朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法

专利名称：朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法
技术领域：
本发明涉及一种提取纯化洋蓟素的方法，更具体地说，涉及一种从朝鲜蓟 叶中提取纯化洋蓟素的方法。
背景技术：
朝鲜蓟(CynamscolymusL.)为菊科菜蓟属多年生草本植物，别名洋蓟、 菜蓟、法国百合，原产于北非和地中海东端之间的地区，有几千年的种植历史。 朝鲜蓟具有很高的营养价值，是一种高档保健蔬菜，其叶含有洋蓟素、绿原酸 等具有保肝、护肝、降低胆固醇作用的天然活性成分。目前朝鲜蓟叶大多被当 作饲料或肥料使用，其洋蓟素的价值没有得到充分利用。研究表明朝鲜蓟叶中 洋蓟素的含量达到了 1%左右，因此研究开发朝鲜蓟叶中洋蓟素的提纯方法具 有重要意义。
洋蓟素(cynarin)化学名称1、 5-二咖啡酰奎宁酸。结晶体(稀醋酸)，味 甜。分子式及分子量分别为<:251124012和516.46，熔点为225 227。C，旋光度 |>]为-59°((;=2，甲醇)。微溶于冷水，较易溶于沸水中，溶于冰醋酸、醇类。其 分子结构式如下
洋蓟素具有抗氧化、保肝、护肝、降低胆固醇等多种生物活性，最重要的 是具有抗人体免疫缺损病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)活性。
4目前，已有多项关于朝鲜蓟叶中活性物质的提纯方法的发明专利；如发明 专利 一种提取绿原酸的方法(专利号200810102863.4)就涉及到了朝鲜蓟 中绿原酸的提纯方法。
但是，现有方法都不是专门针对朝鲜蓟中提取纯化洋蓟素。关于从朝鲜 蓟叶中提取洋蓟素的发明专利多是针对混合物质的提取，其中洋蓟素的含量不 高，并且易残留有害的有机溶剂。如发明专利号为03150268的中国发明专利 《朝鲜蓟天然抗氧化剂及其提取方法》中，将朝鲜蓟干粉通过索氏提取得到的 原提取液，分别进行氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的正丁醇相进行 SephadexLH-20柱层析分离，得到三个不同组分，再分别进行高压液相制备柱 分离，得到7种不同的天然抗氧化剂。该发明获得的7种不同的天然抗氧化剂 分别是1-咖啡酰奎宁酸(l-CA)， 3-咖啡酰奎宁酸(3-CA)，藤黄菌素-7-芸 香糖苷(LTR)， 1, 3-二咖啡酰奎宁酸(1， 3-DCA)， 1， 5-二咖啡酰奎宁酸(1， 5-DCA)， 3， 4-二咖啡酰奎宁酸(3， 4-DCA)， 3， 5-二咖啡酰奎宁酸(3， 5-DCA)。 发明专利号为20040234674的美国发明专利《Artichoke leaf extracts》用水或 80%甲醇作为提取溶剂，提取液浓縮到适当体积后，加适量的乙酸乙酯/正丁 醇进行萃取，获取有机的萃取相，萃取相浓縮干燥后后，获得富含11-20%的 咖啡酰奎宁酸类物质。

发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中没有专门方法从朝鲜蓟中 提纯洋蓟素的问题，提供一种从朝鲜蓟中提纯洋蓟素的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是提供一种朝鲜蓟中洋蓟素的 提纯方法，包括下列步骤
1) 将朝鲜蓟叶通过有机溶剂提取，所得提取液浓縮，通过水沉粗滤除杂 质，再进行微滤，获得透析液体；
2) 将步骤l)所得透析液体用酸调至pH值小于6，将其进行层析分离， 用乙醇液体进行洗脱获得含洋蓟素的洗脱液；
3) 将步骤2)获得的含洋蓟素的洗脱液浓縮后，于4-10'C下静置结晶，晶体离心分离得洋蓟素湿晶体，干燥后获得洋蓟素粗产品。
本发明所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，还包括步骤4):将所述步骤3) 获得的洋蓟素湿晶体重结晶获得洋蓟素产品。
本发明所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，所述步骤2)中，所述酸为盐 酸溶液或硫酸溶液；所述透析液体调至pH值为3-5。
本发明所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，所述步骤2)中，所述层析分 离的步骤包括，将步骤2)中调pH值后的透析液体通过大孔吸附树脂层析柱， 先用水洗至流出液无色，然后用体积百分比浓度为10-18%的乙醇溶液洗脱层 析柱，回收得含多酚的洗脱液;再用体积百分比浓度为50-70%的乙醇溶液洗 脱层析柱，回收得含洋蓟素的洗脱液。
本发明所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，所述步骤4)中，所述重结晶 步骤包括将步骤3)获得的洋蓟素湿晶体加水重新溶解，加入活性炭，搅拌 脱色后过滤，滤液于4-10'C下静置重结晶，晶体离心分离后干燥，获得洋蓟素
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本发明所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，所述步骤l)中，所述水沉粗 滤步骤包括将步骤l)中浓縮液加入水中，搅拌均匀后静置，水沉液体进行 过滤，下沉渣丢弃，获得过滤液。
本发明所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，所述步骤l)中，所述微滤过
程的微滤膜为无机膜，微滤膜的孔径为0.1-0.5pm。
本发明所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，所述步骤l)中，所述有机溶 剂为乙醇或丙酮，所述有机溶剂体积百分比浓度为50-70%。
本发明所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，所述步骤l)和步骤3)中， 所述浓縮过程的条件为温度60-70。C，压强50-300mmHg。
本发明所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，所述步骤3)和步骤4)中， 所述干燥过程的条件为温度60-70°C，压强10-50mmHg。
本发明的提纯方法使用挥发性强的乙醇或者丙酮作为提取剂，提取洋蓟 素，所得的产品中不会残留有害的有机溶剂。实施本发明获得的产品所含洋蓟 素纯度高，步骤4)获得的洋蓟素产品，洋蓟素含量可达80%以上；步骤3)获得的洋蓟素粗产品，洋蓟素含量为20%以上，可提供给有相应需求的客户。 本发明在提取过程中还可获得副产品，如步骤2)获得的多酚洗脱液可进一步 处理获得多酚类活性物质。本发明整体工艺操作简单，生产效率高，适合工业 化生产。


下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中
图1是本发明朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法的流程图。
具体实施例方式
如图1所示，本发明朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法的步骤为
1. 将采收的新鲜朝鲜蓟叶片切割成小段，用体积百分比浓度为50-70%的 有机溶剂在60-80°C的条件下回流提取2次，收集得到其提取液；
2. 将步骤1所得提取液减压浓縮，回收有机溶剂，获得浓缩液；
3. 所步骤2获得的浓縮液再加入相当于浓縮液体积5倍的水以进行水沉； 水沉液体用滤纸过滤获得过滤液，滤渣丢弃；
4. 将步骤3获得的过滤液体用孔径为0.1-0.5um的无机膜进行微滤处理， 去除溶液中的大分子蛋白、鞣质、果胶等杂质，获得清亮透明的无机膜透析液 体；
5. 将步骤4的无机膜透析液体用稀酸调pH至3-5之间，然后该液体通过 大孔吸附树脂为填料的层析柱，先用水洗至流出液无色，然后用体积百分比浓 度为10- 18%的乙醇溶液进行洗脱层析柱，回收含有极性比较弱的多酚洗脱液； 再用体积百分比浓度为50%-70%的乙醇溶液进行洗脱，回收含洋蓟素的洗脱 液；
6. 将步骤5所得含洋蓟素的洗脱液减压浓縮，浓縮液于4-l(TC下静置结晶， 晶体离心分离得洋蓟素湿晶体；洋蓟素湿晶体干燥得洋蓟素粗产品；
7. 将步骤6所得洋蓟素湿晶体加水溶解后加入活性炭，搅拌脱色后过滤， 滤液于4-l(TC下静置重结晶，晶体离心分离后干燥获得洋蓟素产品。本发明获得的洋蓟素粗产品和洋蓟素产品通过液相色谱仪检测分析其含 量，如附件l所示 附件l
1仪器与试剂 1.1仪器
Waters 1525高效液相色谱仪，Waters 2487双波长紫外检测器，
Waters 515泵，Sartorius BS11 OS电子天平
1.2药品与试剂
乙腈HPLC级，(中国医药集团上海化学试剂公司) 磷酸AR级，(广东汕头西陇化工厂) 超纯水Millipore公司
洋蓟素对照品(纯度95.0%):香港大学植物系王明福博士提供
2.实验方法与结果
2.1色谱条件
Waters symmetry C-18色谱柱(5[xm， 4.6x 150mm) 检测波长X=330nm
流速1.0mL/min，进样量10uL,柱温25 °C 流动相A:乙腈，流动相B:磷酸/水
表l: HPLC条件
时间(min)A%B%
0694
1694
203070
225050
24694
26694
表1为液相色谱仪工作时的条件，其中AX为液相色谱仪工作时流动相乙睛的 比例参数，BX为液相色谱仪工作时流动相磷酸/水的比例参数。实施例h
1. 将采收的朝鲜蓟新鲜叶片切割成5厘米左右的小段。称取1公斤该叶
片，加入5升体积百分浓度为58%的乙醇溶液，在75。C条件下搅拌提取2小 时，过滤后得第一次提取液。滤渣再加入4升体积百分浓度为58%的乙醇溶液， 在75'C条件下搅拌提取1小时，过滤后得第二次提取液。合并第一次和第二 次提取得到的提取液。
2. 将步骤1得到的提取液在65°C， 200mmHg压力条件下浓縮至相对密度 为1.2g/cm3 (在50-6(TC之间测定)的浓缩液。
3. 将步骤2得到的浓缩液加入相当于浓縮液体积5倍的水，搅拌混匀后静 置6小时，用中速滤纸过滤水沉液，滤渣丢弃，获得清亮的过滤液。
4. 将步骤3获得的过滤液用0.3pm无机膜进行微滤处理，去除液体中的大 分子蛋白、鞣质、果胶等杂质，获得清亮的无机膜透析液。
5. 将步骤4的无机膜透析液用稀盐酸调pH值到3.5,将该液体以2.5BV/ 小时的流速通过以AB-8大孔吸附树脂为填料的层析柱(层析柱直径5厘米， 高度50厘米)；然后用水以3BV/小时的流速洗至流出液无色；再用体积百分 比浓度为15%的乙醇溶液洗脱层析柱，洗脱速度为2BV/小时，收集得含有极 性比较弱的多酚洗脱液。最后用体积百分比浓度为60%的乙醇溶液洗脱层析 柱，洗脱速度为2BV/小时，收集得含有洋蓟素的洗脱液。
6. 将含有洋蓟素的洗脱液在65。C， 150mmHg压力条件下浓縮，浓縮至相 对密度为1.1g/cm3 (在50-6(TC之间测定)，然后将该浓縮液置于4-10'C下静置 结晶，晶体离心分离得洋蓟素湿晶体。将洋蓟素湿晶体于65°C，真空度低于 30mmHg的压力条件下干燥12个小时获得15克粗产品。改产品经HPLC检测 分析其洋蓟素含量为22.6%。
实施例2:
1.将采收的朝鲜蓟新鲜叶片切割成5厘米左右的小段。称取1公斤该叶片， 加入5升体积百分浓度为70%的乙醇溶液，在80'C条件下搅拌提取2小时， 过滤后得第一次提取液。滤渣再加入4升体积百分浓度为70%的乙醇溶液，在
98(TC条件下搅拌提取1小时，过滤后得第二次提取液。合并第一次和第二次提 取得到的提取液。
2. 将步骤1得到的提取液在60°C， 50mmHg压力条件下浓縮至相对密度为 1.2g/cm3 (在温度50-6(TC之间测定)的浓縮液。
3. 将步骤2得到的浓縮液加入相当于浓縮液体积5倍的水，搅拌混匀后静 置6小时，用中速滤纸过滤水沉液，滤渣丢弃。获得清亮的过滤液。
4. 将步骤3获得的过滤液用O.lpm无机膜进行微滤处理，去除液体中的大 分子蛋白、鞣质、果胶等杂质，获得清亮的无机膜透析液。
5. 将步骤4的无机膜透析液用稀硫酸调pH到3，将该液体以2.5BV/小时 的流速通过以AB-8大孔吸附树脂为填料的层析柱(层析柱直径5cm，高度 50cm);然后用水以3BV/小时的流速洗至流出液无色；再用体积百分比浓度 为10%的乙醇溶液洗脱层析柱，洗脱速度为2BV/小时，收集得含有极性比较 弱的多酚洗脱液。最后用体积百分比浓度为50%的乙醇溶液洗脱层析柱，洗脱 速度为2BV/小时，收集得含洋蓟素的洗脱液。
6. 将含有洋蓟素的洗脱液在6(TC， 50mmHg压力条件下浓縮，浓縮至相对 密度为1.1g/cr^(在50-6(TC之间测定)，然后将该浓縮液置于4'C下静置结晶， 晶体离心分离得洋蓟素湿晶体。
7. 将步骤6获得的洋蓟素湿晶体用5倍重量的水溶解，加入质量百分比为 1%的活性炭，搅拌脱色15分钟后过滤，滤液于l(TC下静置重结晶，晶体离心 分离，于60。C， 50mmHg压力条件下干燥12个小时，获得10克洋蓟素产品。 该产品经HPLC检测分析其洋蓟素含量为83.6%。
实施例3:
l.将采收的朝鲜蓟新鲜叶片切割成5厘米左右的小段，称取10公斤该叶 片加入50升体积百分比浓度为50%的丙酮溶液，在6(TC条件下搅拌提取2小 时，过滤后得第一次提取液。滤渣再加入40升体积百分浓度为50%的丙酮溶 液，在6(TC条件下搅拌提取1小时，过滤后得第二次提取液。合并第一次和 第二次提取得到的提取液。2. 将步骤1得到的提取液在70°C ， 300mmHg压力条件下浓縮至相对密度 为1.3g/cm3 (在50-6(TC之间测定)的浓縮液。
3. 将步骤2得到的浓縮液加入相当于浓縮液体积5倍的水，搅拌混匀后静 置6小时，用中速滤纸过滤水沉液，下沉渣丢弃。获得清亮的过滤液。
4. 将步骤3获得的过滤液用0.5pm无机膜进行微滤处理，去除液体中的大 分子蛋白、鞣质、果胶等杂质，获得清亮的无机膜透析液。
5. 将步骤4的无机膜透析液用稀硫酸调pH值到5，将该液体以2.5BV/小 时的流速通过以CAD-40大孔吸附树脂为填料的层析柱(层析柱直径15cm， 高度100cm)，然后用水以3BV/小时的流速洗至流出液无色，再用体积百分比 浓度为18%的乙醇溶液洗脱层析柱，洗脱速度为2BV/小时，收集得含有极性 比较弱的多酚洗脱液。最后用体积百分比浓度为70%的乙醇溶液洗脱层析柱， 洗脱速度为2BV/小时，收集得含洋蓟素的洗脱液。
6. 将步骤5获得的含洋蓟素的洗脱液在70°C ， 300mmHg的压力条件下浓 縮，浓縮至相对密度为1.2g/cm3 (在50-6(TC之间测定)，然后将该浓縮液置于 l(TC下静置结晶，晶体离心分离获得洋蓟素湿晶体。
7. 将步骤6获得的洋蓟素湿晶体用5倍重量的水溶解，加入质量百分比浓 度为1%的活性炭，搅拌脱色15分钟后过滤，滤液于4。C下静置重结晶，晶体 离心分离，于70°C， lOmmHg压力条件下干燥12个小时获得30克洋蓟素产 品。该产品经HPLC检测分析其洋蓟素含量为80.8%。
权利要求
1、一种朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，其特征在于，包括下列步骤1)将朝鲜蓟叶通过有机溶剂提取，所得提取液浓缩，通过水沉粗滤除杂质，再进行微滤，获得透析液体；2)将步骤1)所得透析液体用酸调至pH值小于6，将其进行层析分离，用乙醇液体进行洗脱获得含洋蓟素的洗脱液；3)将步骤2)获得的含洋蓟素的洗脱液浓缩后，于4-10℃下静置结晶，晶体离心分离得洋蓟素湿晶体，干燥后获得洋蓟素粗产品。
2、 根据权利要求1所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，其特征在于，还 包括步骤4):将所述步骤3)获得的洋蓟素湿晶体重结晶获得洋蓟素产品。
3、 根据权利要求1所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，其特征在于，所 述步骤2)中，所述酸为盐酸溶液或硫酸溶液；所述透析液体调至pH值为3-5。
4、 根据权利要求1所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，其特征在于，所 述步骤2)中，所述层析分离的步骤包括，将步骤2)中调pH值后的透析液 体通过大孔吸附树脂层析柱，先用水洗至流出液无色，然后用体积百分比浓度 为10-18%的乙醇溶液洗脱层析柱，回收得含多酚的洗脱液；再用体积百分比 浓度为50-70%的乙醇溶液洗脱层析柱，回收得含洋蓟素的洗脱液。
5、 根据权利要求2所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，其特征在于，所 述步骤4)中，所述重结晶步骤包括将步骤3)获得的洋蓟素湿晶体加水重 新溶解，加入活性炭，搅拌脱色后过滤，滤液于4-l(TC下静置重结晶，晶体离 心分离后干燥，获得洋蓟素产品。
6、 根据权利要求1所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，其特征在于，所 述步骤l)中，所述水沉粗滤步骤包括将步骤l)中浓縮液加入水中，搅拌 均匀后静置，水沉液体进行过滤，下沉渣丢弃，获得过滤液。
7、 根据权利要求1所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，其特征在于，所 述步骤l)中，所述微滤过程的微滤膜为无机膜，微滤膜的孔径为0.1-0.5pm。
8、 根据权利要求1所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，其特征在于，所述步骤l)中，所述有机溶剂为乙醇或丙酮，所述有机溶剂体积百分比浓度为50-70%。
9、 根据权利要求1所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，其特征在于，所 述步骤1)和步骤3)中，所述浓縮过程的条件为温度60-70°C，压强 50-300mmHg。
10、 根据权利要求2所述的朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法，其特征在于，所 述步骤3)和步骤4)中，所述干燥过程的条件为温度60-70。C，压强 10-50mmHg。
全文摘要
本发明提供一种朝鲜蓟中洋蓟素的提纯方法。本发明将朝鲜蓟叶通过乙醇或丙酮溶液提取，提取液浓缩后水沉过滤，再将滤液进行微滤处理；调节所得透析液pH值至小于6，通过大孔吸附树脂层析柱水洗分离，用体积百分比浓度为10-18％乙醇溶液洗脱层析柱，得含多酚洗脱液；用体积百分比浓度为50-70％的乙醇溶液洗脱层析柱，得含洋蓟素洗脱液；将含洋蓟素洗脱液浓缩结晶得洋蓟素湿晶体，干燥得洋蓟素粗产品；所得洋蓟素湿晶体重结晶后干燥得洋蓟素产品。实施本发明得到的洋蓟素产品所含洋蓟素纯度高，洋蓟素含量可达80％以上，而所得洋蓟素粗产品纯度亦达20％以上，可提供给有相应需求的客户。本发明工艺简单，适合工业化生产。
文档编号C07C67/00GK101560155SQ20091010732
公开日2009年10月21日 申请日期2009年5月13日 优先权日2009年5月13日
发明者冯建光, 张孝友 申请人:深圳劲创生物技术有限公司