专利名称：抗生素药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗生素药物。具体地，本发明提供了(3S，5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环丙基-l,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐，及其用途。
细菌性病原体正对公众健康造成威胁。实际上，由于抗生素耐性菌株的普 遍，用常规抗生素疗法治疗细菌感染越来越困难。例如，尽管结核病己经是容 易治疗的，但其致病因数结核病分枝杆菌感染了将近三分之一的人口。实际上， 世界卫生组织将结核病定位全球性急症。抗生素耐性菌株也是生物恐怖主义的 潜在治疗剂。
因此，需要开发出新的抗生素药物。
发明概述
本发明内容之一是化合物1即下式所示7-((33,5尺)-3-氨基-5-甲基呱啶-1-基)-1-环丙基-8-甲氧基-4-氧代-1，4-二氢喹啉-3-羧酸的苹果酸盐
化合物l。
在该盐中，苹果酸可以是D-苹果酸、L-苹果酸或它们的混合物，且苹果酸 与化合物l的比例可以是l:l。
所述盐可以呈溶剂合物形式，其中，盐与药学上可接受的溶剂，如水、乙 醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺形成复合物。 一个例子是(3S，5R)-7-[3-
背景技术：
氨基-5-甲基-呱啶基]小环丙基-l，4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的半水合
苹果酸盐。
本发明的另一内容是用上述苹果酸盐治疗细菌感染的方法。 本发明还包括含有上述苹果酸盐和药学上可接受的载体的用于治疗细菌感
染的组合物，以及这种组合物在制造用于治疗细菌感染的药物中的应用。
具体地，在本发明的第一方面，提供了 (35，511)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-1-
环丙基-l,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐。
在另一优选例中，所述苹果酸是D-苹果酸、L-苹果酸、或D，L-苹果酸。 在另一优选例中，苹果酸与(3S，5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环丙基-l,4-
二氢-S-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的比例为1:1 。 在另一优选例中，所述盐呈水合物形式。
在另一优选例中，所述盐为(33,511)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-1-环丙基-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的半水合苹果酸盐。
在另一优选例中，苹果酸与(3S,5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环丙基-l,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的比例为1:1。更佳地，所述苹果酸是D-苹 果酸、L-苹果酸、或D,L-苹果酸。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，其包含(3S,5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环丙基-l，4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐和药 学上可接受的载体。
在另一优选例中，还包含(33,53)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环丙基-l，4-二 氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐。
在另一优选例中，(3S，5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环丙基-l，4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐与(3S,5S)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环 丙基-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐的比例为约1:1。
在本发明的第三方面，提供了本发明第一方面中所述的(33,5^-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环丙基-l,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐的用 途，它被用于制备治疗微生物感染的药物。
在另一优选例中，所述微生物感染是金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺 炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌或淋病奈瑟菌所引起的感染。
在另一优选例中，所述微生物感染是甲氧苯青霉素-耐性金黄色葡萄球菌、 甲氧苯青霉素-耐性表皮葡萄球菌(&ap /ococc^印/Aww'cfc)、喹诺酮-耐性金 黄色葡萄球菌、外排相关性耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌、异万古霉素-中 等耐药金黄色葡萄球菌、万古霉素-中等耐药金黄色葡萄球菌、万古霉素-耐性 金黄色葡萄球菌、青霉素-耐性肺炎链球菌、氟喹诺酮-耐性肺炎链球菌或多耐 药性肺炎链球菌所引起的感染。
在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性抑制微生物生长的方法， 所述方法包括步骤将本发明第一方面中所述的(3S，5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶 基]-l-环丙基-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐，或第二方面中 所述的组合物适用于所述微生物，从而抑制其生长。
在另一优选例中，所述微生物是金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺炎链 球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌或淋病奈瑟菌。
在另一优选例中，所述微生物是甲氧苯青霉素-耐性金黄色葡萄球菌、甲氧 苯青霉素—耐性表皮葡萄球菌(Sto; /^/ococc^印/cterm/fifo)、喹诺酮-耐性金黄色 葡萄球菌、外排相关性耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌、异万古霉素-中等耐 药金黄色葡萄球菌、万古霉素-中等耐药金黄色葡萄球菌、万古霉素-耐性金黄 色葡萄球菌、青霉素-耐性肺炎链球菌、氟喹诺酮-耐性肺炎链球菌或多耐药性 肺炎链球菌。
在本发明的第五方面，提供了一种治疗微生物感染的方法，所述方法包括 给予有此需要的对象有效量的本发明第二方面中任一所述的组合物。
在另一优选例中，所述微生物感染是金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺 炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌或淋病奈瑟菌所引 起的感染。
在另一优选例中，所述微生物感染是甲氧苯青霉素-耐性金黄色葡萄球菌、 甲氧苯青霉素-耐性表皮葡萄球菌(&ap/^/ococc附印Wemn'cfo)、喹诺酮-耐性金 黄色葡萄球菌、外排相关性耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌、异万古霉素-中 等耐药金黄色葡萄球菌、万古霉素-中等耐药金黄色葡萄球菌、万古霉素-耐性 金黄色葡萄球菌、青霉素-耐性肺炎链球菌、氟喹诺酮-耐性肺炎链球菌或多耐药性肺炎链球菌所引起的感染。
下面的描述中给出了本发明一些实施方式的详细描述。本发明的其它特征、 目的和优点通过描述以及权利要求是显而易见的。
概述
我们可釆用常规方法首先合成化合物1，即7-((3S,5R)-3-氨基-5-甲基呱啶-l-基)-l-环丙基-8-甲氧基-4-氧代-l,4-二氢喹啉-3-羧酸，然后用苹果酸处理该化合 物，从而制备上述苹果酸盐。后文实施例1列举了制备苹果酸盐的合成方法。
制得的化合物1的苹果酸盐可通过快速柱层析、高效液相色谱、结晶或任 何其它合适方法进一步纯化。
上述盐能抑制诸如金黄色葡萄球菌CStop/^/ococc"s flt/化t/力、绿脓假单胞菌 (尸sew(iowowas1 aen/g7wara)、月巿炎链球菌(5^印tococcw51 / "ewwom'ae)、 类肠球菌 (五"/eracocctw y^ecafe)、 屎肠球菌(五"teracoccw51 yhec/訓)、流感嗜血杆菌 (//aewop/n'/ws /"y7i/ewzae)、 大肠杆菌(E^c/ er/c/z/a co/z')禾口淋病奈瑟菌(A^/MeHa go"orMo^e)之类的细菌。因此，本发明的涉及通过给有此需要的对象施用有 效量的所述盐来治疗细菌感染的方法。此外，该盐可用于治疗药物不敏感性细 菌造成的感染，所述细菌如甲氧苯青霉素-耐性金黄色葡萄球菌、喹诺酮-耐 性金黄色葡萄球菌、外排相关行(efflux-related)甲氧苯青霉素-耐性金黄色葡萄 球菌、中等耐异万古霉素(hetero vancomycin)金黄色葡萄球菌、中等耐万古霉 素金黄色葡萄球菌、万古霉素-耐性金黄色葡萄球菌、青霉素-耐性肺炎链球菌、
氟喹诺酮-耐性肺炎链球菌或多耐药性肺炎链球菌。
术语"有效量"指为对象提供所需治疗效果所需的活性物质的量。如本领域
技术人员所知，有效量可根据给药途径、使用的赋形剂、以及与可能存在的联 用药物而改变。术语"治疗"指给患有上述感染、或有所述感染的症状、或有受 感染倾向的物件施用活性物质，从而治疗、治愈、缓解、减轻、改变、修复、 改善、改进或影响感染、感染症状、或受感染倾向。术语"不敏感的"在文中是 指能够耐受药物的中值剂量至全剂量。例如，甲氧苯青霉素-不敏感菌可以是 甲氧苯青霉素-耐性菌或中等耐甲氧苯青霉素菌。
为实施本发明方法，所述苹果酸盐可经口服、肠胃外、通过吸入喷雾或通过植入型药库来施用。术语"肠胃外"在文中包括皮下、皮内、静脉内、肌内、 关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或灌输技术。
口服组合物可以是任何口服可接受的剂型，其中包括但不限于片剂、胶 囊、乳剂以及水性悬浮液、分散液和溶液。片剂通常使用的载体包括乳糖和玉 米淀粉。片剂还可加有润滑剂，如硬脂酸镁。对口服胶囊来说，有用的稀释剂 包括乳糖和干玉米淀粉。对口服水性悬浮液或乳剂来说，活性成分可悬浮于或 溶于混合了乳化剂或悬浮剂的油相中。如果需要可加入某些甜味剂、调味剂或 染色剂。
可按照本领域已知技术用合适的分散剂或润湿剂(例如吐温80)和悬浮剂配 制无菌可注射组合物(例如水性或油性混悬液)。所述无菌可注射制品还可以是 无毒胃肠外可用稀释剂或溶剂(例如1,3-丁二醇溶液)配制备的无菌可注射溶 液或混悬液。可用的可接受运载体和溶剂有甘露醇、水、林格液和等渗氯化钠 溶液。此外，无菌的非挥发油也是常用的溶剂或悬浮介质(例如合成的单酸甘 油酯或甘油二酯)。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用于可注射制品， 天然的药学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，特别是它们的聚氧乙基化形式， 也可用于可注射制品。这些油溶液或混悬液还可含有长链醇类稀释剂或分散 剂，或羧甲基纤维素或类似的分散剂。
可按照药物制剂领域熟知的技术制备吸入组合物，所述组合物可制备成盐 水溶液，而且，如本领域所知，可采用苄醇或其它合适的防腐剂、用以增强生 物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它增溶剂或分散剂。
可将局部组合物配制成油、乳膏、洗液、软膏等形式。用于此类组合物的 合适载体包括植物油或矿物油、白凡士林(白软石蜡)、支链脂肪或油、动物脂 肪和高分子量醇类(大于C12)。优选的是可溶解活性成分的那些载体。组合物
中还可包含乳化剂、稳定剂、湿润剂和抗氧化剂，如果需要还可包含着色物质 或添香物质。此外，这些局部制剂中还可使用透皮渗透促进剂。这种促进剂的
例子见于美国专利3,989,816和4,444,762。优选用矿物油、自乳化蜂蜡和水的 混合物配制乳膏，在该混合物中混合有溶解于少量油(例如杏仁油)中的活性成 分。例如，此类乳膏可包含约40份水、约20份蜂蜡、约40份矿物油和约1 份杏仁油。将活性成分的植物油(例如杏仁油)溶液与温热的软石蜡混合，然后让该混合物冷却可配制成软膏。例如，此类软膏可包含约30重量％杏仁(油) 和约70重量％白软石蜡。
药物组合物中的载体必须是"可接受的"意味着其与制剂的活性成分兼容 (优选能稳定该制剂)并且对待治疗对象无害。例如，可利用增溶剂，如环糊精(其 与萃取物的一种或多种活性化合物形成特定的、溶解度更高的络合物)作为递 送活性成分的药物赋形剂。其它载体的例子包括胶体二氧化硅、硬脂酸镁、纤
维素、月桂基硫酸钠和D&C Yellow # 10。
前为所述化合物1的苹果酸盐可与同分异构盐，如WO 2007/110836中描述 的(3S,5S)-3-氨基-5-甲基呱啶-1-基)-1-环丙基-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(化合物l，)的苹果酸盐，以任何比例(如，i:i)一起使用。化合物r的结构 如下所示
可采用合适的体外试验初步评估上述化合物1的苹果酸盐抑制细菌生长的 效力。还可通过体内试验进一步测试所述化合物治疗细菌感染的效力。例如， 可将所述化合物给予受感染的动物(例如，小鼠模型)来评估其疗效。然后可根 据这些结果确定合适的剂量范围和给药途径。
无需其它细节，据信根据以上描述已能充分实施本发明。因此，以下具体 的实施例只应理解成说明性，而不是以任何方式限制本发明的其余部分。本文 引用的所有出版物，包括专利全文以引用的方式纳入本文。
化合物r合成化合物1的苹果酸盐
下图显示了一例该盐的合成途径 ，
<formula>formula see original document page 10</formula>
(1) (25)-5-氧代-卩比咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯2-甲酯(化合物3)。
在〈30。C，边搅拌边焦谷氨酸(15.0g)的甲醇(60.0mL)悬浮液中加入亚硫 酰氯(27.6 g)。 1小时后HPLC显示反应完全。减压除去溶剂，将残余物溶于乙 酸乙酯(200 mL)。在〈30。C缓慢加入三乙胺(13.5 g)，然后将混合物过滤。在 滤液中一次性加入DMAP (1.5 g),然后在< 30。C加入Boc20 (27.8 g)。 HPLC显示 反应完全之后将混合物冷却至0。C，并在〈30。C加入lNHCl(13.0mL)，搅拌10 分钟。分离出有机层，用H2O(20.0mL)洗涤并减压蒸发。然后，在所得残余物 中加入叔丁基甲基醚(27.0 mL)，边搅拌边冷却至0。C。滤出缓慢沉淀出的结晶 得到化合物3(21.9g， 77.3%)。
(2) (2&状)-4-甲基-5-氧代-卩比咯垸-1，2-二羧酸1-叔丁酯2画甲酯(化合物4)。在3L烧瓶中加入化合物3 (103.6 g)的无水THF (1200.0 mL)溶液。然后在氮 气氛下将反应混合物冷却至-72。C。将1.0 M LHMDS的THF (440.0 mL)溶液冷却 至-10。C，并以一定速度将其加入反应混合物，加入速度控制为维持溶液温度 为《64。C。加完之后，反应混合物在〈-65。C保温45分钟，同时搅拌。然后在< -65。C滴加碘代甲垸(65.7 mL)，并在<-72。C搅拌2小时。使混合物升温至环境 温度并搅拌3小时。加入乙酸(38.9 mL)的THF (300.0 mL)溶液以终止反应。减 压除去溶剂，依次加入H20 (700.0 mL)和乙酸乙酯(500.0 mL)并搅拌10分钟。 分离出含水层用乙酸乙酯(300.0mL)萃取。减压蒸发合并的有机层得到化合物
4 (139.8 g)。
(3) (1&3/ )-4-羟基-1-羟甲基-3-甲基-丁基)-氨基甲酸叔丁酯(化合物5)。 在烧瓶中加入化合物4 (50.0 g)的THF (400.0 mL)溶液，在氮气下将溶液搅
拌冷却至0。C。以一定速度分批加入NaBH4 (22.0 g)以维持溶液温度介于-5至 5°C，然后在此温度下滴加无水乙醇(100.0 mL)。将反应混合物在-5到5°C保 温5小时，然后升至室温并继续搅拌过夜。TLC显示反应完全后将反应物冷却 至5-15。C。缓慢加入乙酸(37.0mL)以维持反应物温度为5-15。C直到pH-5。 然后在混合物中加入H20 (100.0 mL)，搅拌IO分钟，然后加入乙酸乙酯(150.0 mL)，搅拌10分钟。含水层用乙酸乙酯(75.0mL)萃取。将有机层合并到一烧 瓶中。然后向该烧瓶中加入饱和盐水(150.0mL)并搅拌，然后加入碳酸钠(14.5 g) 使得pH〉7。分离出的有机层用盐水(150mLx2)洗涤并减压蒸发。在残余物 中加入乙酸乙酯(100.0 mL)和甲苯(100.0mL)，继续减压蒸发除水得到化合物
5 (41.2 g， 90.9%)。
(4) (2&4/ )-甲磺酸2-叔丁氧基羰基氨基-5-甲磺酰氧基-4-甲基-戊基酯(化 合物6)。
在氮气氛下将化合物5(40.8g)的乙酸乙酯(347.0 mL)溶液冷却至0。C。在 0士5。C，滴加三乙胺(70.7g)和甲磺酰氯(59.8 mL)。反应溶液在0士5。C搅拌 1小时。TLC显示反应完全后，边搅拌边加入饱和碳酸氢钠溶液(350.0 mL)。 分离出有机层并减压蒸发得到化合物6 (66.7 g， 97.9%)。
(5) (3&5及)-3-(叔丁氧基羰基氨基)-5-甲基-^苄基-呱啶(化合物7)。 将苄胺(57.8 g)加入烧瓶中并在氮气氛下加热至45。C。在该烧瓶中滴加分散在二甲氧基乙烷(65.0mL)中的化合物6(65.7g)。滴加期间反应物温度维持 在约50 ± 5。C。在该温度下搅拌过夜，然后加入碳酸钾(32.8 g)的水(200.0 mL) 溶液。将混合物冷却至室温，加入乙酸乙酯(300.0 mL)。分离出有机层，用1120 (200.0 mLx2)洗涤，减压蒸发。残余物进行硅胶柱层析，用l:14乙酸乙酯/庚烷 作为洗脱液，得到油状产物7。 MS(CI): 305.1;
'H-NMR (300 MHz， CDC13): 7.20-7.35 (m， 5H)， 4.27(d， 1H)， 3.66(m， 1H)， 3.52(d， 1H)， 3.46(d， 1H)， 3.05(dd, 1H)， 2.73(dd, 1H)， 1.97(dd， 1H), 1.74(m， 1H)， 1.56(dd， 1H)， 1.51(ddd， 1H)， 1.41(s， 9H)， 0.65(ddd， 1H)， 0.84(d， 3H)。
(6) (3S，5R)-3-淑丁氧基羰基氨基)-5-甲基呱啶(化合物8)。 将化合物7 (4.8 g)、活性碳(0.5 g)和甲醇(100.0 mL)的混合物搅拌0.5小
时，然后过滤。将滤液转移至加氢烧瓶并加入碳载钯(7.5%， 1.0 g)。真空除去 烧瓶内的空气并用氢气替换，重复数次。然后将混合物升温至45丄5。C并在氢 气下搅拌36小时。将混合物过滤，滤液经减压蒸发得到化合物8 (2.9 g， 85.8%)。 MS (CI): 215.1 (M+l);
拉曼光谱(cm力3324， 3177， 3100-2700， 1698， 1550， 1291， 1246， 1173;
'H-NMR(300MHz， CDC13): 4.30 (d， 1H)， 3.40 (m， 1H)， 3.20 (dd， 1H)， 2.91 (dd， 1H)，2.01(dd， 1H)， 2.11 (m， 1H)， 1.60(dd， 1H)， 1.51 (ddd， IH)， 1.39 (s， 9H)， 0,76(ddd， 1H), 0.82 (d， 3H);
13C-NMR(75MHz， CDC13): 155.2， 79.3， 53.5， 51.9， 48.8， 40.8， 32.5， 28.4， 19.1。
(7) l-环丙基-7-氟-8-甲氧基-4-氧代-l，4-二氢-喹啉-3-羧酸的硼酸酯(boron ester)(化合物9):
在反应容器内加入氧化硼(2.0 kg, 29mol)、冰醋酸(8.1 L, 142mol)和醋 酸酐(16.2 L， 171 mol)。所得混合物回流至少2小时，然后冷却至40°C，在 此温度下加入1-环丙基-7-氟-8-甲氧基-4-氧代-l,4-二氢-喹啉-3-羧酸(14.2 kg， 51 mol)。将混合物再回流至少6小时，然后冷却至约90。C。在反应物中加入 甲苯(45 L)。在50。C加入叔丁基甲基醚(19L)引发沉淀。然后将混合物冷却至20°C，过滤分离沉淀。分离出的固体用叔丁基甲基醚(26 L)洗涤，然后在 烘箱内4(TC真空(50托)干燥，由此得到化合物9，产率为86.4%。
拉曼光谱(cm.1): 3084,7， 3022.3， 2930.8， 1709,2， 1620.8， 1548.5， 1468.0， 1397.7， 1368.3， 1338.5， 1201.5， 955,3， 653.9， 580.7， 552.8， 384.0， 305.8;
'HNMR(CDC13， 300 MHz) 5: 9.22 (s， 1H)， 8.38-8.33 (m， 1H)， 7.54 (t， 7=9.8 Hz， 1H)， 4.38-4.35 (m， 1H)， 4.13 (s， 3H)， 2.04 (s, 6H)， 1.42-1.38 (m， 2H)， 1.34-1.29 (m， 2H)。
(8) 7-((3&5i )-3-氨基-5-甲基呱啶-l-基)-l-环丙基-8-甲氧基-4-氧代-l，4-二 氢喹啉-3-羧酸(化合物1)。
将含化合物8 (2.0 g)、化合物9(4.2g)和三乙胺(3.9mL)的乙腈(32.0 mL) 溶液加热至50。C，搅拌至少2小时，同时通过HPLC监测反应。此后，将重 新冷却的溶液减压蒸馏。将残余物冷却至25。C,然后缓慢加入3.0N氢氧化钠 溶液(由9.3 g 30% NaOH力卩16 mL蒸馏水配制)。通过HPLC监测反应。此后， 在50。C减压蒸馏重新冷却的溶液。将残余物冷却至25。C,加入乙酸(2.5 g)将 pH调至8.0。然后，搅拌加入二氯甲烷(80.0 mL)。减压蒸馏分离出的有机层， 然后加入盐酸溶液(12.2 g， 30%)。反应混合物在35。C搅拌加热12小时，同时 通过HPLC监测反应。此后，将反应混合物冷却至25。C并滤出沉淀。将沉淀 溶于5(TC的水(40.0mL)，用氢氧化钠水溶液(3.0 g， 30%)中和至pH = 7.9。将 沉淀滤出，在5(TC真空干燥24小时，得到化合物1 (2.9 g， 82.9%，纯度99.9%)。
(9) 7-((3S，5R)-3-氨基-5-甲基呱啶-l-基)-l-环丙基-8-甲氧基-4-氧代-l，4-二 氢喹啉-3-羧酸半水合D，L-苹果酸盐(化合物1的苹果酸半水合物)。
将乙醇(14mL)和纯水(9.8mL)混合并加热至60士2。C。在溶液中加入化 合物l(2.8g)、 d-苹果酸(1.0g)和活性碳(0.13g)。在上述温度下搅拌10分钟 后将混合物过滤。将滤液冷却至0士2。C并搅拌30分钟以得到沉淀，沉淀在 45士2。C下真空干燥2小时得到所需的盐(2.5 g， 64.7%,纯度98.9%)。
MS(CI): 372.0 (M+l);
拉曼光谱(cm"): ~3438， 3100-2700， 1729， 1618. 1520， 1443， 1258; )H-薩R (300 MHz， CDC13)5: 8.67(s， 1H)， 7.63(d， 1H)， 7.15(d， 1H)， 4.24(dd， 1H)， 4.12(m， 1H)， 3.97(m， 1H)， 3.64(s， 3H)， 3.57(dd, 1H)， 3,47(dd，1H)， 2.71(dd， 1H)' 2.69(dd， 1H)， 2.51(dd, 1H)， 2.41(dd， 1H)， 2.13(m， 1H)， 1.92(ddd, 1H)， 1.12(ddd， 1H)， 1.12， 0.90(m， 4H)， 0.90(d， 3 H);
13C-NMR (75 MHz， CDC13): 178.9， 177.6， 176.2， 169.2， 150.8， 150.3， 141.5， 136.6， 121.4， 120.0， 119.3， 105.3， 68.5， 60.3， 56.4, 52.0， 47.8， 41.6， 40.0， 36.7， 29.7， 17.8， 8.9，禾卩8.9。
合成化合物r的半水合苹果酸盐
化合物l'的半水合苹果酸盐是参照WO 2007/110836所述方法制备的。
实施例2:
微
测定了化合物i的苹果酸盐和化合物r的苹果酸盐以及巻须霉素对8种
ATCC参考菌株(即大肠杆菌(E co//) ATCC 25922，绿脓假单胞菌(尸aen/gz'wosa) ATCC 27853，金黄色葡萄球菌(S. ATCC 29213，粪肠球菌(五./aeca/的
ATCC 29212，肺炎链球菌(S. p"ewmom'ae) ATCC 49619，流感嗜血杆菌(//. ,'"y7Me"zae) ATCC 49247，流感嗜血杆菌(//. /"y wenzae) ATCC 49766，和淋病奈 瑟菌(iV. go"wT/zoeae) ATCC 49226)以及10种临床菌株(即两株金黄色葡萄球 菌(51. aweay)、 一株粪肠球菌(f./aec"//5)、 一株屎肠球菌(五./"ec^m)、两株大肠 杆菌(￡. co//)、两株绿脓假单胞菌(P aen/g/mwfl)和两株流感嗜血杆菌(//. /"y/we"加e))的抑制作用。
按照临床和实验室标准协会(CLSI， Clinical and Laboratory Standards Institute)的指南采用肉汤微量稀释法测定最低抑制浓度(MIC)。参见，例如， "Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacterial That Grow Aerobically(需氧菌的稀释抗菌剂易感性检测方法)"CLSI 2006，批准的标准方 法，第7版，M7-A7;禾口"Performance standards for Antimicrobial Susceptibility Testing(抗菌剂易感性检测的性能标准)"CLSI 2007，第17次报告增刊， M100-S17。注意，对于淋病奈瑟菌，由于没有CLSI推荐的特定肉汤微量稀释 法(BMD)，采用了推荐用于脑膜炎奈瑟菌(TV. mem'"gto)的BMD法。
将三种化合物中的分别溶于水，然后无菌过滤制备成原液。原液分成小份 于-2(TC储存。敏感性检测之前，各原液用肉汤培养基稀释成2X原液，其浓度 是最终工作浓度的两倍。以每孔50 pi将2X原液分配到96孔微板中。微板在加液后立即使用或在于-8(tc储存备用。
为进行检测，所有细菌的冻存分离株取少量进行亚培养，流感嗜血杆菌和 淋病奈瑟菌在巧克力平板上亚培养，其余均在绵羊血琼脂上亚培养。所有平板
培养基购自BBL (BD微生物学系统(Becton Dickinson Microbiology System),考 克威尔(Cockeysville)，马里兰州)。抗微生物剂敏感性检测前一天，所有细菌经 再次亚培获得新鲜的起始培养物。检测时，Mueller-Hinton肉汤(MHB，揣克 诊断(Trek Diagnostics),西艾塞克斯(West Essex),英格兰)用于大肠杆菌、绿脓 假单胞菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌；含3。/。溶胞马血的MHB (MHBHB)用 于检测肺炎链球菌和淋病奈瑟菌；嗜血杆菌检测培养基肉汤(HTM)用于检测 流感嗜血杆菌。
检测当天，首先从新鲜亚培平板上获取每种细菌制成0.5 McFarland悬浮液。 大肠杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的0.5 McFarland悬浮 液用水制备，而淋病奈瑟菌和肺炎链球菌的0.5 McFarland悬浮液用MHB制备， 流感嗜血杆菌的0.5 McFarland悬浮液用HTM制备。然后取100微升各悬浮液 按需转移各自到10 ml MHB、MHBHB或HTM中制成lx106 CFU/ml的悬浮液。 然后将悬浮液分配到前述96孔微板(每孔50 nl)。所有平板在环境空气下35°c 培育过夜，仅淋病奈瑟菌在5% C02下培育。培育时间和条件与CLSI指南中 所述相同。取满满一接种环的最终接种物进行各分离株的纯度检测。
结果显示，化合物1的苹果酸盐对各测试菌株的MIC低于巻须霉素或与之 相当，表明该化合物能有效抑菌。与化合物l，的苹果酸盐相比，化合物l的苹 果酸盐在抑制某些金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和绿脓假单胞菌菌株方面更 加有效。
#鰣微
检测了化合物i的苹果酸盐、化合物r的苹果酸盐以及上述两者的混合 物抑制巻须霉素-耐性金黄色葡萄球菌和左氧氟沙星-耐性肺炎链球菌的功效。 用肉汤微量稀释法测定mic。
化合物i的苹果酸盐、化合物r的苹果酸盐、这两者的混合物、巻须霉
素(CIP)和左氧氟沙星(Levo)的MIC5o和MIC9o值示于下表细菌MIC5oCMIC9o)， ug/mL化合物r (3S,5S)化合物1 (3S,5R)化合物l+r (1:1 w/w)CIPLsvo
M雄-CIP (R)1.0 (2.0)1.0(1.0)1.0(1.0)64-
細&4-CIP (S)0.03 (0夠0.03 (0.06)0.03 (0夠0.5—
iS.pwewwo-Levo (R)0.5 (2.0)0.25 (1.0)0.5(1.0)->128
iS.pwe,o-Levo (S)0.06 (0.06)0.03 (0.06)0.06 (0.06)-16
CIP:巻须霉素 Levo:左氧氟沙星
M兄W-CIP (R): MW/1-巻须霉素耐性菌株的临床分离株 M S+CIP (S): A^W-巻须霉素敏感性菌株的临床分离株
S.p"ewmo-Levo (R):肺炎链球菌(S. p"ewmo"!'ae)左氧氟沙星耐性菌株的临床分离株 S.pwrawo-Levo (S):肺炎链球菌CS. p"ewmom'ae)左氧氟沙星敏感性菌株的临床分离株
如上表所示，在检测的样品中，化合物1的苹果酸盐以及化合物1和l，两 者的苹果酸盐的混合物抑制巻须霉素-敏感性和耐性金黄色葡萄球菌以及左氧 氟沙星-敏感性和耐性肺炎链球菌最有效。
微动力学银究
将化合物1的苹果酸盐和化合物l'的苹果酸盐分别溶于pH约4.5的含0.7% 乳酸和3%右旋糖的水溶液以及pH约5.4的2.5% L-谷氨酸水溶液制成用于药 代动力学研究的溶液。
在戊巴比妥麻醉状态下在300-400克重的雄性Sprague-Dawley大鼠 (BioLASCO台湾公司，台北，台湾)的颈静脉内手术植入聚乙烯(PE-50)套管用 以釆集血样，由此制成动物模型，备第二天之用。通过2.5 mg/kg剂量静脉内 注射(IV)(N-3)或通过5 mg/kg剂量口饲(PO)(N-4)用化合物1或化合物l'的溶 液处理大鼠。剂量水平是基于化合物的游离碱形式计算的。PO研究中，大鼠 被禁食一夜，但可随意饮水，然后在第二天给药。在给药前5、 10(仅IV)、 15 和30分钟以及给药后1、 2、 4、 6、 8、 12和24小时采集动物的无菌血样，并 离心获得肝素化血浆。通过液相色谱-质谱分析(MDS SCIEX， API 3000,应用 生物系统(AppliedBiosystems)，力B州，美国)测定血浆中待测化合物的浓度，分析的定量下限为2ng/mL。
通过非房室模型分析采用WinNonlin (版本4.0，法赛公司(Pharsight),力口州，
美国)评估各项标准药代动力学参数。通过线性梯形法则计算浓度-时间曲线的 从给药到无限远处的曲线下面积(AUC((Wnf))。 口服生物利用度(。/。F)由经剂量校 正的大鼠的口服给药后血浆接触量与静脉给药后血浆接触量之比来计算，公式 如下
% F = (AUCp。/AUC,v) x (Div/Dpo) x画％ 其中，D是剂量，AUC是血浆浓度-时间曲线从O到无限远的曲线下面积。 IV注射化合物1的苹果酸盐，终末半衰期(t^)以及从给药到无限远的曲线 下面积(AUC(o-的)分别为2.466 ±0.801小时和1.530 ± 0.066 ngxh/mL。 PO给予 化合物1的苹果酸盐，终末半衰期01/2)、最大浓度(C皿x)、达到最大浓度的时间
(Tmax)以及从给药到无限远的曲线下面积(AUC(o-,nf))分别为3.581 ± 1.704小时、
0.622 ±0.170 )ig/mL、 0.250 ± 0.000小时和1.404 ± 0.464 ng x h/mL。
结果显示，化合物1的苹果酸盐的口服生物利用度(％ F)为45.9 ±15.2 %， 而化合物l'的苹果酸盐的口服生物利用度(。/。F)为13.2 ±3.3%。因此，口服
给予化合物1的苹果酸盐比口服给予化合物r的苹果酸盐更加有效。
其它实施方式
本说明书披露的所有特征可以任意组合。起到相同、等价或相似目的的其 它特征可以替代本说明书中披露的各特征。因此，除非另有专门表述，否则披 露的各特征只是一系列普通等价或相似特征的例子。
鉴于以上描述，本领域技术人员不难确定本发明的基础特征，他们能对本 发明作出各种改变和改进以适用于各种用途和条件，却不脱离本发明的构思和 范围。因此，其它实施方式也属于以下权利要求书的范围。
权利要求
1.(3S，5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-1-环丙基-1，4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐。
2. 如权利要求1所述的盐，其特征在于，苹果酸与(3S,5R)-7-[3-氨基-5-甲 基-呱啶基]-l-环丙基-l,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的比例为1:1。
3. 如权利要求l所述的盐，其特征在于，所述盐呈水合物形式。
4. 如权利要求3所述的盐，其特征在于，所述盐为(3S，5R)-7-[3-氨基-5-甲 基-呱啶基]-l-环丙基-l，4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的半水合苹果酸盐。
5. 如权利要求4所述的盐，其特征在于，苹果酸与(3S,5R)-7-[3-氨基-5-甲 基-呱啶基]-l-环丙基-l,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的比例为1:1。
6. 如权利要求l所述的盐，其特征在于，所述苹果酸是D-苹果酸。
7. 如权利要求l所述的盐，其特征在于，所述苹果酸是L-苹果酸。
8. 如权利要求l所述的盐，其特征在于，所述苹果酸是D，L-苹果酸。
9. 如权利要求5所述的盐，其特征在于，所述苹果酸是D-苹果酸。
10. 如权利要求5所述的盐，其特征在于，所述苹果酸是L-苹果酸。
11. 如权利要求5所述的盐，其特征在于，所述苹果酸是D,L-苹果酸。
12. —种药物组合物，其包含(3S,5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环丙基 -1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐和药学上可接受的载体。
13. 如权利要求12所述的药物组合物，还包含(3S,5S)-7-[3-氨基-5-甲基-呱 啶基]-l-环丙基-l,4-二氢-8-甲氧基斗氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐。
14. 如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，(3S,5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环丙基-l,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐与 (3S，5S)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环丙基-l,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹琳羧酸的苹果酸盐的比例为约1:1。
15. 如权利要求1-11中任一所述的(3S,5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环 丙基-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐的用途，其特征在于， 用于制备治疗微生物感染的药物。
16. 如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述微生物感染是金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、流感嗜血杆菌、 大肠杆菌或淋病奈瑟菌所引起的感染。
17. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述微生物感染是甲氧苯青 霉素-耐性金黄色葡萄球菌、甲氧苯青霉素-耐性表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、喹诺酮-耐性金黄色葡萄球菌、外排相关性耐甲氧苯青霉素金黄 色葡萄球菌、异万古霉素-中等耐药金黄色葡萄球菌、万古霉素-中等耐药金黄 色葡萄球菌、万古霉素-耐性金黄色葡萄球菌、青霉素-耐性肺炎链球菌、氟喹 诺酮-耐性肺炎链球菌或多耐药性肺炎链球菌所引起的感染。
18. —种体外非治疗性抑制微生物生长的方法，其特征在于，所述方法包 括将权利要求1-11任一所述的(3S,5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-l-环丙基 -1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐，或权利要求12-14中任一所 述的组合物适用于所述微生物，从而抑制其生长。
19. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述微生物是金黄色葡萄球 菌、绿脓假单胞菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、流感嗜血杆菌、大肠 杆菌或淋病奈瑟菌。
20. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述微生物是甲氧苯青霉素 -耐性金黄色葡萄球菌、甲氧苯青霉素-耐性表皮葡萄球菌CStop /ococc^ 卬ZArm^fo)、喹诺酮-耐性金黄色葡萄球菌、外排相关性耐甲氧苯青霉素金黄 色葡萄球菌、异万古霉素-中等耐药金黄色葡萄球菌、万古霉素-中等耐药金黄 色葡萄球菌、万古霉素-耐性金黄色葡萄球菌、青霉素-耐性肺炎链球菌、氟喹 诺酮-耐性肺炎链球菌或多耐药性肺炎链球菌。
全文摘要
本发明涉及抗生素药物。具体地，本发明提供了(3S，5R)-7-[3-氨基-5-甲基-呱啶基]-1-环丙基-1，4-二氢-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸的苹果酸盐。还披露了用有效量的这种盐治疗细菌感染的方法。
文档编号C07D401/00GK101628911SQ20091016046
公开日2010年1月20日 申请日期2009年7月14日 优先权日2008年7月15日
发明者波 施, 程宏逑, 许明珠, 邹先岩, 金其新, 陈文章 申请人:太景生物科技股份有限公司