专利名称：具有抗癌活性的核桃素及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗癌活性的核桃素及其制备方法。具体地讲，本发明涉及从 核桃青皮或者核桃枝叶中提取分离一种新核桃素化合物及其制备方法。本申请为分案申 请，原申请的申请日为2007年4月4日，申请号为200710017664. 9，发明创造名称为具有抗 癌活性的核桃素及其制备方法。
背景技术：
胡桃科核桃属(Juglans L.)植物，全世界约18种，主要分布于北温带，我国有5 种，其枝、叶、外果皮、根皮、坚果内核及果仁可入药。核桃对泌尿系统结石、慢性气管炎、皮 炎、湿疹及痢疾等疾病疗效很高；唐代名医孟诜说，核桃“通经脉、润血脉、常服骨肉细腻光 润”；明代大医学家李时珍对核桃仁的医药价值的概括为“补气养血，润燥化痰，益命门，利 三焦，温肺润肠”；核桃及核桃楸的未成熟果实或外果皮(青龙衣)具有清热、解毒、止痢、明 目的功效；核桃楸的根皮在韩国作为民间药物治疗癌症；在印度和非洲，核桃各个部位的 提取物作为民间药物使用了很多年。核桃属植物的化学成分主要有萘醌、黄酮、多酚、二芳 基庚烷、萜类及以上各类的苷类化合物。该属植物普遍具有抗菌、抗肿瘤、镇痛和清除自由 基等药理活性。研究证明胡桃楸青果皮的水提取浸膏对体外小鼠肉瘤S18(l有直接杀死作用，对 小鼠实体型肝癌(S18CI)有显著抑制作用。胡桃醌对HePA小鼠生命延长率为95%，抑制 S180实体型达50% ；应用同位素方法发现，以胡桃醌0. 1和0. 025mg/mL作用5h，对HePA 小鼠细胞DNA合成抑制为高峰，分别是71. 5 %和60 % ；电子显微镜观察，胡桃醌主要影 响HePA细胞线粒体。在试验剂量下，青龙衣氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物对腋下移植 性实体型肉瘤S18(l及移植性腹水型肿瘤H22有一定的抑制作用，与阴性对照组比较具有显 著差异，青龙衣氯仿提取物和乙酸乙酯提取物具有一定的抗肿瘤作用。韩国学者Byimg SM(Byung SM, Lee SY, Kim JH, et al. Anti-complement Activity of Constituents from the Stem-Bark of Juglansmandshurica, Biol Pharm Bull. 2003,26,1042-1044.) 从核桃楸枝皮中提取的黄酮类及五倍子酸苷类化合物具有抗补体活性，细胞毒活性，抑 制DNA聚合酶活性及抗HIV-1活性；从核桃楸根中提取分离的4个二芳基庚烷类化合物 的HT-29和MCF-7癌细胞具有较强的细胞毒活性；日本的Toshiyuki F(Toshiyuki F， Hideyukil, Takashi Y. Antioxidative polyphenols from walnuts(Juglans regia L.). Phytochemistry. 2003，63，795-801.)发现核桃青果中的多酚类化合物具有较强的抗 氧化活性；韩国的 Lee KS(Lee KS, Li G, Kim SH, et al. Cytotoxic diaryheptanoidsfrom the roots of Juglans mandshurica J Nat Prod. 2002,65,1707-1708.)对核桃楸根中提 取的4个二芳基庚烷类化合物的药理活性研究表明对人肺癌细胞(A549)和人结肠癌细胞 (HT-29)具有中等程度的细胞毒活性。国内外研究表明截至目前从核桃属植物中分离得到50多种化合物，其中萘醌及 其苷类、二芳基庚烷及其苷类化合物具有较强的抗癌及抗氧化活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗癌活性的新化合物核桃素。本发明的另一个目的在于提供一种具有抗癌活性的核桃素的制备方法。我们首次从核桃青皮或者核桃枝叶中提取分离出来的新化合物，具有抗癌活性， 它属于二芳基庚烷类化合物。一种具有抗癌活性的核桃素，其特征在于该核桃素为二芳基庚烷类化合物，具有 C21H2405的分子式，化学结构式如式I<formula>formula see original document page 4</formula>
一种具有抗癌活性的核桃素，其特征在于该核桃素为二芳基庚烷类化合物，具有 c20H22o3的分子式，化学结构式如式II<formula>formula see original document page 4</formula>本发明提供的化合物核桃素的化学结构经过UV、IR^HNMR^CMffi、DEPT、COSY、 HMQC、HMBC、HR-ESIMS、X-ray等现代光谱及波谱技术的鉴定得到确认并具有以下理化常数 和谱学特征C21H2405，无色针状结晶，M. P. 148-150°C, [ a ]D20- 64° (c 0. 5，MeOH) ；HR-ESIMS :m/ z = 374. 1963[M+NH4]，C21H2805N 的计算值为 374. 1962,m/z = 357. 1703[M+H]+，C21H2505 的计 算值为 357. 1702 ；UV(MeOH)入隨(Log e )nm 280(3. 66) ； IR(KBr) vmax cm-1 3440 (OH), 2938, 1714(C = 0)，1611，1586，1517，1430 ；CD(c =0.0003,MeOH) A e (nm) +61. 6 (208),-20. 8 ( 232)，-0. 5 (255)，-4. 7 (282)，+0. 6 (296)。^ NMR 谱和 13C NMR 谱数据见表 1。C20H2203，无色针状结晶，M.P. 182-183°C, [a ]D22+6° (0. 5，MeOH) ；HR-ESIMS :m/ z = 311. 1676[M+H]+，C20H2303 的计算值为 310. 1569 ； UV (MeOH) X max (Log e ) nm256 (3. 96), 286 (3. 85) , 298 (3. 81) ；IR(KBr) v max cnf1 :3382，2931，1619，1595，1503，1412 ； CD (c = 0.0005，MeOH) A e (nm) :+32. 9 (206)，+15. 9 (225)，-40. 3 (238)，-43. 4 (252)，-7.9 (272)，-38. 0 (297)。屮 NMR 谱和 13C NMR 谱数据见表 1。表 1 核桃素的'HNMR(400MHz)和 13CWR(100MHz)数据(TMS,5ppm, JHz)
式 I (CDC13) 式 II (CH3COCH3-rf6) NO --
HCHC1145.5125.52139.7125.63147.9140.24124.8148.056.87 (d 8.4)126.06.75 (s)111.266.55 (d, 8.4)115.8 130.973.14 (m), 2.38 (m)29.92.88 (m), 2.46 (m)30.081.76 (m), 1.54 (m)24.61.93 (m), 1.65 (m)26.491.53 (m)18.91.80 (m), 1.43 (m)22.7102.06 (m)46.11.77 (m), 1.54 (m)39.511210.24.00 (m)67.3122.37 (m)41.12.22 (m), 1.70 (m)34.513 132.72 (dd, 7.2,16.4) 2.98 (dd, 7.2’ 16.4)27.12.91 (m), 2.80 (m)26.514134.2130.8155.53(d, 2.0)112.97.02 (dd, 7.2，2.4)129.416148.96.82 (d, 7.2)116.217146.5151.4186.80 (d, 8.4)111.87.21 (d，2.4)133.6196.66 (dd, 8.4，2.0)121.66.77 (s)125.4CH30-23.93 (s)61.6CH3O-I 73.91 (s)56.1OH-36.01 (s)CH3O-43.83 (s)55.6OH-113.24 (s)本发明的核桃素的制备方法，其特征在于该方法包括原料采集加工、浸膏提取、分 离纯化三个步骤A、原料采集加工采集核桃青皮或核桃枝叶，干燥，粉碎；B、浸膏提取采用70_95V/V%乙醇对原料冷浸或回流热提得总浸膏；C、分离纯化总浸膏用水混悬，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行液液分配萃 取得到Fa、Fb、Fc三个组分；Fa组分用石油醚和乙酸乙酯以不同体积比例混和组成的溶剂， 按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱分离，收集极性范围在8 1和6 1的 两个组分FA1和FA2;FA1和FA2分别以石油醚和乙酸乙酯按体积比6 1和4 1组成的混
6和溶剂重新进行柱色谱分离，通过FA1得到式I核桃素粗品，FA2得到式II核桃素粗品；以石 油醚和乙酸乙酯按体积比21组成的混和溶剂重结晶得到核桃素。
本发明通过药理实验表明核桃素具有较好的抗癌活性，有望开发成以核桃素为原 料的抗癌新药。本发明的优点在于1、从核桃青皮或核桃枝叶中提取分离到具有抗癌活性的化合物核桃素；2、按本发明提供的制备方法，提取分离制备核桃素工艺简单，方法可靠，产率高， 化合物纯度好。
图1为式I化合物核桃素的红外光谱(IR)图。图2为式I化合物核桃素的高分辨质谱(HR-ESIMS)图。图3为式II化合物核桃素的红外光谱(IR)图。图4为式II化合物核桃素的高分辨质谱(HR-ESIMS)图。图5为式I化合物核桃素的X-Ray晶体结构。
具体实施例方式为了更清楚的理解本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明 不限于以下实施例。为了便于叙述，将式I化合物核桃素表述为核桃素A，式II化合物核桃 素表述为核桃素B。实施例1 核桃青皮中核桃素的提取分离A、原料采集加工步骤采集核桃青皮适量，阴干，适当粉碎。B、浸膏提取步骤取核桃青皮5Kg，加入8倍量95%乙醇，冷浸(7dX3)，过滤，减 压回收溶剂得总浸膏200g。C、分离步骤将200g浸膏浑悬于1000mL水中，用300mL石油醚(60_90°C )萃取3 次，回收溶剂的浸膏20g，剩余物用300mL乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂得浸膏30g，剩余物 用300mL正丁醇萃取3次得浸膏40g。将石油醚部分浸膏用40g硅胶(100-200目)拌样， 600g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90°C)乙酸乙酯(10 1-2 1) 进行梯度洗脱，500mL为一流份，回收溶剂，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以5%的硫酸 乙醇溶液，加热显色后合并相同组分，得F1 (3. 5g，10 l)、F2(4g，8 l)、F3(3g，6 1)、 F4(4g，4 1)四个组分。组分F2用5g硅胶(100-200目)拌样，40g硅胶(200-300目)上 普通玻璃层析柱，石油醚(60-90°C )乙酸乙酯(6 1)洗脱，用薄层色谱在紫外灯(UV) 下或喷以5%的硫酸乙醇溶液，加热显色后合并相同组分得核桃素A20mg ；组分F3用3g硅 胶(100-200目)拌样，40g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60_90°C )乙 酸乙酯(4 1)洗脱，得核桃素B 18mg。实施例2 核桃青皮中核桃素的提取分离A、原料采集加工步骤采集核桃青皮适量，阴干，适当粉碎。B、浸膏提取步骤取核桃青皮5Kg，加入10倍量95 %乙醇，回流热提(2hX 3)，过 滤，减压回收溶剂得总浸膏250g。
C、分离步骤将250g浸膏浑悬于1000mL水中，用300mL石油醚(60_90°C )萃取3 次，回收溶剂的浸膏30g。将浸膏用40g硅胶(100-200目)拌样，400g硅胶(200-300目) 上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90°C)乙酸乙酯(10 1-2 1)进行梯度洗脱，500mL为 一流份，回收溶剂，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以5%的硫酸乙醇溶液，加热显色后合 并相同组分，得 Fl (5g，10 l)、F2(10g，8 l)、F3(7g，6 l)、F4(20g，2 1)四个组分。 组分F2用5g硅胶(100-200目)拌样，40g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚 (60-90°C )乙酸乙酯(6 1)洗脱，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以5%的硫酸乙醇 溶液，加热显色后合并相同组分得核桃素A 22mg;组分F3用15g硅胶(100-200目)拌样， 250g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90°C )乙酸乙酯(4 1)洗脱， 得核桃素B 21mg。实施例3 核桃枝叶中核桃素A和核桃素B的提取分离A、原料采集加工步骤采集核桃枝叶适量，阴干，适当粉碎。B、浸膏提取步骤取核桃叶5Kg，加入8倍量水，回流提取(2hX 2)，过滤，减压回收 溶剂100g。C、分离步骤将100g浸膏浑悬于1000mL水中，用300mL石油醚(60_90°C )萃取3 次，回收溶剂得浸膏20g，剩余物用300mL乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂得浸膏g，剩余物用 300mL正丁醇萃取3次得浸膏30g。将石油醚部分浸膏用20g硅胶(100-200目)拌样，300g 硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90°C )乙酸乙酯(10 1-2 1)进 行梯度洗脱，500mL为一流份，回收溶剂，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以5%的硫酸乙 醇溶液，加热显色后合并相同组分，得Fl(2g，10 l)、F2(3g，8 l)、F3(3g，6 l)、F4(3g， 2 1)四个组分。组分F2用3g硅胶(100-200目)拌样，40g硅胶(200-300目)上普通 玻璃层析柱，石油醚(60-90°C )乙酸乙酯(6 1)洗脱，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或 喷以5%的硫酸乙醇溶液，加热显色后合并相同组分得核桃素A 28mg ；组分F3用3g硅胶 (100-200目)拌样，20g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60_90°C )乙酸 乙酯(4 1)洗脱，得核桃素B 23mg。实施例4 核桃素A和核桃素B对肝癌细胞HepG2的体外细胞毒作用A、制备人肝癌细胞株IfepG2悬液0. 25%胰蛋白酶消化，用培养液配成8X104个细 胞/mL细胞悬液；接种细胞每孔100 u L接种于96孔板中；B、预培养37°C，5% C02及饱和湿度下培养24h ；C、将药物核桃素A和核桃素B 按0. 2,0. 4,0. 6,1. 2,1. 6、2. 0 y mol/mL浓度加药， 每孔100 U L，每个浓度设三个复孔。37°C，5% C02及饱和湿度下继续培养24h ；D、24h后，取出培养板，每孔加入50% (质量/体积)的三氯乙酸(TCA)50yL固定 细胞，TCA的终浓度为10%，加在每孔液面上，在4°C冰箱中放置lh ；培养板各孔用去离子水 洗涤5次，去除TCA，在空气中干燥后，每孔加0. 4%的SRBlOOii L，室温下放置10 30min， 弃去各孔内液体后用1 %乙酸洗涤5次，去除未结合的染料，空气中干燥后用pH为10. 5， 10mmol/L三羟甲基胺基甲烷溶解，在平板振荡器上振荡5min，在酶联免疫检测仪490nm波 长下测定0D值，用空白对照调零，将所获肿瘤细胞生长抑制率定义为药物对肿瘤细胞的体 外抑制率。测定将药物核桃素A和核桃素B的IC5(1分别为0. 023 u mol/mL(8. 198 u g/mL) 和 0. 151 u mol/mL(46. 810 u g/mL)
权利要求
一种具有抗癌活性的核桃素，其特征在于该核桃素为二芳基庚烷类化合物，具有C20H22O3的分子式，化学结构式如式IIF2009101596482C00011.tif
2.根据权利要求1核桃素的制备方法，其特征在于该方法包括原料采集加工、浸膏提 取、分离纯化三个步骤Α、原料采集加工采集核桃青皮或核桃枝叶，干燥，粉碎；B、浸膏提取采用70-95V/V%Z醇对原料冷浸或回流热提得总浸膏；C、分离纯化总浸膏用水混悬，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行液液分配萃取得 到Fa、Fb、Fc三个组分；FA组分用石油醚和乙酸乙酯以不同体积比例混和组成的溶剂，按极 性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱分离，收集极性范围在8 1和6 1的两个 组分Fai和Fa2 ;FA1和Fa2分别以石油醚和乙酸乙酯按体积比6 1和4 1组成的混和溶 剂重新进行柱色谱分离，通过Fai得到式I核桃素粗品，Fa2得到式II核桃素粗品；以石油醚 和乙酸乙酯按体积比2 1组成的混和溶剂重结晶得到核桃素；所述式I具有C21H24O5的分 子式，化学结构式如式I<formula>formula see original document page 2</formula>
全文摘要
本发明公开了一种具有抗癌活性的核桃素及其制备方法。本发明从核桃青皮或者核桃枝叶中提取分离出来一种新核桃素化合物，核桃素为二芳基庚烷类化合物，具有C21H24O5和C20H22O3分子式，通过药理实验表明核桃素具有较好的抗癌活性，有望开发成以核桃素为原料的抗癌新药。
文档编号C07D307/77GK101824013SQ200910159648
公开日2010年9月8日 申请日期2007年4月4日 优先权日2007年4月4日
发明者柳军玺, 邸多隆, 黄新异 申请人:中国科学院兰州化学物理研究所