专利名称：一种特异性卵黄抗体的免疫亲和层析纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种特异性卵黄抗体免疫亲和纯化的方法，具体地说是涉及一种单增李斯特菌特异性卵黄抗体的免疫亲和纯化方法。
背景技术：
卵黄抗体(Egg yolk immunoglobulins, IgY)是禽类蛋黄中存在的唯——种免疫 球蛋白，由母鸡在产蛋的过程中将免疫球蛋白转移至蛋黄而形成。IgY区别于IgG的最大性 能特点在于其不仅具有抗原结合能力，而且对其抗原菌的生长具有显著的抑制作用。随着 研究的不断深入，IgY应用于动物病原菌的被动免疫保护和预防控制等都已经有大量研究 报道。目前对于卵黄抗体的制备和纯化的方法主要是盐析法、有机溶剂沉淀法、超滤法、 以及亲和纯化法等，这些方法大都是针对IgY的提取，针对IgY纯化的方法较少，即使是亲 和纯化法，也只能纯化得到IgY，而不能分离得到特异性的IgY。因此研究一种能够有效分 离纯化特异性IgY抗体的纯化方法具有较高的学术价值和应用前景。
发明内容
针对传统纯化方法存在的问题，本发明的目的在于提供一种操作简单，能够有效 分离特异性卵黄抗体和非特异性卵黄抗体的免疫亲和纯化方法。本发明的目的通过以下步骤实现(1)单增李斯特菌经扩增培养后，收集菌体细胞并灭活；(2)以二乙烯基砜为交联剂，通过结合乙二胺对菌体进行氨基活化；(3)活化后的菌体与溴化氰活化的S印har0Se4B固相填料交联，并进行封闭处理；(4)将待纯化 IgY 抗体用 Tris-HCl (0. 1M，pH 7. 5，含有 0. 15M NaCl)溶解后， 取2mL样品液与填料充分混合，在37°C条件下反应90分钟，将填料装入3mL层析柱中，以 Tris-HCl (0. 1M，pH 7. 5，含有 0. 15M NaCl)洗脱层析柱，流速约为 lmL/min，至 0D280 值低 于 0. 01 ；(5)以0. 2M甘氨酸(pH 2. 7，含有0. 5M NaCl)溶液洗涤层析柱，使结合到层析柱 上的IgY抗体解离，流速约为lmL/min，至0D280值低于0. 01，收集时，在收集管中预先加入 100 μ Li. OM pH 9. OTris-HCl缓冲液，以调节所得组分的pH ；(6)以单增李斯特菌菌体包被96孔板，采用间接ELISA测定纯化前后相同浓度 IgY抗体的效价，分析亲和纯化效果。与现有盐析、超滤等卵黄抗体的纯化技术相比较，本发明的主要优点在于(1)利用氨基活化的方法对菌体抗原进行预处理，可大大提高菌体抗原与固相载 体的结合效率；(2)利用抗原与抗体的特异性亲和，有效的去除了非特异性卵黄抗体及其他杂蛋 白，提高纯化效率。
图1:特异性IgY抗体纯化图谱 图2 纯化前后抗体效价对比
具体实施例方式下面通过具体实施例来详细说明本发明。实施例1 单增李斯特菌特异性卵黄抗体的纯化1、单增李斯特菌菌体抗原的制备单增李斯特菌接种于胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB-YE)培养基中，于37°C培养24小时，lOOOOr/min离心30分钟收集菌体，以生理盐水制备菌悬液，在沸水浴中处理10分 钟，用生理盐水洗涤三次，每次以4000r/min离心10分钟，4°C储存备用。2、单增李斯特菌菌体抗原的氨基活化将2mL 二乙烯基砜溶解于4mL 二甲基甲酰胺中，并与34mL0. 5M pHl. O的碳酸盐缓 冲液充分混合，将制备所得的菌体抗原(SXlO11Cfu)重悬于上述混合液中，于21°C下孵育 60分钟，4000r/min离心10分钟收集菌体并用双蒸水洗涤三次；再次将菌体重悬于乙 二胺溶液中，于21°C下孵育30分钟，再次以4000r/min离心10分钟收集菌体并用双蒸水洗 涤数次，直至上清液中无游离的乙二胺。3、免疫亲和层析柱的组装取2mL活化后的菌体(5X 101Qcfu/mL)与2mL溴化氰活化的S印harose 4B填料 在0. IM pH8. 3的碳酸盐缓冲液中充分混合，于4°C孵育过夜；以该碳酸盐缓冲液洗涤填料 三次以去除未结合的菌体后，用2mL 0. IM pH8.0的Tris缓冲液于室温下封闭填料120分 钟；分别用IOmL醋酸缓冲液(0. 1M，pH 4. 0，含有0. 5M NaCl)和Tris-HCl缓冲液(0. 1M， pH 8. 0，含有0. 5M NaCl)洗涤填料三次。4、特异性卵黄抗体的纯化将待纯化的IgY抗体用Tris-HCl (0. ΙΜ,ρΗ 7. 5，含有0. 15Μ NaCl)缓冲液溶解并 调节至lmg/mL，取2mL抗体溶液与2mL结合有单增李斯特菌菌体抗原的柱填料混合均勻， 37°C孵育90分钟后，装入3mL层析小柱中，以Tris-HCl (0. ΙΜ,ρΗ 7. 5，含有0. 15Μ NaCl)缓 冲液洗涤柱床，直至流出液的0D280值小于0.01 ；以0. 2Μ甘氨酸(pH 2. 7，含有0. 5Μ NaCl) 溶液洗涤柱床，使特异性IgY抗体从层析柱上解离下来。5、纯化效果的分析以IO9CfVmL的单增李斯特菌菌体包被96孔板，并用牛血清白蛋白封闭；将纯 化前后的IgY用磷酸盐缓冲液溶解(PBS，0. 01M，pH7. 4)并调节浓度至0. lmg/mL，梯度稀释 (1 X , 2 X , 5 X , 10 X , 20 X , 50 X , 100 X , 200 X , 500 X)后分别取 IOOyL 加入到微孔中，以 PBS作为空白，每个浓度梯度做3个平行实验，37°C孵育90分钟；甩出孔中的液体，以PBST 充分洗涤3次；加入100 μ L酶标二抗溶液，37°C孵育90分钟，甩出孔中的液体，以PBST洗 涤3次；加入IOOyL新配制的3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物(0. lmg/mL)到微 孔中，在室温暗处孵育20分钟；加入50 μ L H2SO4 (2mol/L)到各微孔中中止反应，以未加抗 体的第一列为空白用酶标仪在450nm处测量吸光值。
由图1可以看出，在Tris-HCl (0. ΙΜ,ρΗ 7. 5，含有0. 15Μ NaCl)缓冲液的洗脱下， 非特异性IgY抗体和未结合的特异性IgY抗体会随洗脱液流出(峰Α)，而换为0. 2Μ甘氨 酸(ρΗ 2. 7，含有0. 5Μ NaCl)溶液洗脱时，结合到层析柱上的特异性IgY抗体会被解离下来 (峰B)，经蛋白含量的计算，该层析柱的纯化效率约为0. 25mg/mL柱床。经过纯化后的特异性IgY抗体，在相同的起始浓度下，其效价较纯化前可以提高 4-5倍(图2)，这也与相关报道中，特异性卵黄抗体占卵黄抗体总量的20% -30%是一致 的。 经过纯化后的特异性IgY抗体，在相同的起始浓度下，其效价较纯化前可以提高 4-5倍(图2)，这也与相关报道中，特异性卵黄抗体占卵黄抗体总量的20% -30%是一致 的。
权利要求
一种利用免疫亲和层析柱进行特异性IgY抗体的纯化方法，其特征在于包括以下步骤(1)免疫用单增李斯特菌体抗原的制备；(2)菌体抗原的氨基活化；(3)活化后菌体与固相载体的交联；(4)免疫亲和层析柱的装备；(5)将待纯化的IgY抗体溶液加入免疫亲和层析柱，以洗脱液I洗脱抗体使之流经层析柱，利用紫外分光光度计测定OD280值至0.01以下；(6).利用解离缓冲液洗脱亲和层析柱，使结合到层析柱上的特异性抗体解离；(7)利用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)对纯化效果进行测定。
2.根据权利1所述的纯化方法，其特征是首先制备免疫用抗原并对抗原进行氨基活化。
3.根据权利1所述的纯化方法，其特征是首先将活化后的菌体抗原与固相载体交联， 装备亲和层析柱。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于样本中的特异性IgY抗体首先要与亲 和层析柱特异性结合。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于通过紫外吸收的方法判断特异性IgY 抗体的结合和解离情况。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于利用ELISA对抗体的纯化效果进行分析。
全文摘要
本发明公开了一种针对抗单增李斯特菌特异性卵黄抗体(IgY)的免疫亲和纯化方法，该方法以单增李斯特菌菌体细胞为特异性吸附材料，经过氨基活化后与溴化氰活化的Sepharose4B填料结合形成固相载体；纯化时，特异性IgY抗体会与结合在层析柱上的单增李斯特菌菌体细胞特异性吸附而结合在层析柱上，非特异性抗体随洗脱液流出；至无非特异性抗体流出后，利用解离缓冲液使结合在层析柱上的抗体与抗原解离；利用测定紫外吸收的方法对特异性抗体的吸附和解离情况进行检测，利用间接酶联免疫吸附(ELISA)检测抗体的纯化效果。本发明操作简单，可应用于特异性卵黄抗体的有效分离纯化。
文档编号C07K1/22GK101817880SQ20091025577
公开日2010年9月1日 申请日期2009年12月26日 优先权日2009年12月26日
发明者曹立民, 林洪, 隋建新 申请人:中国海洋大学