’ CH3OH)。Mp 132 134°C。8) Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)ltlCH3 (8b)的制 备按照Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys(Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)12CH3 的制 备方法由 O. 328g(0. 2mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Val-Lys (Boc-Arg(NO2)-Gly-As ρ (OBzl) -Val) -OCH2- (CH2) 10CH3 制得 0. 260g(95% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/ ζ)1367[Μ-Η]+ 9) Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 10CH3 (9b)的制备按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制备方法，从 0. 274g(0. 2mmol)Boc-Arg-Gly-Asp-Va I-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 10CH3 制得 0. 220g(94% )标题化合物，为无色固 体。ESI-MS (m/z) 1168 [M+H]+。[c^0=-22.20(c=l，CH3OH)。Mp :209 211°C。实施例3Arg-Gly-Asp-Val_Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 8CH3 (9c)的制备l)Boc-Lys (Boc)-OCH2-(CH2)8CH3 (Ic)的制备按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 1. 817g(5. 25mmol)Boc-Lys (Boc)和
0.79g(5mmol)CH3(CH2)6CH2OH 制得 2. 430g(100% )目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/ ζ) 509 [M+Na]+。[a]^0=-12.33(c=l, CH3OH)2) Lys-OCH2-(CH2)8CH3 (2c)的制备按照Lys-OCH2-(CH2)12CH3 的制备方法由 0. 486 g (Immo 1) Boc-Lys (Boc) -OCH2- (CH2) 8CH3制得0359g (99 % )目标化合物，为无色油状物，直接用于下一 步反应。ESI-MS (m/z) 287 [M+H] +3) Boc-Val-Lys (Boc-Val)-OCH2-(CH2)8CH3 (3c)的制备按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 2. 278g(10. 5mmol)Boc-Val 和
1.795g(5. Ommol) Lys-OCH2-(CH2)8CH3 制得 3. 420g(99 % )标题化合物，为无色油状物。 ESI-MS(m/z)685[M+H]+4) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)8CH3 (4c)的制备按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制备方法,从 0. 684g(l. Ommol)Boc-Val-Lys (Boc-Val )-OCH2-(CH2)8CH3 制得 0. 557g(100% )标题化合物，为无色类固体。ESI-MS (m/z) 585 [M+H] +5) Boc-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Asp (OBzl) -Val]-OCH2- (CH2) 8CH3 (5c)的制备
按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 1. 357g(4. 2mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 114g(2. Ommol) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)8CH3 制得 1. 706(78% )标题化合物，为无色固 体。ESI-MS(m/z) 1116[M+Na]+0 [a]^0=-30.43(c=l, CH3OH)οMp 118 119°C ·6) Asp (OBzl) -Val-Lys [Asp (OBzl) -ValJ-OCH2- (CH2) 8CH3 (6c)的制备按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制备方法，从 1. 094g(l. Ommol)Boc-Asp (OBzl) -Val -Lys [Boc-Asp(OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)8CH3 制得 0. 87g(90% )标题化合物，为无色固体。 ESI-MS(m/z)895[M+H]+7) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -ValJ-O CH2-(CH2)8CH3 (7c)的制备按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 0. 79g(2. lmmol)Boc-Arg(NO2)-Gly 和 0. 967g(l. OmmoDAsp (OBzl)-Val-Lys [Asp (OBzl) -Val]-OCH2-(CH2)8CH3 制得 0. 837g(52% ) 标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/z) 1632 [M+Na] + D=-26.57(c=l, CH3OH)οMp :128 130°C。8) Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)8CH3 (8c)的制 备按照Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys(Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)12CH3 的制 备方法由 0. 322g(0. 2mmol) Boc-Arg (NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Val-Lys [Boc-Arg (NO2)-Gly-A sp(OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)8CH3 制得 0.260g(97% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/ ζ)1339[Μ-Η]+9) Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 8CH3 (9c)的制备按照Lys-OCH2-(CH2) 12CH3 的制备方法，从 0. 268g(0. 2mmol) Boc-Arg-Gly-Asp-Val -Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 8CH3 制得 0. 22g(96% )标题化合物，为无色固体。 ESI-MS (m/z) 1141 [M+H]+。[a]^°=-24.70(c=l, CH3OH)。Mp :203 205°C。实施例4Arg-Gly-Asp-Val_Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 6CH3 (9d)的制备l)Boc-Lys (Boc)-OCH2-(CH2)6CH3 (Id)的制备按照Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 的制备方法由 1. 817g(5. 25mmol)Boc-Lys (Boc)和 0. 65g(5mmol) CH3(CH2)6CH2OH 制得 2. 290g(99% )目标化合物，为无色油状物。ESI-MS (m/ z)459[M+Na]+。[α]^=-12.33(c=l，CH3OH).2) Lys-OCH2- (CH2) 6CH3 (2d)的制备按照Lys-OCH2-(CH2)12CH3 的制备方法由 0. 459 g (Immo 1) Boc-Lys (Boc) -OCH2- (CH2) 6CH3制得0359g(99% )目标化合物，为无色油状物，直接用于下 一步反应。ESI-MS (m/z) 260 [M+H]+.3) Boc-Val-Lys (Boc-Val)-OCH2-(CH2)6CH3 (3d)的制备按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制备方法，以 1. 085g (5mmol) Boc-Val 和 0. 794g(2. 4mmol) Lys-OCH2-(CH2)6CH3为原料，得到 1. 36g(86. 4% )标题化合物，为无色类固 体。ESI-MS(m/z)658[Μ+Η]+。[α] =-17.48 (c=0.9,CHC13)o4) Val-Lys (Val) -OCH2 (CH2) 6CH3 (4d)的制备按照制备Lys-OCH2- (CH2) 12CH3 的制备方法，以 0. 657g (1. Ommol) Boc-Val-Lys (Boc -VaD-OCH2-(CH2)6CH3 为原料，得到标题化合物。ESI-MS (m/z) 458 [M+H] +
5) Boc-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Asp (OBzl) -Val]-OCH2- (CH2) 6CH3 (5d)的制备按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制备方法，以 1. 615g (5mmol) Boc-Asp (OBzl)和
1.27g(2. 4mmol) Val-Lys (Val)-OCH2-(CH2)6CH3 为原料，得到 2. 12g(82. 8% )目标化合物 ESI-MS (m/z) 1090 [M+Na]+。-31.58(c=1.05，,CHCl3)ο Mp :130_131°C ·6) Asp (OBzl) -Val-Lys [Asp (OBzl) -Val] -OCH2 (CH2) 6CH3 (6d)的制备按照制备Lys-OCH2-(CH2)12CH3 方法，以 1. 066g(l. Ommol Boc-Asp (OBzl)-Val-Lys [Boc-Asp (OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)6CH3 为原料，得到标题化合物。ESI-MS(m/z) 1067[M+H] +7) Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -Val-Lys [Boc-Arg (NO2) -Gly-Asp (OBzl) -ValJ-O CH2-(CH2) 6CH3(7d)的制备按照Boc-Arg (NO2)-Gly-OBzl 的制备方法，以 1. 88g (5謹ol) Boc-Arg (NO2)-Gly 和
2.558(2. 4mmol)Asp (OBzl)-Val-Lys [Asp (OBzl) -Val]-OCH2-(CH2)6CH3 为原料，得到标题化 合物，为无色固体。ESI-MS(m/z) 1313[M+H] +。[af°= -19.42(c=l.l,CH3OH)。Mp :137_138°C。8) Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2) 6CH3(8d)的制 备按照Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Lys(Boc-Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)6CH3 的制 备方法，以 0. 131g(0. lmmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp (OBz 1)-Val-Lys [Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Val]-OCH2-(CH2)6CH3 为原料，得到 0. 104g(0. lmmol)标题化合物，无色固体。 ESI-MS (m/z) 1041 [M-H]+·9) Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 6CH3 (9d)的制备按照Lys-O-CH2-(CH2)12CH3 的制备方法，以 0. 104g(0. lmmol)Boc-Arg-Gly-Asp-V al-Lys (Boc-Arg-Gly-Asp-Val) -OCH2- (CH2) 6CH3为原料，得到目标化合物，无色固体粉末。 ESI-MS (m/z) 914 [M+H]+。[af°= -23.29(c=0.75, CH3OH)ο Μ. ρ 150_151°C。试验例1本发明化合物口服给药的抗血栓活性试验1)大鼠手术与器械wistar大鼠(雄性，190 210g)，按lnmol .kg—1剂量口服本发明的化合物，30min 后按UOOmg-kg—1剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动 脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血 钳夹紧，准备在远心端插管。2)插管插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段，中段为聚乙烯胶管，长60. Omm,内径
3.5mm ；两端为相同的聚乙烯管，管长100. Omm,内径1. Omm，外径2. Omm该管的一端拉成尖管 (用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0mm。将编好号的5mLEP管中分别装入6cm长的 黑色手术线，称重；然后取出丝线，按照编号放入准备好的插管的中段较粗的插管中。打开大鼠右侧动脉夹，用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液 (50IU · kg—1)，然后将插管的动脉端插入大鼠右侧颈总动脉，将计算量的肝素缓缓注入大鼠 体内。3)给药溶液药品生理盐水(3ml .kg—1，口服给予)、阿斯匹林(剂量为剂量为60mg/15mL，3Ml/ kg, 口服给予)的生理盐水溶液、本发明化合物(剂量为lnmol/kg，口服给予)的生理盐水溶液。4)血栓称重计时开始15分钟后，剪断动静脉插管，停止循环，用眼科镊小心取出丝线，在滤纸 上轻轻蘸掉血滴，放入事先称重好的5mLEP管中，精确称重并记录。计算出血栓的湿重。每 个药品重复12次给药。统计各组的血栓湿重(〒士SD)，并做t检验。5)结果经口服给药，本发明的化合物都具有很好的抗栓活性。结果列入表1。表1本发明化合物经静脉给药的抗血栓活性
化合物(lnmol/kg)血栓湿重(I±SDmg)
NS32.74士 2.83
Aspirin14.28 士 2.90a η = 10 ;NS =生理盐水 a.与 NS 相比，P < 0· 01。b 与 aspirin 相比，ρ < 0· 05，试验例2本发明化合物9a 口服给药的量效关系1)大鼠手术与器械wistar 大鼠(雄性，190 210g)，按 lnmol .kg-1，。· lnmol .kg-1 禾口 0. Olnmol .kg-1 剂量口服9a，30min后按UOOmg-kg—1剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位 固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的 手术线于皮毛用止血钳夹紧，准备在远心端插管。2)插管插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段，中段为聚乙烯胶管，长60. Omm,内径 3. 5mm ；两端为相同的聚乙烯管，管长100. Omm,内径1. Omm，外径2. Omm该管的一端拉成尖管 (用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0mm。将编好号的5mLEP管中分别装入6cm长的 黑色手术线，称重；然后取出丝线，按照编号放入准备好的插管的中段较粗的插管中。打开大鼠右侧动脉夹，用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液 (50IU · kg—1)，然后将插管的动脉端插入大鼠右侧颈总动脉，将计算量的肝素缓缓注入大鼠 体内。3)给药溶液药品将9a 按 Inmol · kg-1，。· lnmol · kg"1 和 0. Olnmol · kg"1 剂量配置生理盐水 溶液，供口服给药。4)血栓称重计时开始15分钟后，剪断动静脉插管，停止循环，用眼科镊小心取出丝线，在滤纸 上轻轻蘸掉血滴，放入事先称重好的5mLEP管中，精确称重并记录。计算出血栓的湿重。每个药品重复11次给药。统计各组的血栓湿重(JT 士SD)，并做t检验。5)结果经口服给药，在Inmol · kg^O. Inmol · kg"1 和 0. Olnmol · kg"1 剂量下，9a 剂量依 赖地发挥抗血栓作用。结果列入表2。表2. 口服给予9a的量效关系
NS =生理盐水；a与NS相比，ρ < 0. 05 ；试验例3本发明化合物在水相中组装成为纳米球试验1)本发明4种偶联物按照10_3mOl/l的浓度配置成为水溶液，在激光纳米粒度仪 (Nano-ZS90)上连续测定8天，观察粒径大小及其稳定性，结果见表3。得到的数据表明，这 4种偶联物在水相中可以自组装成为稳定的纳米球，因而是优秀的微乳和脂质体药物的制 备材料。表3本发明的4种偶联物在水中自组装成为纳米球的粒径稳定性 2)按照透射电镜的测定要求，配置4种偶联物的水溶液，置于铜网上挥发干后测 定本发明的化合物在水相组装性质。结果表明，由这4种偶联物组装的纳米球在透射电镜 下主要呈球状。这里给出的是代表性化合物9a的透射电镜图(图2)3)按照扫描电镜的测定要求，配置4种偶联物的水溶液，冷冻干燥后测定本发明 的化合物的微观结构和粒径。结果表明，由这4种偶联物组装的纳米球在扫描电镜下可以 看到不同的形态。这里给出的是代表性化合物9a的扫描电镜图(图3)
权利要求
两根Arg Gly Asp Val链通过Lys与一根脂肪醇链的偶联物，该偶联物的通式为Arg Gly Asp Val Lys(Arg Gly Asp Val) OCH2 (CH2)nCH3，其中n＝6，8，10或12。
2.一种合成权利要求1所述偶联物的方法，包括(1)合成保护基保护的Arg-Gly-ASp-Val-LyS(Arg-Gly-ASp-Val)；(2)将CH3 (CH2)nCH2OH 分别与保护基保护的 Arg-Gly-Asp-Val-Lys (Arg-Gly-Asp-Val) 的羧端偶联，脱去保护基，即得；其中，η = 6,8,10或12。
3.—种抗血栓药物组合物，其特征在于由治疗或预防上有效量的权利要求1所述的 偶联物和药学上可接受的载体或辅料所组成。
4.权利要求1所述的偶联物在制备抗血栓药物中的用途。
5.权利要求1所述的偶联物在制备微乳或脂质体药物载体的制剂材料中的用途。
全文摘要
本发明公开了两根Arg-Gly-Asp-Val链通过Lys与一根脂肪醇链的偶联物、它们的合成及在医学中的应用。本发明偶联物的通式为Arg-Gly-Asp-Val-Lys(Arg-Gly-Asp-Val)-OCH2-(CH2)nCH3，其中n＝6，8，10或12。本发明偶联物除具有优秀的口服抗血栓活性外，还具有优秀的自组装性能，可作为制备微乳、脂质体等药物载体的制剂材料。
文档编号C07K7/06GK101906145SQ20091008519
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月3日 优先权日2009年6月3日
发明者张琴, 彭师奇, 赵明 申请人:首都医科大学