专利名称：1,6-二磷酸果糖和氧化型维生素c的抗癫痫作用及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及1， 6- 二磷酸果糖(fructose-1， 6-bisphosphate ， Fl, 6BP)和氧化型维生素 C (dehy droas corbat e， DHA)的抗癫痫作用和作用机制以及它们在防治和治疗癲痫疾病方面的新 应用。Fl， 6BP和DHA不仅能有效地控制或抑制多种急性和慢性癫痫动物的癲痫发作，而且能有效 地防止癫痫的发生与发展，甚至根治癫痫。F1，6BP和DHA的抗癫痫作用均是通过调节糖的代谢而 发挥其作用，即抑制2，6-二磷酸果糖调控的过多糖酵解和/或刺激葡萄糖利用通过戊糖磷酸化代 谢途径而增加脑内还原型谷胱甘肽(GSH)水平。F1，6BP和DHA独特的抗癫痫作用和作用机制支持 了它们在防治和治疗癫痫病疾方面的新应用。
背景技术：
癫痫是—种常见反复发作的中枢神经系统功能失常的慢性疾病。据世界卫生组织最新统计， 全世界范围内大约有五千万人为癫痫病患者。现有的抗癫痫药物主要是控制或抑制癫痫的发作， 但不能根治引发癫痫的病因，具体表现在一旦停止使用药物，多数癫痫患 者病情再发作。而且，现有的抗癫痫药物多有严重的不良反应和副作用，比如认识损害，情绪变 化和神经内分泌紊乱等。因此，寻找和开发既能控制或抑制癫痫的发作，又能根治引发癍痫病 因而且毒副作用少的新药，对于癫痫病的治疗具有重要意义。
尽管多种因素和复杂的基因交互作用被证明与癫痫的病因有关，但癫痫病患者的大脑最终 出现能量代谢异常，特别是葡萄糖的代谢异常。葡萄糖是大脑最主要的能量物质。葡萄糖代谢 的两条重要途径是糖酵解途径(glycolysis pathway)和戊糖磷酸化途径(pentose phosphate pathway, PPP)。
糖酵解主要由磷酸果糖酶-1 (phosphofructokinase-1, PFK1)调控。在正常情况下，糖酵解 的最终产物是丙酮酸。但是在祌经高度兴奋和癫痫状态下，糖酵解显著增加，大量的丙酮酸被 转化为乳酸而导致脑内乳酸累积。最新研究表明，这种产生大量乳酸的糖酵解(叫过多糖酵 解，excessive glycolysis)主要由2、 6-二磷酸果糖(fructose-2、 6-bisphosphate， F2, 6BP)调 控。F2, 6BP由磷酸果糖酶-2 (phosphofructokinase-1， PFK2)产生并且是PFK1强有力的激动剂。 由于PFK2仅存在脑内胶质细胞(astrocytes)中，因此这种过多糖酵解仅限于胶质细胞内。众多
3的研究表明过多糖酵解与癫痫的发生与发展密切相关(l)过多的糖酵解是癫痫病人和癫痫动物 的普遍现象；(2)糖酵解随着神经活性的增加而增加；(3)高血糖与癫痫活性有关，而低血糖具 抗癫痫作用，(4)Ketogenic diet(90。/。脂肪、3%碳水化合物、7%蛋白质)的抗癫痫作用取决于维 持低血糖水平。
葡萄糖的另一个代谢途径PPP通过释放还原型辅酶II(NDAPH)将氧化型的谷胱甘肽(GSsG)还 原成还原型的谷胱甘肽(GSH) 。 GSH是哺乳动物神经系统中最重要的自由基清除剂，并且具有很 强的抗癫痫作用。众多的研究表明脑内GSH与癫痫活动有密切关系(1) GSH和它的前体物乙酰半 胱氨酸均有很强的直接的抗癫痫作用；(2)GSH损耗或低下的动物很容易产生自发性癫痫；(3)GSH 损耗或低下与细胞外的高水平兴奋性氨基酸(谷氨酸)密切相关，而谷氨酸与癫痫密切相关； (4)GSH损耗或低下是引发氧化应激、线粒体功能紊乱和炎症的重要因素。
总之，过多糖酵解与癫痫产生密切相关，而脑内GSH损耗或低下以及引发的氧化应激、炎 症、线粒体功能紊乱和脑内细胞外高水平兴奋性氨基酸谷氨酸是癫痫发生的重要病因。因此抑 制胶质细胞中F2， 6BP调控的过多糖酵解和刺激葡萄糖PPP代谢而增加脑内GSH水平的化合物可 以有效地预防癫痫的发生与发展。鉴于此，我们尝试研究和开发选择性抑制过多糖酵解和增加 脑内GSH水平的新型抗癫痫药物。在本发明中我们具体公开的是1， 6-二磷酸果糖(F1， 6BP)和氧 化型维生C(DHA)的抗癫痫作用和作用机制。Fl， 6BP和DHA对多种急性和慢性癫痫动物均能有效 地控制或抑制癫痫的发作，而且能防止癫痫的发生与发展。更重要的是在慢性大鼠癫痫模型中， 在停止Fl， 6BP和DHA给药后所有动物均未出现癫痫再次发作，提示两者能有效地治疗并可能根 治癫痫。Fl, 6BP和DHA是通过调节糖代谢(抑制过多糖酵解和/或刺激葡萄糖的PPP而增加脑内 GSH水平)而产生其抗癫痫作用。
发明内容
本发明公开的是Fl， 6BP和DHA的抗癫痫作用和作用机制以及它们在防治和治疗癫痫疾病方 面的应用。其发明内容主要包括
1、 F1,6BP和DHA对海藻酸、毛果芸香碱和戊四氮诱发的大白鼠急性癫痫有明显的抗癫痫作用。
2、 Fl, 6BP和DHA对毛果芸香碱和戊四氮诱发的大白鼠慢性癫痫有预防和治疗作用。在停止 Fl， 6BP和DHA给药后所有动物均未出现癫痫再次发作，提示两者能有效地治疗并可能根治癫痫。3、 F1，6BP和DHA对毛果芸香碱和海藻酸诱发急性癫痫动物的神经损伤具有明显的保护作用。
Fl, 6BP还对脑缺血神经损伤具有显著的保护作用。
4、 Fl， 6BP的抗癫痫作用机制是通过抑制2， 6-二磷酸果糖调控的过多糖酵解并将葡萄 糖从糖酵解转变成戊糖磷酸化代谢从而增加脑内还原型谷胱甘肽(GSH)水平。
5、 DHA是通过刺激磷酸戊糖代谢途径酶的活性而增加脑内GSH水平而发挥其抗癫痫作用。
6、 抑制F2， 6BP调控的过多糖酵解的化合物具有抗癫痫作用。
7、 抑制磷酸果糖酶-2 (PFK2)的化合物具有抗癫痫作用。
8、 抑制乳酸脱氢酶5亚型(LDH5)的化合物具有抗癫痫作用。
9、 刺激葡萄糖PPP代谢途径增加脑内的还原型谷胱甘肽(GSH)水平的化合物具有抗癫痫作用。
10、 增加6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-GTO)和转二羟丙酮基酶(transaldolase)活性的 化合物具有抗癫痫作用和抗氧化作用。
11、 与现有的抗癫痫药物比较，比如丙戊酸(一种世界范围内广泛用于治疗癫痫的药物， 也是研究抗癫痫新药常用的阳性对照药)、Ketogenic diet和2-去氧葡萄糖 (2-deoxyglucose， 2DG, —种糖酵解抑制剂并具有抗癫痫作用)，Fl, 6BP和DHA防治和治疗癫痫疾 病具有以下特点(1)具有广谱抗癫痫作用。Fl， 6BP和DHA对多种急性和慢性癫痫动物均有作用， 而且比现有的抗癫痫药物的作用更强。(2) F1,6BP和DHA能有效治疗并可能根治癲痫疾病。现 有的抗癫痫药物主耍是控制或抑制癫痫的发作，对癫痫所引起的神经损伤无保护作用，而且不 能根治引发癫痫的病因。Fl， 6BP和DHA不仅能有效控制或抑制癫痫的发作，防止癫痫的发生与 发展，而且对癫痫所引起的神经损伤有非常明显的保护作用。更重要的是在慢性大鼠癫痫模型 中，在停止F1，6BP和DHA给药后所有动物均未出现癫痫再次发作，提示两者能有效地治疗并可 能根治癫痫。(3)F1,6BP和DHA有比较少的毒副作用。现有的抗癫痫药物多有严重的不良反应， 比如认识损害，情绪变化和神经内分泌紊乱。抑制整个葡萄糖的利用是Ketogenic diet和2-去氧葡萄糖产生认识损害等不良反应的原因。而且抑制整个葡萄糖的利用将导致脑内GSH和y-基丁酸(GABA)水平低下或缺损并加重癫痫或产生其他不良反应。而Fl， 6BP和DHA的抗癫痫作用 机制是选择性抑制F2， 6BP调控的过多糖酵解和剌激葡萄糖戊糖磷酸化代谢途径增加脑内GSH水 平，并不对整个葡萄糖的利用产生影响。(4) F1，6BP临床上用于心脏病的治疗未见有毒副作用 的报道。
12、 Fl， 6BP和DHA在预防和治疗癫痫疾病方面具有前景由于它们独特的抗癫痫作用和作用机理。
图l (Figl)是本发明两种抗癫痫药1,6-二磷酸果糖(F1，6BP)和氧化型维生C(DHA)分子结
构示意图； '
图2 (Fig2)是本发明1，6-二磷酸果糖(F1,6BP)对毛果芸香碱所致大鼠急性癫痫的抗癫痫
作用；
图3 (Fig 3)是本发明1， 6-二磷酸果糖(Fl, 6BP)对海藻酸所致大鼠急性癫痫的抗癫痫作用； 图4 (Fig 4)是本发明1，6-二磷酸果糖(F1，6BP)对戊四氮所致大鼠急性癫痫的抗癫痫作用； 图5(Fig 5)是本发明1,6-二磷酸果糖(F1，6BP)对戊四氮所致大鼠慢性癫痫的抗癫痫作用； 图6 (Fig 6)是本发明1,6-二磷酸果糖(F1,6BP)对毛果芸香碱所致大鼠慢性癫痫的抗癫痫 作用；
图7(Fig 7)是禁食对毛果芸香碱所致癫痫动物的血糖水平影响
图8(Fig 8)是乳酸和丙酮酸对1， 6-二磷酸果糖(Fl, 6BP)和2 —去氧葡萄糖的抗癫痫作用； 图9(Fig 9)是1, 6-二磷酸果糖(Fl， 6BP)对还原型谷光甘肽的影响。 具体实施范例
下面给出实施范例进一步说明本发明，但不对本发明进行限制。
(一)1、 6-二磷酸果糖抗癫痫作用的具体实施范例 1.1、急性癫痫模型
三种不同的急性癫痫模型包括毛果芸香碱(Pilocarpine, Pilo)、海藻酸(Kainic acid, KA) 和戊四氮(Pentylenetetrazole,PTZ)被用来测试1、 6-二磷酸果糖(Fi, 6BP〉的抗癫痫作用。丙戊 酸(VPA， 一种广泛用于治疗癫痫的药物，也是研究抗癫痫新药常用的阳性对照药)、2-去氧葡萄 糖(2-deoxyglucose, 2-DG, —种糖酵解抑制剂并具有抗癫痫作用)和ketogenic diet(治疗癫痫 的一种营养品)用来作为对照。成年雄性Sprague Dawley大鼠(200-230克)在腹腔注射 (ip)Fl，6BP或VPA或2-DG或生理盐水(癫痫组),或喂养ketogenic diet 1小吋后，再腹腔注 射毛果芸香碱(300mg/kg)，或戊四氮(5Gmg/kg)，或海藻酸(10mg/kg)。然后连续观察6小时(Pilo 和KA模型〉或20分钟(PTZ模型)动物的癫痫行为包括癫痫发作时间、癲痫等级、癲痫持续时间、 动物体重变化和死亡等。1. 1A 毛果芸香碱模型
癫痫组10只动物均产生癫痫，癲痫发作时间(latency to the first forelimb clonus after pilocarpine)为14±1分钟，并持续至少5小时，癫痫等级为5. 5±0. 4级(图2A) ， 4只动物在 24小时内死亡。1、 6-二磷酸果糖抗癫痫作用与剂量有关。低剂量组(0.25g/kg， n-5)没有作用。 中剂量(O. 5g/kg) 10只动物中仅有3只有等级大于或等于3的癫痫。高剂量(l. 0gZkg) 10只动物 中仅有2只有等级大于或等于3的癫痫。1、 6-二磷酸果糖中高剂量组中动物癫痫发作时间明显 延长，癲痫等级和癫痫持续时间均显著降低并没有动物死亡。与癫痫组动物脑电图(EEG)比较， 1, 6-二磷酸果糖高剂量组5只没有癫痫行的动物的脑电图也未显示癫痫活性(图2B) 。 2-去氧葡 萄糖(O、 25g/kg)对毛果芸香碱导的急性癫痫也有效。2-去氧葡萄糖组6只动物仅有一只有癫痫 (等级为3)，癫痫等级和癫痫持续时间均显著降低。丙戊酸(0.3g/kg,『9)也能降低癫痫等级和 癫痫持续时间，但其作用没有1， 6-二磷酸果糖和2-去氧葡萄糖强。丙戊酸组9只动物中有6只 有癫痫并有l只动物死亡。Ketogenic diet对毛果芸香碱诱导的急性癫痫没有作用。 1. 1B 海藻酸模型
海藻酸诱导的癫痫组i0只动物中有9只有严重癲痫(等级大于或等于3) ， 1只动物有轻微 的癫痫(节律性点头)，其癫痫发作时间(latency to the first wet dog shake after kainic acid) 为38士4分钟，癫痫等级和癫痫持续时间分别为3.7 ±0.3和3.7±0.2小时(图3)。没有动 物死亡。1、 6二磷酸果糖对海藻酸诱导的癫痫的作用也与剂量有关。低剂量组(0.25g/kg， n=6) 没有作用。中剂量(0. 5g/kg)和高剂量(1. 0g/kg)能明显延长癫痫发作时间并明显降低癫痫等级 和癫痫持续时间。中剂量组8只动物中2只没有癫痫，3只有轻微的癫痫(节律性点头)，剩下的 3只有较严重癫痫，其癫痫的平均等级为2. 5±0. 5。高剂量组8只动物中3只没有癫痫，3只有 轻微癫痫，剩下的2只有较严重癫痫，其癫痫的平均等级为1. 4±0. 5。 2-去氧葡萄糖(O. 25g/kg， n=6; 0.5g/kg， F3)仅能延长癫痫发作时间，其它癫痫行为与癫痫组比较没有统计学的区别。 尽管丙戊酸(O. 3g/kg，『6)组动物有严重的癫痫，但丙戊酸明显延长癫痫发作时间和降低癫痫 等级和癫痫持续时间。Ketogenic diet对海藻酸诱导的急性癫痫没有作用。 1. 1C 戊四氮模型
由戊四氮诱导的癫痫组所有9只动物均有阵挛性癫痫(tonic-clonic seizures)，癫痫发作
7时间(latency to the first forelimb clonus after pentylenetetrazols)为76±6秒，癫痫 持续时间为170土54秒(图4)。 1、 6-二磷酸果糖低中高三个剂量均能延长癫痫发作时间并降低 癫痫持续时间。高剂量组8只动物有3只没有癫痫。2-去氧葡萄糖(O. 25g/kg， n=5; 0. 5g/kg， 『5)组所有动物均有癫痫2-去氧葡萄糖不能延长癫痫发作时间。丙戊酸组(O. 3g/kg)8只动物中 有2只没有癫痫，6只动物的癫痫发作时间明显延长而癫痫持续时间缩短。此外，另设一组动物 (9只)每天饮用30mL 0. 5%1, 6-二磷酸果糖(这个剂量相当于0. 25克/公斤/每天)，连续给药7天。 在第7天，所有动物腹腔注射戊四氮(50mg/kg)。结果表明9只动物屮6只没有癲痫。这个结 果不仅说明1，6-一磷酸果糖能有效抑制戊四氮诱导的急性癫痫，而且表明1,6-二磷酸果糖能 通过饮用的方式给药。这样在慢性癫痫动物实验中，1,6-二磷酸果糖将采用这种给药途径。 1.2、慢性癫痫模型
1.2A戊四氮点燃法模型(PTZ kindling model)
成年雄性Sprague Dawley大鼠(180-200g)连续6天每天腹腔注射戊四氮(40mg/kg)，然后 改为每天戊四氮的剂量为35mg/kg直到动物在连续3天内至少有一癫痫发作期。在最后一次注 射戊四氮24小时后再腹腔注射戊四氮(30mg/kg)并记录动物的癫痫等级。癲痫动物给予生理盐 水(『6)或1,6-二磷酸果糖(0.5g/kg,n-6; 1. 0g/kg， n=6)。分别记录动物的癫痫等级作为治疗 前的对照。在第二天，所有动物腹腔注射戊四氮(30mg/kg)—小时后再给予生理盐水或i,6-二磷 酸果糖。在60分钟内观察动物的癫痫行为并记录癫痫等级。结果显示与治疗前的对照比较， 生理盐水组的所有动物有更高的的癫痫等级，而1,6-二磷酸果糖两个剂量组的所有动物的癫痫 等级明显降低(图5A)。
为了证明1， 6 二-磷酸果糖是或能抑制戊四氮点燃法诱导的癫痫的发展，另外14只动物在 第 一天腹腔注射戊四氮(50mg/kg)后让它们正常生活七天时间。在第七天，所有癫痫动物在腹腔 注射戊四氮(40mg/kg)—小时后分别腹腔注射生理盐水(『6)或1, 6-二磷酸果糖(O. 5g/kg， n=8)。 这种给药方法重复五天。每次给药后观察动物的癫痫行为并记录癫痫等级。结果显示在第六 次注射戊四氮后，生理盐水组所有动物均出现generalized tonic-clonic seizures,而1，6-二磷 酸果糖组的动物未见generalized tonic-clonic seizures (图5B)。 1. 2B、 毛果芸香碱模型(The pilocarpine rat model of temporal lobe epilepsy)
8成年雄性SpragueDawley大鼠(180-200g)腹腔注射毛果芸香碱(300mg/kg)。出现前肢阵挛 (3级癫痫)或站立和跌倒(4级癫痫)并维持2小时的动物定义为该动物有SE (status 印il印tJcus)。 2小时后，SE动物腹腔注射安定(5mg/kg)以提高动物存活率。动物出现SE七 天后，每天从早上8点到下午6点观察动物的癲痫行为。所有动物在10到40天内出现几种癫 痫行为包括面部阵挛、肌肉抽搐、前肢阵挛或站立和跌倒。出现第一次前肢阵挛定义为第一次 自发性癫痫。出现第一次自发性癫痫的时问为21 ±2. 7天。具有自发性癫痫的动物分为癫痫组(生 理盐水，n-6)和药物组(0. 5%1、 6 二-磷酸果糖，『6)并分别连续两周饮用生理盐水和0. 5%1， 6-二磷酸果糖(每只动物每天30mL)。癫痫组所有动物继续出现癫痫行为。1, 6-二磷酸果糖在7天 内完全阻止癫痫行为并且在停止用药后所有动物在两周内癫痫不在发作(图6， F1，6BP/1)。这 些动物大脑皮层的脑电图记录没有出现癫痫活性。有文献报道，自发性癫痫发作60天后，这个 动物模型的癫痫对药物具有依赖型。
为了证明1, 6-二磷酸果糖是或对这种赖药性的癫痫有效，另外6只癫痫动物在自发性癲痫 发作60天后连续两周饮用0.5%1,6-二磷酸果糖(每只动物每天30mL)。结果显示1,6-二磷酸果 糖在9天内完全阻止癫痫行为并且在停止用药后所有动物在10天内癫痫不再发作(图6， F1，6BP/2)。这些结果表明1,6-二磷酸果糖能有效抑制慢性癫痫并可能根治癫痫疾病。 1.3、抑制糖代谢具有抗癫痫作用
1.3A:禁食对癫痫动物的影响
饮用正常食物的十六只成年雄性动物分别测定其血糖浓度，其平均值为123.9±4.1 mg/DL。 然后动物分为两组， 一组动物喂正常食物作为癫痫控制组，另一组动物禁食48小时。禁食动物 体重减轻15.1±0.4%，血糖浓度降低到79.3±7.7 mg/DL。两组动物均腹腔注射毛果芸香碱 (300mg/kg)然后连续观察六小时动物癫痫行为。癫痫组所有动物均出现严重癫痫(等级大于3)。 禁食组七只动物中有六只在注射毛果芸香碱后三十分钟内出现呆滞行为，三十分钟后动物行为 趋于正常。另一只动物出现阵挛(图7)，其血糖浓度为97mg/DL，是禁食组七只动物中最高的。 以上结果表明降低血糖浓度具有抗癫痫作用。已知，限制饮食对基丙动物的抗癫痫作用和 ketogenic diet对癫痫患者的治疗作用与降低血糖浓度有关。 1.3B:磷酸果糖酶-2 (PFK2)抑制剂的抗癫痫作用最新研究表明产生大量乳酸的过多糖酵解主要由2,6-二磷酸果糖(F2，6BP)调控，而F2,6BP是由 胶质细胞中磷酸果糖酶-2(PFK2)产生。因此，我们推测PFK2的抑制剂可降低PFK2活性而减少 F2，6BP的产生从而抑制过多糖酵解而发挥其抗癫痫作用。为此三种不同的PFK2化学抑制剂磷 酸烯醇丙酮酸盐(phosphoenolpymvate,PEP),衣康酸盐(itaconatey)和柠檬酸盐(citrate)被用來抑制 PFK2活性并评价它们的抗癫痫作用(图7)。三组不同的动物分别腹腔注射衣康酸钠(250mg/kg， n=7)、柠檬酸钠(500mg/kg， ！^5)和生理盐水一小时后再腹腔注射毛果芸香碱(300mg/kg)。另设 两组不问的动物分别脑侧室注射PEP(n-5)或PBS(对照组)。生理盐水和PBS对照组的所有动物 均出现前肢阵挛和站立或跌倒。衣康酸钠具有抗癫痫作用，七只动物中有四只没有癫痫。同样 柠檬酸和PEP也有抗癫痫作用。柠檬酸钠组五只动物中三只没有癫痫，而PEP组五只动物中四 只没有癫痫。这三个给药组所有动物在24小时内无动物死亡。这三种PFK2抑制剂在海藻酸和 戊四氮的动物模型中也得到相似的结果。以上结果表明抑制PFK2活性的化合物具有抗癫痫作 用，也就是抑制由PFK2产生的2， 6-一磷酸果糖调控的过多糖酵解具有抗癫痫作用。
已知胶质细胞中有四种PFK2异构酶PFK2. 1、 PFK2. 1、 PFK2. 3、 PFK2. 3和PFK2. 4。其中以 PFK2. 3产生2, 6-二磷酸果糖(F2， 6BP)的能力最强。因此，我们推测抑制PPFK2. 3活性能更有效 阻断或降低引发癫痫的过多糖酵解。在毛果芸香碱急性癫痫动物模型中，我们已经成功使用了 siRNA(small intering RNA)技术来抑制PFK2. 3的活性，其结果导致PFK2. 3蛋白质水平降低和 产生2,6-二磷酸果糖的能力丧失从而抑制过多糖酵解并产生PFK2抑制剂更强的抗癫痫活性。 以上结果表明PFK2. 3对引发癫痫的过多糖酵解就有重要作用，以PFK2. 3为作用耙点可能是丌 发治疗癫痫新药的新方法。
1. 3C:乳酸脱氢酶5亚型(LDH5)抑制剂的抗癫痫作用
如前所述，过多糖酵解以大量丙酮酸被转化为乳酸为特征。这种转化需要乳酸脱氢酶5亚 型(LDH5)的参与。抑制LDH5活性即可抑制过多糖酵解。因此LDH5酶的抑制剂可能具有抗癫痫 作用。两种不同的LDH5酶的抑制剂脱氢胆酸(deoxycholate)和棉酚(gossypol)被用来评估其抗癫 痫作用。三组不同的动物分别脑侧室注射脱氢胆酸钠(0. 5mg inlO^L PBS, n=10)、棉酚(1 mg inlO pL PBS,『6)和PBS —小时后再腹腔注射毛果芸香碱(300mg/kg)。 PBS对照组的所有动物均出 现前肢阵挛和站立或跌倒。脱氢胆酸钠具有显著的抗癫痫作用，10只动物中有6只没有癫痫，4 只动物有轻微癫痫。同样棉酚也有抗癫痫作用。6只动物中有3只没有癫痫，2只动物出现节律
10性点头，2只动物出现前肢阵挛。这些结果表明抑制乳酸脱氢酶5亚型(LDH5)的化合物具有抗 癫痫作用，以LDH5酶为作用靶点也可能是丌发治疗癫痫新药的一种新方法。
1. 4、乳酸和丙酮酸对1， 6-二磷酸果糖和2-去氧葡萄糖抗癫痫作用的影响
我们的实验结果表明1, 6-二磷酸果糖(Fl， 6BP)的抗癫痫作用强于2-去氧葡萄糖。这可能是 由于Fl, 6BP不仅抑制过多糖酵解(即减少乳酸累积)并刺激葡萄糖戊糖磷酸化代解而增加脑内 GSH水平。GSH具有抗癫痫作用。而2-去氧葡萄糖抗癫痫作用仅是通过抑制葡萄糖糖酵解而发挥 其作用。因此，我们推测外源性的乳酸将废除2-去氧葡萄糖的抗癫痫作用，但仅降低l，6-二磷 酸果糖的抗癫痫活性。为了证实这个假设，动物在腹腔注射乳酸钠(0. 5g/kg) 30分钟后分别腹腔 注射2-去氧葡萄糖(0. 25 g/kg)或1， 6-二磷酸果糖(1. 0g/kg)。再过30分钟后再腹腔注射毛果 芸香碱(300mg/kg)。另一组动物禁食四十八小时后腹腔注射乳酸钠(0.5g/kg)再过30分钟后腹 腔注射毛果芸香碱(300mg/kg)。结果显示2-去氧葡萄糖加乳酸组和禁食加乳酸组与毛果芸香 碱组比较，两组动物的癫痫行为没有明显区别。这个结果说明外源性的乳酸能废除2-去氧葡萄 糖和禁食的抗癫痫作用。但是乳酸仅仅降低1，6-二磷酸果糖的抗癫痫活性(图8)。丙酮酸是乳 酸的前体物，在IH常情况下直接进入Krebs循环。如果产生人量乳酸的过多糖酵解与癫痫有关， 那么外源性的丙酮酸和外源性乳酸对癫痫活性有不同的影响。我们的实验结果表明外源性的丙 酮酸(500mg/kg)并不废除2-去氧葡萄糖和禁食的抗癫痫作用。这些结果支持了以上假设并说明 过多糖酵解引起的乳酸累积与癫痫密切相关。 1. 5、 1， 6-二磷酸果糖对还原型谷胱甘肽(GSH)的影响
已知外源性的l， 6-二磷酸果糖(F1, 6BP)不能作为糖代谢物质，但是能刺激葡萄糖戊糖磷酸 化代谢而提高NADra的生产并可提高GSH水平。GSI1本身具抗癫痫作用。因此Fl, 6BP可能通过纠IH 癫痫脑内GSH损耗或低下而发挥其抗癫痫作用。为此，我们研究了F1，6BP对TH常动物和毛果芸香 碱诱导的慢性癫痫动物三个不同吋间点脑内GSH含量的变化(图9)。动物分为正常动物组(生理盐 水组)，癫痫动物组和F1,6BP治疗组。Fl，6BP治疗组动物每天饮用30mL0.5y。l,6-二磷酸果糖，连 续给药7天。这三个不同时间点分别为注射毛果芸香碱后两小时(Pilo2h)，发生SE10天后(还未 出现癫痫，10d)，癫痫初期(出现癲痫10-15天)和癫痫后期(出现癫痫50-60天)。GSH水平由高效 液相色谱方法测定。其结果显示注射毛果芸香碱后两小时的动物G S H水平与IE常动物组(Normal)动物无明显差异。IO天后当癫痫还未出现时GSH水平显著升高，然后在癫痫初期GSH水
平降到正常水平，最后在癫痫后期GSH水平继续降到大约IH常水平一本正经。而Fl, 6BP治疗组的
动物的癫痫完全停止并且在停止用药后所有动物在10天内癫痫不再发作(图6)，这些动物的GSH
水平正常动物组动物无明显差异。以上结果表明F1,6BP能纠正癫痫脑内GSH损耗或低下而发挥其
抗癫痫作用。前面己经证明F1， 6BP抗癫痫作用强于2-去氧葡萄糖。可能是因为Fl, 6BP不仅能抑
制糖酵解而且能通过刺激葡萄糖戊糖磷酸化代谢而提高GSH水平。而2-去氧葡萄糖的抗癫痫作用
仅仅是通过抑制糖酵解而发挥的。
GSH水平由高效液相色谱(HPLC)方法测定。仪器HP-1100型高效相色谱仪。色谱条
件色谱柱Eclipse MA 150 x 4. 6 mm, 3.5戶；检测波长338 nm，参比波长390隱；温 度40。C;流速1.5 mL/min;流动相-A 40 mM Na2HP04， pH 7.8，流动相-B乙
腈/甲醇/水45/45/10。对照品还原型的谷胱甘肽(GSH，纯度大于98%，购于SIGMA 公司)，参照氨基酸衍生物的标准制备方法，将GSH与OPA试剂反应制成0. 5mgZmL的对照品标 准液。标准曲线的制备取浓度为0. 5mg/mL的对照品标准液分别以 0. 1, 0. 2, 0. 5, 5. 0, 10. 0， 20. 0， 30. (VL进样，在上述色谱条件下分析。以峰面积(Y)为纵坐标和 样品浓度(X， pg)为横坐标作图得标准曲线并计算回归方程为Y=1378.9397X + 4.5802，其样 品浓度在0.2到6.0叫之间呈良好线型关系，相关系数为0.9999。精密度试验取浓度为
0. 5mg/mL的GSH对照品液连续进样6次，每次5pL，在甜述色谱条件下测定GSH的峰面积，其 峰面积的RSD为2. 14%。稳定性试验取浓度为0.5mg/mL的GSH对照品液分别在0、 1、 6、 8、 12小吋进样，每次5pL，在前述色谱条件下测定迷迭香酸的峰面积，其峰面积的RSD为 4. 56%(n=5)。样品的制备及分析将样品采用对照品相同方法制备成样品供试液在上述色谱条 件下测定其吸收度并从回归方程为中计算样品中GSH含量。
1.6、 1, 6-二磷酸果糖的神经保护作用
1. 6A 1， 6-二磷酸果糖对毛果芸香碱诱导的神经损伤的保护作用
在实验1.1A中，癫痫组6只动物(在注射毛果芸香碱24小时后未死亡，其癲痫等级大于5)的 脑皮质神经细胞出现严重损伤(Nissl染色)，损伤程度为2.8士0.2级。这些动物的海马CA4和齿状 脑回区的神经细胞也有严重损伤(Fluoro-JadeB染色)，其平均损伤细胞数为282士33。 1,6-二磷 酸果糖药物组中5只动物(包括中和高剂量组动物其癫痫等级大于或等于3)的脑皮质神经细胞损伤程度大大降低，损伤程度为0.9土0.2级。这些动物的海马CA4和齿状脑区回的神经细胞损伤 也大大降低，其平均损伤细胞数为78士23。 1, 6-二磷酸果糖屮高剂量组5只没有癫痫行为的动物 未见脑皮质神经细胞损伤。这些动物的海马CA4和齿状脑区回的祌经细胞也未出现损伤。以上结 果表明1, 6-二磷酸果糖对毛果芸香碱诱导的神经细胞损伤具有明显的保护作用。 1， 6B 1, 6-二磷酸果糖对海藻酸诱导的神经损伤的保护作ffl
在实验1. 1B中，癫痫组9只动物(有严重癫痫，等级大于或等于3)的海马神经细胞出现严 重损伤(50%动物出现在CA1/2区，100%动物出现在CA3/4区，Fluoro-Jade B染色)。其平均损 伤细胞数为61 ±13。通过Nissl染色，CA3/4区的细胞丢失清晰可见。1， 6-二磷酸果糖对海 藻酸诱导的神经细胞损伤具有显著的的保护作用。1,6-二磷酸果糖中高剂量组中没有癫痫的5 只动物未出现神经细胞损伤。而5只具有严重癫痫的动物虽然也出现出现神经细胞损伤，但其 损伤程度大大降低，其平均损伤细胞数为15±3。
1. 6C 1, 6-二磷酸果糖对脑缺血神经损伤的保护作用
用兴奋性毒性物质NMDA造成原代培养神经细胞损伤，1， 6-二磷酸果糖(3. 5mM)对这种兴奋性 神经细胞损伤具有明显保护作用。
(二)氧化型维生素C抗癫痫作用的具体实施范例 2.1、急性癫痫模型
三种不同的急性癫痫模型包括毛果芸香碱(Pilo)、海藻酸(KA)和戊四氮(PTZ)被用来评估氧 化型维生素C(dehydroasxorbate,DHA)的抗癫痫作用。丙戊酸用来作为阳性对照。成年雄性 Sprague Dawley大鼠(200-230克)从脑室注射DHA 10/zl (10mM) (ip)，或腹腔注射丙戊酸(0.3g/kg) 或生理盐水(癫痫组),再腹腔注射毛果芸香碱(300mg/kg)，或戊四氮(50mg/kg),或海藻酸(10mgZkg)。 然后连续观察六小时(Pilo和KA模型)或20分钟(PTZ模型)动物的癫痫行为包括癫痫发作时间、 癫痫等级、癫痫持续时间、动物体重变化和死亡等。
2. 1A毛果芸香碱模型
癫痫组IO只动物均产生癫痫，癫痫发作时间为14±1分钟，并持续至少5小时，癫痫等级为 5.5±0.4级，4只动物在24小时内死亡。DHA组9只动物8只在48小时内没有出现癫痫，一 只动物在54分钟出现前肢阵挛，无动物死亡。DHA组4只没有癫痫行为的动物的脑电图记录
13未显示癜痫活性。丙戊酸能明显降低癫痫等级和癫痫持续时间。9只动物中3只没有癫痫6只有 癫痫并有1只动物在24小时内死亡。 2. 1B、海藻酸模型
海藻酸诱导的癫痫组10只动物中有9只有严重癫痫(等级大于或等于3) ， 1只动物有轻微 的癫痫(节律性点头)，其癲痫发作时间为38±4分钟，癫痫等级和癫痫持续时间分别为3. 7±0. 3 和3. 7土0. 2小时。DHA能防止癫痫发作。8只动物6只没有癫痫，其它2只仅出现轻度癫痫。 尽管丙戊酸组6只动物均有严重的癫痫，但丙戊酸明显延长癫痫发作时间和降低癫痫等级和癫 痫持续时间。 2. 1C 戊四氮模型
由戊四氮诱导的癫痫组所有9只动物均有阵挛性癫痫，癫痫发作时间为76±6秒，癲痫持 续时间为170±54秒。DHA能预防癫痫发作。8只动物有6只没有癫痫。丙戊酸组(0. 3g/kg)8 只动物中有4只没有癫痫。 2.2、慢性癫痫模型
毛果芸香碱模型实验方法和癫痫组(生理盐水)以及癫痫行为及指标观察与前述实验1.2B 相同。但药物组每天从脑室注射10/il氧化型维生素C(DHA， 10mM)。癫痫组所有动物继续出现 癫痫行为。氧化型维生素C在5天内完全阻止癫痫行为并且在停止用药后所有动物在两周内癫 痫不再发作。这些动物大脑皮层的脑电图记录没有出现癫痫活性。为了证明氧化型维生素C对 毛果芸香碱诱导的慢性癫痫是否具有药物依赖性，另外6只癫痫动物在自发性癫痫发作60天后 连续两周脑室注射10//1氧化型维生素C。结果显示氧化型维生素C在8天内完全阻止癫痫行为 并且在停止用药后所有动物在15天内癫痫不再发作。这些结果证明氧化型维生素C能有效抑制 慢性癫痫并可能根治癫痫疾病。
2. 3、氧化型维生素C的神经保护作用
2.3A 氧化型维生素C对毛果芸香碱诱导的神经损伤的保护作用
在实验2. 1A中，癫痫组6只动物(在注射毛果芸香碱24小时后未死亡，其癫痫等级大于5)的 脑皮质神经细胞出现严重损伤(Nissl染色)，损伤程度为2.8士0.2级。这些动物的海马CA4和齿状 脑回区的祌经细胞也有严重损伤(Fluoro-JadeB染色)，其平均损伤细胞数为282士33。氧化型维 生素C药物组8只动物的脑皮质神经细胞未见明显损伤。这些动物的海马CA4和齿状脑区回的神经
14细胞也为出现明显损伤。以上结果表明氧化型维生素C对毛果芸香碱诱导的祌经细胞损伤具有 显著的保护作用。
2.3B 氧化型维生素C对海藻酸诱导的神经损伤的保护作用在实验
2. IB中，癫痫组9只动物(有严重癫痫，等级大于或等于3)的海马神经细胞,屮,现严重损伤 (50。/。动物出现在CAl/2区，100y。动物出现在CA3/4区，Fluoro-Jade B染色)。其平均损伤细胞数 为61 ±13。通过Nissl染色，CA3/4区的细胞丢失清晰可见。氧化型维生素C对海藻酸诱导的 神经细胞损伤具有显著的的保护作用。氧化型维生素C药物组中没有癫痫的6只动物未见神经细 胞损伤。而另外2只有轻度癲痫的动物仅出现轻微的神经细胞损伤。 2. 4、氧化型维生素C对还原型谷胱甘肽(GSH)的影响
实验证明在原代细胞培养实验中，氧化型维生素C能通过刺激磷酸戊糖代谢途径酶包括
6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase ， 6-PDG)和转二羟丙酮基酶 (transaldolase)的活性而显著提高GSH水平。如甜所述脑内GSH损耗或低下是引发癫痫的重要 病因之一，而增加脑内GSH水平的化合物可以有效地预防癫痫的发生与发展。我们推测氧化型 维生素C的抗癫痫作用与提高GSH水平有关。为此，我们研究了氧化型维牛:素C对毛果芸香碱 诱导的慢性癫痫动物三个不同时间点脑内GSH含量的变化。动物分为:i卜:常动物组(生理盐水组)， 癫痫动物组和氧化型维生素C治疗组。氧化型维生素C治疗组动物每天从脑室注射氧化型 维生素C(10mM)，连续给药7天。这三个不同时间点分别为注射毛果芸香碱后两小时(Pilo 2h)， 发生SE10天后(还未出现癫痫，10d)，癫痫初期(出现癲痫10-15天)和癫痫后期(出现癲痫50-60 天)。GSH水平由高效液相色谱方法测定。其结果显示注射毛果芸香碱后两小时的动物GSH水 平与JH常动物组(Normal)动物无明显差异。10天后当癫痫还未出现时GSH水平显著升高，然后 在癫痫初期GSH水平降到正常水平，最后在癲痫后期GSH水平继续降到大约正常水平一半。而 氧化型维生素C治疗组的动物的癫痫完全停止并且在停止用药后所有动物在15天内癫痫不再发 作，这些动物的GSH水平与正常动物组动物的GSH水平无明显差异。以上结果表明氧化型维 生素C可能通过纠『.癫痫动物GSH水平低下而发挥其抗癫痫作用。
权利要求
1、1，6-二磷酸果糖(fructose-1，6-bisphosphate，F1，6BP)和氧化型维生素C(dehydroascorbate，DHA)抗癫痫作用和作用机制以及它们在防治和治疗癫痫疾病方面的应用。
2、 根据权利要求1所述的F1,6BP和DHA的抗癫痫作用，其特征是Fl, 6BP和DHA不仅能有效地 控制或抑制多种急性和慢性癫痫动物癫痫的发作，而且能有效地防止癫痫的发生与发展， 甚至根治癫痫。多种急性癫痫动物包括由毛果芸香碱(Piloacarpine， Pilo)、海藻酸 (Kainic acid' KA)和戊四氮(Pentylenetetrazole, PTZ)诱发的大白鼠急性癫痫动物。慢 性癫痫动物包括由毛果芸香碱和戊四氮诱发的大白鼠慢性癫痫动物。
3、 根据权利要求1所述的F1,6BP和DHA的抗癫痫作用，其特征是Fl， 6BP和DHA对毛果芸香碱 和海藻酸诱发的急性癫痫动物的神经损伤具有明显的保护作用。Fl, 6BP还对脑缺血神经损 伤具有显著的保护作用。
4、 根据权利要求1所述的F1,6BP和DHA的抗癫痫作用机制，其特征是Fl, 6BP通过抑制2， 6-二磷酸果糖调控的过多糖酵解并将葡萄糖从糖酵解转变成戊糖磷酸化代谢从而增加脑内 还原型的谷胱甘肽(GSH)水平而发挥其抗癫痫作用；而DHA抗癫痫作用机制是通过刺激磷酸 戊糖代谢途径酶的活性而增加脑内GSH水平。
5、 抑制磷酸果糖酶-2(phosphofructokinase-2， PFK2)活性的化合物和它们的抗癫痫作用。
6、 抑制乳酸脱氢酶5亚型(LDH5)活性的化合物和它们的抗癫痫作用。
7、 刺激葡萄糖戊糖磷酸化代谢途径(PPP)活性而增加脑内GSH水平的化合物和它们的抗癫痫作用。
8、 1、 6-二磷酸果糖和氧化型维生素C分别单独或联合，以及合并其他药物或合并制剂用于 防治癫痫疾病的应用。
9、 根据权利要求1和权利要求8所述的F1,6BP和DHA用于防治和治疗癫痫疾病可作为药品或 功能保健品使用。药品或功能保健品，其制剂包括经口服给药途径制剂和非口服给药途径制剂。所述的口服给药制剂包括片剂、口服液、丸剂、滴丸、胶囊、软胶囊、泡腾剂、缓释剂、控释剂、靶向制剂；所述的非口服给药途径制剂包括注射剂、粉针、大输液、栓 齐U。
全文摘要
本发明涉及1，6-二磷酸果糖(fructose-1，6-bisphosphate，F1，6BP)和氧化型维生素C(dehydroascorbate，DHA)的抗癫痫作用和作用机制以及它们在防治和治疗癫痫疾病方面的新应用。F1，6BP和DHA不仅能有效地控制或抑制多种急性和慢性癫痫动物的癫痫发作，而且能有效地防止癫痫的发生与发展，甚至根治癫痫。F1，6BP抗癫痫的作用机制是抑制2，6-二磷酸果糖调控的过多糖酵解并将葡萄糖从糖酵解转变成戊糖磷酸化代谢从而增加脑内还原型谷胱甘肽(GSH)水平。DHA是通过刺激磷酸戊糖代谢途径酶的活性而增加脑内GSH水平发挥其抗癫痫作用。F1，6BP和DHA独特的抗癫痫作用和作用机制支持了它们在防治和治疗癫痫病疾方面的新应用。
文档编号C07D493/00GK101513425SQ20091012762
公开日2009年8月26日 申请日期2009年3月13日 优先权日2009年3月13日
发明者张治针, 肖兵华, 连晓嫒, 奇 陈 申请人:连晓嫒