专利名称：一种乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物的制备方法，由该方
法制得的乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物具有超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性。在制造过程当中进行超声波或热处理便以提高反应物的溶解性之最。获得的物质跟蛋白质性天然抗氧化酶区别，既稳定紫外线或热同时可保持长久。
背景技术：
活性氧气是老化的主要原因，而常见疾病之90%以上都跟活性氧气有关(参见Muller, F. L et al.; Trends in oxidative aging theories, Free Radic.Biol. Med. 43, 477-503, 2007,荷兰杂志)，其中主要疾病是指癌症、动&ja更化、糖尿病、心肌梗塞、肝炎、肾炎、帕金森氏病、胶原病、缺血、各种炎症等，还有由紫外线、放射线和各种化学物质引起的疾病(参见Waris, G. et al.;Reactive oxygen species: role in the development of cancer and variouschronic conditions, J. Carcinogen. 5， 14 - 22, 2006， 美国杂志)。活性氧气更是皮肤老化的主要原因(参见Bogdan Allemann， I. etal.; Antioxidantsused in skin care formulations, Skin Therapy Lett. 13， 7， 5-8, 2008,加拿大杂志)。就是说，减少人体内的活性氧气有助于防止皮肤老化，同时在治疗疾病方面有着重要的意义(参见Beckman, K. B. et al.; The free radicaltheory of aging matures, Physiol. Rev. 78， 2. 547-581, 1998，美国杂志)。超氧化物歧化酶(SOD)是一种催化消除属于活性氧气的超氧化物的金属酶(参见 Fridovich, I.; Superoxide radical and superoxide dismutase， Ann.Rev. Biochem. 64， 97-112， 1995,美国杂志)，超氧化物歧化酶(SOD)关键作用在保护人体细胞的氧化损伤(由活性氧气的毒化)(参见McCord, J. M.;Human disease, free radicals and the oxidant and antioxidant balance,Clin. Biochem. 26， 3511 - 3571， 1993,荷兰杂志)。天然超氧化物歧化酶(SOD)自1969年^皮McCord和Fridovich首次发现。此后的研究表明其还具有抗炎症、抗癌症发生及转移、减少抗癌剂的对细胞的毒性和对心脏的毒性(参见0berley， L W. et al.; Role of superoxide dismutase in cancer: a review,Cancer Res. 39， 1141-1149， 1979，美国杂志)、防止缺氧组织里发生的再管流损伤(参见Fridovich, I"- Superoxide radical: an endogenous toxicant:Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 23, 239 - 257, 1983,美国杂志)，还有加上许多有关老化才几制和防止老化的报告(参见Tolmasoff, J. M. etal.;Superoxide dismutase: correlation with life—span and specific metabolicrate in primate species, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77， 2777 - 2781, 1980，美国杂志)。但是公知的超氧化物歧化酶(SOD)在利用方面还存在一些问题。主要体现现在稳定性差、成本高、分子量大，从而导致细胞吸收不好、会产生免疫反应等。其实对我们来说需要的是超氧化物歧化酶(SOD)的功能而不是超氧化物歧化酶(SOD)本身，因此具有超氧化物歧化酶(SOD)活性的低分子物质(SOD模拟物)相关研究被广泛关注(参见Henke, S丄；Superoxide dis咖tase mimicsas future therapeutics, Exp. Opin. Ther. Patents 9, 2, 169-180, 1999,英国杂志)。另外如果SOD模拟物还具有过氧化氢酶(CAT)活性的话，其应用范围将更加广泛。实际上超氧化物歧化酶(SOD)把超氧化物变成过氧化物，接着过氧化氬酶(CAT)把过氧化物分解成水，就完全实现无毒化。其实该两种抗氧化酶在地球上所有生物中都存在的。
发明内容
本发明的目的提供一种乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物的制备方法，由
该方法制得的乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物具有超氧化物歧化酶(SOD) 和过氧化氢酶(CAT)活性。
为解决前述技术问题，本发明所采用的技术方案是这样的 一种乙基双亚 氨基甲基愈创木酚锰氯化物的制备方法，包括下列步骤
1) 、合成二柳醛缩乙二胺在频率为0~ 100kHz、功率为0~ 1500W的超声 波作用下，用无水乙醇将乙二胺溶解成0. 1~1. Omol/L的溶液，在频率为0~ 100kHz、功率为0~ 1500W的超声波作用下，用无水乙醇将2-羟基-3-曱氧基苯 甲醛溶解成0. 2 ~ 2. Omol/L的溶液，将该两种溶液混合均匀后静置1 ~ 5小时形 成二柳醛縮乙二胺晶体，以过滤的方法荻取该晶体并用无水乙醇清洗后，于室 温下干燥获得；
2) 、合成醋酸乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰用质量百分比浓度为95%的 乙醇将步骤1制得的二柳醛缩乙二胺晶体溶解成10~100mmol/L的溶液，然后 将该溶液加热至25 ~ 9(TC,釆用回流的方式并将溶液置于频率为Q ~ 100kHz、 功率为0- 1500W的超声波环境中进行回流处理1 ~2个小时使其完全溶解，将 溶液在通风条件下干燥获得褐色固体物，将固体物粉碎后用丙酮进行清洗后再 通风干燥即可。
3) 、合成乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物步骤2制得的醋酸乙基双 亚氨基甲基愈创木酚锸加热至40 60。C或通过频率为0 100kHz、功率为0~ 1500W的超声波处理使其溶解于水中获得50 ~ 300mmol/L的溶液，将前述溶液5 倍摩尔浓度的氯化钾溶液加入前述溶液中，混合均匀后进行冰浴急冷，静置1 小时以上后过滤，得到褐色的合成乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物固体， 将该固体用丙酮进行清洗再通风干燥即可。
由前述方法制得的乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物，当其采用黄嘌呤氧化 酶(XOD)-氯化硝基四氮唑兰(NBT)法测定时其活性是2000-8000U/mg,采用邻苯三酚自氧化法测定时其活性是100-700 U/mg,因此其具有超氧化物歧化酶(SOD) 活性；同时利用过氧化氬的240mn吸光度测定法时其活性是2000-9000U/mg，表 明其具有过氧化氢酶(CAT)活性。试验结果表明其在15J/cm2范围的紫外线辐射 条件下该物质的抗氧化活性没有受到任何影响，在6(TC加热5个小时，该物质 的抗氧化活性没有大的变化，说明其对紫外线辐射和受热方面具有较高的稳定 性。
图1是用邻苯三酚自氧化法测定实施例制得的化合物SOD活性图表；
图2是用过氧化氢吸光度检测法测定实施例制得的化合物CAT活性图表。
具体实施例方式
下面通过具体实施例对本发明的制备方法进行说明
一种乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物制备方法，其包括下述步骤
1、 合成二柳醛缩乙二胺在频率为40kHz，功率为200W的超声波的条件 下用无水乙醇把乙二胺溶解成0. 2mol/L的溶液、把2-羟基-3-曱氧基苯曱醛溶 解成1. Omol/L的溶液，然后将两种溶液混合均匀静置1个小时析出晶体，通过 过滤网将该晶体回收后用无水乙醇进行清洗，之后将其置于室温下干燥即可制
3曰
付；
2、 合成醋酸乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰将步骤l制得的二柳醛缩乙二 胺用质量百分比浓度为95%的乙醇将其溶解成50mmol/L的溶液，然后加热至80 。C，并置于频率为40kHz,功率为200W的超声波条件下进行回流处理1小时， 然后在通风条件下将处理后的溶液干燥获得黑褐色的粉末，将该粉末用丙酮清 洗干净后再通风凉干；
3、 合成乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物将步骤2制得的醋酸乙基双 亚氨基曱基愈创木酚锰加热至5(TC或通过超声波处理使其溶解成"Ommol/L的 溶液，在温度50。C条件下加入750mmol/L的氯化钾溶液，将两种溶液混合均匀后进行冰浴急冷处理，并静置2小时以后过滤，得到褐色固体物，将该固体物 用丙酮进行清洗再通风干燥即可制得乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物。
参考图1,将所制得的乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物进行超氧化物
歧化酶(SOD )活性测定采用邻苯三酚自氧化法来测定超氧化物歧化酶(SOD ) 活性。(参见Marklund， S- et al.; Assay of SOD by pyrogal lol autooxidation: Eur. J. Biochem. 47， 469-474, 1974,欧洲杂志；邹国林等，几种超氧化物 歧化酶测活方法灵壽丈度的研究，武汉大学学才艮43， 2, 233-237， 1997，中国杂 志)。将緩冲液(5mmol/L TrisHCl， pH8. 2+lmmol/L EDTA* 2Na 2. 97mL)加入到 试管里，于25。C放置15分钟，然后先加入待测酶液15nL(微升)，再加50mmol/L 邻苯三酚15jLiL,立即倾入到比色杯(厚度为lcm)中，在温度25。C条件下每隔 30秒测定325咖吸收值(A325 ) 4分钟。为对比替代该酶液15 jaL而加入H！015 |iL。 此时保持氧化速率为每分钟O. 07。其中S0D活性1单位(U)就是将邻苯三酚自氧 化速率抑制50%的超氧化物歧化酶之量。
将所制得的乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物进行过氧化酶(CAT)活 性测定采用过氧化氩量减少法来测定过氧化酶(CAT)活性。(参见；Beers, Jr.
R. F. et al.; A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase, J. Biol. Chem. 195, 133-140， 1952美 国杂志；Kang， Y. - S. et al. ; Purification and characterization of a catalase from photosynthetic bacterium Rhodospiri1lum rubrum SI grown under anaerobic conditions, J. Microbiol. 44, 2, 185-191， 2006, 美国
杂志)将緩沖液(50mmol/L磷酸緩冲液，pH7. O+lmmol/L EDTA' 2Na 2. 98mL)加 入到试管里，于"。C放置15分钟，然后先加入待测酶液15|aL (微升)和
OCH3 !%CO5. lmmol/L过氧化氬溶液10 |aL,立即倾入到比色杯(厚度为lcm)中，在温度 25。C条件下每隔10秒测定240nm吸收值(A24。 )， CAT活性1单位(U )就是在温 度25。C下1分钟之间去除1 ja mol的过氧化氢的过氧化酶之量。在240nm过氧化 氬的摩尔吸光系数(s )是43. 6 M-1 ctif1。
将所制得的乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物进行抗紫外线辐射的稳 定性试验4e^r验溶液1 [含乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物1. 5mmol/L溶 液0. 64mL、 0. lmmol/L磷酸钠緩沖液(pH7. 0 ) 30mL、双蒸水27. 36mL]和检验 溶液2 [含1000U/mL牛肝过氧化酶溶液1. 2mL， 0. lmmol/L磷酸钠緩沖液(pH7. 0 ) 30mL、双蒸水26. 8mL]放入冰浴里，采用宽带紫外灯(a broadband UVA lamp) A (中心波长为365nm,功率100W)来辐射0-12J/cm2范围的紫外线A (紫外线 量用VLX-3 W radiometer测定)。此时4企验溶液2的过氧4乜氢酶活性降至0，可 检验溶液1的过氧化氢酶活性维持几乎100%。
将所制得的乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物进行抗热稳定性试验在 温度6(TC下热处理5小时，仍然维持乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物的SOD 和CAT活性。
将所制得的乙基双亚氨基曱基愈创木酚锰氯化物进行保存稳定性试验在 室温(25-35°C )保存时维持乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物的SOD和CAT 活性至3年。
该化合物具有防止皮肤老化和抗紫外线损伤，^v而可广泛利用为功能性化 妆品的成分。将该化合物利用为功能性化妆品的原料成分时优点如下① 一个 分子具有两种抗氧化酶的活性，②抗紫外线的稳定性高，保存期长，③由分子 量小而皮肤易于吸收，④一般化妆品原料易溶解，(D生产成本低，操作简单。
权利要求
1、一种乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物的制备方法，其特征在于包括下列步骤1)、合成二柳醛缩乙二胺在频率为0～100kHz、功率为0～1500W的超声波作用下，用无水乙醇将乙二胺溶解成0.1～1.0mol/L的溶液，在频率为0～100kHz、功率为0～1500W的超声波作用下，用无水乙醇将2-羟基-3-甲氧基苯甲醛溶解成0.2～2.0mol/L的溶液，将该两种溶液混合均匀后静置1～5小时形成二柳醛缩乙二胺晶体，以过滤的方法获取该晶体并用无水乙醇清洗后，于室温下干燥获得；2)、合成醋酸乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰用质量百分比浓度为95％的乙醇将步骤1制得的二柳醛缩乙二胺晶体溶解成10～100mmol/L的溶液，然后将该溶液加热至25～90℃，采用回流的方式并将溶液置于频率为0～100kHz、功率为0～1500W的超声波环境中进行回流处理1～2个小时使其完全溶解，将溶液在通风条件下干燥获得褐色固体物，将固体物粉碎后用丙酮进行清洗后再通风干燥即可。3)、合成乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物步骤2制得的醋酸乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰加热至40～60℃或通过频率为0～100kHz、功率为0～1500W的超声波处理使其溶解于水中获得50～300mmol/L的溶液，将前述溶液5倍摩尔浓度的氯化钾溶液加入前述溶液中，混合均匀后进行冰浴急冷，静置1小时以上后过滤，得到褐色的合成乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物固体，将该固体用丙酮进行清洗再通风干燥即可。
全文摘要
本发明涉及一种具有超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的高稳定性低分子物质-乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物的制备方法。该物质是通过在合成二柳醛缩乙二胺和醋酸乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰的步骤时进行超声波或热处理以提高反应物的溶解性实现的。该物质的分子量只有普通超氧化物歧化酶和过氧化氢酶分子量的百分之一左右，却具有该两种酶的活性，该物质在紫外线曝光和热处理条件下表现稳定并在室温条件下保持3年以上不变质。
文档编号C07C249/02GK101671268SQ20091019269
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月22日 优先权日2009年9月22日
发明者金光元 申请人:郑党恩