专利名称：可用作疫苗的自装配肽纳米颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及掺入B-细胞表位和/或T-细胞表位的自装配肽纳米颗粒。此外，本 发明涉及这样的纳米颗粒用于疫苗接种的用途。
背景技术：
适应性免疫系统具有两类不同的应答，体液免疫应答和细胞免疫应答。第一类的 特征在于抗体应答，其中这些抗体结合病原体的表面表位，而第二类的特征在于细胞毒性 的T-淋巴细胞(CTLs)，它们杀死已经被感染的细胞。两类免疫应答进一步受到T-辅助细 胞的刺激，后者会激活生产结合特定病原体的抗体的B-细胞或针对受感染的细胞的T-细 胞。B-细胞生产的抗体和病原体之间相互作用的特异性，由病原体的表面结构(所谓 的B-细胞表位)决定，而CTLs与受感染的靶细胞的相互作用的特异性，是借助于靶细胞 的表面分子上存在的T-细胞表位，所谓的主要组织相容性复合物I类分子(MHC I)。这类 T-细胞表位(CTL-表位)是由受感染的细胞生产的来自病原体的蛋白的片段。最后，T-辅 助细胞与各个B-细胞或CTL的相互作用的特异性，由T-辅助细胞的受体分子与B-细胞或 CTL-细胞上的MHC II类分子(MHC II)呈递的其它类型T-细胞表位(HTL-表位)的结合 来决定。抗体与B-细胞表位的结合需要B-细胞表位呈现特定的三维结构，该B-细胞表位 在它的天然环境中(即当它是在病原体的表面时)具有相同的结构。B-细胞表位可以由超 过一条肽链组成，它的三维结构由蛋白支架来组织。但是，T-细胞表位不需要特定的三维结构，各个MHC I或MHC II分子以非常特异 性的方式结合它们。为了最佳呈递，MHC I分子把CTL表位修剪成长度为9个氨基酸的大 小，而HTL表位与MHC II分子发生类似的相互作用，但是可能比仅9个氨基酸更长。在本 发明的上下文中，重要的是，表位与MHC分子的结合，遵循非常特殊的规则，即仅具有特定 特征的肽能结合各个MHC分子，并从而用作表位。这些特征已经得到彻底研究，且从已知的 表位知识，已经开发出预测程序，其能高准确度地预测能结合MHC分子的表位。现在正在构 建在线性肽链中由几个这样的T-细胞表位组成的肽串作为疫苗候选物。原则上，有效的疫苗应当诱导强烈的体液免疫应答以及强烈的细胞免疫应答。已 经证实，通过B-细胞表位的重复抗原显示，可以实现强烈的体液免疫应答。病毒样颗粒 (VLPs)可以用作有效的工具，以规则的、重复的和严格的方式呈递B-细胞表位，因此VLPs 现在广泛地用于疫苗设计。在专利EP 1 594 469 Bl中，已经描述了重复抗原显示的另一 个方案。在该专利中，已经构建出由三聚体和五聚体蛋白寡聚化结构域组成的自装配肽纳 米颗粒(SAPN)，它们在表面上重复显示B-细胞表位。B-细胞表位结合在寡聚化结构域的 末端，以便确保B-细胞表位以多个拷贝呈递在纳米颗粒表面。最常遇到的蛋白寡聚化基序 之一是卷曲螺旋结构基序，该基序可以有效地用于这些SAPN的设计中。
发明内容
本发明涉及掺入T-和/或B-细胞表位的自装配肽纳米颗粒(SAPN)。更具体地， 本发明的纳米颗粒由连续肽链的聚集体组成，所述连续肽链包含通过连接区段相连的两个 寡聚化结构域，其中一个或两个寡聚化结构域是在它的肽序列中掺入T-和/或B-细胞表 位的卷曲螺旋。本发明另外涉及使用这样的掺入T-和/或B-细胞表位的自装配肽纳米颗粒免疫 接种人或非人动物的方法。
图1 共价连接卵白蛋白肽(0VA323-339)的小鼠MHC II分子I-Ad的结构，它是 I-Ad的HTL表位。从顶部以C-α示踪，将MHC II蛋白显示为灰色。形成表位结合部位的 壁的2个螺旋侧接结合的肽。肽在全原子球棍模型中显示为黑色。结合形式的肽HTL表位 是处于展开构象中，这可以通过图底部单独肽的结构更清楚地看到。图2 分别是三聚体和五聚体寡聚化结构域[左侧，A)]和三聚体和四聚体寡聚化 结构域[右侧，B)]的"均勻单元"的示意图。单体(构造块)的数目由构造块的两个寡 聚化结构域Dl和D2的寡聚化状态的最小公倍数(LCM)决定。在均勻单元中，所有构造块 的连接区段彼此尽可能近地排列，即尽可能接近肽纳米颗粒的中心，因此均勻单元会自装 配成球形纳米颗粒。图3 十二面体/ 二十面体的内部对称性元件。旋转对称轴(2-倍、3-倍和5-倍) 显示为标有2、3和5的线。在A)中，显示了由寡聚化结构域Dl (左边，具有3倍对称的卷曲 螺旋结构域)、连接区段L (底部)和寡聚化结构域D2 (右边，具有5倍对称的卷曲螺旋结构 域)组成的单体构造块，使得寡聚化结构域Dl和D2的内部对称性元件在多面体的对称元 件上重叠。在B中)，显示了完整的卷曲螺旋结构域Dl和D2。由多面体的3-倍和5-倍旋 转对称元件产生的其它对称对象显示为圆柱体，而起始分子显示为象在A)中一样的螺旋。图4 实施例1中从具有序列SEQ ID NO 8的肽制备的自装配的肽纳米颗粒的动态 光散射(DLS，A)和透射电子显微术(TEM，B)。DLS分析显示出平均粒径为32. Olnm的大小分 布，多分散性指数为12.9% (A)。TEM照片⑶显示出与通过DLS测得相同大小的纳米颗粒。图5 实施例2中从具有序列SEQ ID NO 10的肽制备的自装配的肽纳米颗粒的透 射电子显微术(TEM)。TEM照片显示出25nm相同大小的纳米颗粒。图6 实施例3中从具有序列SEQ ID NO 12的肽制备的自装配的肽纳米颗粒的透 射电子显微术(TEM)。TEM照片显示出约20至30nm大小的纳米颗粒。图7 用于人和鸡流感疫苗的从分别具有序列SEQ ID NO :37(小图A)和SEQ ID N0:38(小图B)的肽制备的自装配的肽纳米颗粒(实施例9)的透射电子显微术(TEM)。TEM 照片显示出约25nm大小的纳米颗粒。图8 实施例11中从具有序列SEQ ID NO 41的肽制备的自装配的肽纳米颗粒的 透射电子显微术(TEM)。TEM照片显示出约25nm大小的纳米颗粒。发明详述单体构造块自装配肽纳米颗粒(SAPN)由多个式⑴的单体构造块制成，所述式⑴的单体构造块由包含肽寡聚化结构域D1、连接区段L和肽寡聚化结构域D2的连续链组成，D1-L-D2(I),其中Dl是合成的或天然的肽，其具有形成m个亚基Dl的寡聚体(Dl)mW倾向，D2 是合成的或天然的肽，其具有形成η个亚基D2的寡聚体(D2) η的倾向，m和η各自是2至10 之间的数字，条件是，m不等于n，且m不是η的倍数，且η不是m的倍数，L是键或选自下述 的短连接链任选取代的碳原子、任选取代的氮原子、氧原子、硫原子、和它们的组合；Dl或 D2中的任一个或Dl和D2两者是在寡聚化结构域中掺入一个或更多个T-和/或B-细胞表 位的卷曲螺旋，且其中D1、D2和L任选地被进一步取代。肽(或多肽)是通过酰胺键共价连接的氨基酸的链或序列。肽可以是天然的、修 饰的天然的、部分合成的或完全合成的。“修饰的天然的、部分合成的或完全合成的”应当 理解为，表示不是天然存在的。术语氨基酸包括，选自20种必需的天然的α-L-氨基酸的 天然存在的氨基酸，合成的氨基酸，例如α-D-氨基酸、6-氨基己酸、正亮氨酸、高半胱氨酸 等，以及已经以某些方式进行修饰来改变某些性质(例如电荷)的天然存在的氨基酸，例如 磷酸丝氨酸或磷酸酪氨酸等。在氨基酸的衍生物中，形成酰胺键的氨基被烷基化，或侧链氨 基、羟基、或硫官能团被烷基化或酰化，或侧链羧基官能团被酰胺化或酯化。短连接链L选自任选取代的碳原子、任选取代的氮原子、氧原子、硫原子、和它们 的组合，链中优选1至60个原子、特别是1至20个原子。这样的短连接链是，例如聚乙烯 氧(polyethylenoxy)链、糖链或优选地肽链，例如由1至20个氨基酸、特别是1至6个氨 基酸组成的肽链。m和η各自是2至10之间的数字，条件是，m不等于n，且m不是η的倍数，且η不 是m的倍数。η和m的优选组合是这样的组合，其中m是2且η是5，或m是3且η是4或 5，或m是4且η是5。同样地，η和m的优选组合是这样的组合，其中m是5且η是2，或m 是4或5且η是3，或m是5且η是4。最优选的是这样的组合，其中m或η是5。卷曲螺旋是肽序列，其具有间隔3和4个残基的主要疏水的残基的连续图案，装配 形成多聚体螺旋束，这将在下文中更详细地解释。“掺入T-细胞和/或B-细胞表位的卷曲螺旋"是指，对应的表位包含在寡聚化 结构域中，从而在表位的N-末端和C-末端的氨基酸序列迫使表位适应仍然是卷曲螺旋的 构象，后者与包含所述表位的寡聚化结构域的寡聚化性质相一致。更具体地，“掺入"不 包括这样的情况，其中所述表位结合在卷曲螺旋寡聚化结构域的任一个末端。在本文件的上下文中，术语T-细胞表位用于指CTL和HTL表位。T-细胞表位会结合处于展开构象的MHC分子(图1)。因此，将T-细胞表位掺入 α-螺旋状的卷曲螺旋(对比图3Α和图1)不是蛋白工程的日常任务。在本发明中，证实了 这些具有展开构象的肽序列当结合各个MHC分子时仍然可以掺入α _螺旋状的卷曲螺旋寡 聚化结构域。D1、D2和L的任选取代物是例如B-细胞表位、靶向物质或增强纳米颗粒的佐剂性 质的取代物，例如免疫刺激的核酸，优选含有脱氧肌苷的寡脱氧核苷酸，含有脱氧尿苷的寡 脱氧核苷酸，含有CG基序的寡脱氧核苷酸，或含有肌苷和胞苷的核酸分子。增强纳米颗粒 的佐剂性质的其它取代物是抗微生物的肽，例如阳离子肽，它们是一类能促进和/或提高 适应性免疫应答的免疫刺激性的、带正电荷的分子。这样的具有免疫增强性质的肽的一个实例是带正电荷的人工的抗微生物的肽KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO :63)，它在激发-强化免 疫接种后会诱导有效的蛋白特异性的类型_2驱动的适应性免疫。视作取代物的特定靶向 物质是靶向内质网的信号，即诱导蛋白或肽向内质网(ER)运输的信号肽。其它任选的取 代物是，例如，酰基，例如乙酰基，其结合游离氨基，尤其是N-末端氨基酸，或氨基，其结合 C-末端氨基酸的游离羧基，以产生羧酰胺官能团。任选的取代物，例如上述的那些任选的取代物，优选地连接接近寡聚化结构域D1 和/或D2的游离末端的合适的氨基酸。肽纳米颗粒自装配后，这样的取代物然后会呈现在 SAPN的表面。在一个最优选的实施方案中，取代物是另一个肽序列S1和/或S2,它代表肽 链D1-L-D2在任一端或在两端的简单延伸，产生任一种下述形式的组合的单个肽序列 S1-D1-L-D2, D1-L-D2-S2，或S1-D1-L-D2-S2，其中S1和S2是在上文中和在下文中定义的 肽取代物。取代物S1和/或S2用于延伸SAPN的核心序列D1-L-D2。任意这样的肽序列
51-D1-L-D2，D1-L-D2-S2，或S1-D1-L-D2-S2可以在重组蛋白表达系统中表达为一个单独 的分子。优选的取代物S1和/或S2是B-细胞表位。考虑的其它B-细胞表位是半抗原分 子，例如碳水化合物或尼古丁，它们同样结合在寡聚化结构域D1和/或D2的末端，因此会 显示在SAPN的表面。显然，也可能使超过一种取代物结合寡聚化结构域D1和/或D2。例如，考虑肽序 列S1-D1-L-D2-S2，可以将另一种取代物与它共价连接，优选在远离连接区段L的位置，接 近D1和/或D2的末端，或在取代物S1和/或S2中的任意位置。也可能使取代物结合连接区段L。在这样的情况下，在重新折叠SAPN后，取代物将 位于SAPN的内腔中。形成寡聚体的倾向是指，根据条件，这样的肽可以形成寡聚体，例如在变性条件 下，它们是单体，而在生理条件下，它们可以形成例如三聚体。在预定的条件下，它们会采 取一种单一的寡聚化状态，后者是纳米颗粒形成所必需的。但是，它们的寡聚化状态可 以随条件变化而变化，例如在增加盐浓度后，从二聚体变成三聚体(Burkhard P.等人， ProteinScience 2000,9 :2294_2301)，或在降低pH后，从五聚体变成单体。根据式(I)的构造块结构明显不同于病毒衣壳蛋白。病毒衣壳由一种单一蛋白组 成，形成60或其倍数的寡聚体，例如乙型肝炎病毒颗粒(EP1 262 555，EP 0 201 416)，或 由超过一种蛋白组成，它们共装配，形成病毒衣壳结构，后者也可以采取除二十面体以外的 其它几何形状，这取决于病毒的类型(Fender P.等人，Nature Biotechnology 1997,15
52-56)。本发明的自装配肽纳米颗粒(SAPN)也明显不同于病毒样颗粒，因为它们(a)不 是用病毒衣壳蛋白构建，且(b)在纳米颗粒中央的空腔太小，不足以容纳整个病毒基因组 的 DNA/RNA。肽寡聚化结构域是众所周知的(Burkhard P.等人，Trends Cell Biol2001, 11:82-88)。最简单的寡聚化结构域可能是卷曲螺旋折叠基序。已经证实，该寡聚化基 序作为二聚体、三聚体、四聚体和五聚体存在。一些实例是GCN4亮氨酸拉链、fibritin, tetrabrachion和C0MP，分别代表二聚体、三聚体、四聚体和五聚体卷曲螺旋。一个或两个寡聚化结构域D1和D2彼此独立地是卷曲螺旋结构域。一个卷曲螺旋是一个肽序列，其具有间隔3和4个残基的主要疏水的残基的连续图案，通常在7个氨基 酸(七肽重复)或11个氨基酸(十一肽重复)的序列中，它装配(折叠)形成多聚体螺旋 束。也包括这样的卷曲螺旋，其具有包含一些不规则分布的3和4个残基间隔的序列。疏 水的残基具体地是疏水的氨基酸Val，lie, Leu, Met, Tyr，Phe和Trp。主要疏水的是指，至 少50%的残基必须选自所述的疏水氨基酸。
或D2是任意下式的肽 (Ila)， (lib), (He), (lid), (lie)，
(Ilf)， (Ilg)， 例如，在式(I)的一个优选的单体构造块中，D1和
[aa (a) _aa (b) _aa (c) _aa (d) _aa (e) _aa (f) _aa (g)],[aa (b) _aa (c) -aa (d) -aa (e) -aa (f) -aa (g) -aa (a)],[aa (c) _aa (d) -aa (e) -aa (f) -aa (g) -aa (a) -aa (b)],[aa (d) _aa (e) -aa (f) -aa (g) -aa (a) -aa (b) -aa (c)],[aa (e) -aa (f) -aa (g) -aa (a) -aa (b) -aa (c) -aa (d)],[aa (f) _aa (g) -aa (a) -aa (b) -aa (c) -aa (d) -aa (e)],[aa (g) _aa (a) -aa (b) -aa (c) -aa (d) -aa (e) -aa (f)],其中aa 表示氨基酸或其衍生物，aa(a)，aa (b)，aa(c)，aa(d)，aa(e)，aa(f)，和 aa(g)是相同的或不同的氨基酸或其衍生物，优选地aa(a)和aa(d)是相同的或不同的疏水 氨基酸或其衍生物；且X是2至20之间的数，优选3，4，5或6。疏水氨基酸是Val, lie, Leu, Met, Tyr, Phe 和 Trp。七肽是式 aa (a) -aa (b) -aa (c) -aa (d) -aa (e) -aa (f) -aa (g) (Ila)或式(lib)至 (Hg)的变换之一的七肽。优选的是式(I)的单体构造块，其中一个或两个肽寡聚化结构域D1或D2是(1)式(Ila)至(Ilg)中任一个的肽，其中X是3，且aa (a)和aa(d)选自20种天 然a -L-氨基酸，使得表1中对这6个氨基酸的评分总和是至少14，且这样的肽包含最高达 17个其它的七肽；或(2)式(Ila)至(Ilg)中任一个的肽，其中X是3，且aa (a)和aa(d)选自20种 天然a -L-氨基酸，使得表1中对这6个氨基酸的评分总和是至少12，条件是，一个氨基酸 aa(a)是能与邻近七肽的氨基酸aa(d)或aa(g)形成螺旋间盐桥的带电荷的氨基酸，或一 个氨基酸aa(d)是能与邻近七肽的氨基酸aa (a)或aa(e)形成螺旋间盐桥的带电荷的氨基 酸，且这样的肽包含最高达2个其它的七肽。能与邻近七肽的氨基酸形成螺旋间盐桥的带 电荷的氨基酸是，例如，Asp或GIu，如果其它氨基酸是Lys，Arg或His，反之亦然。表1 用于确定优选的氨基酸评分 也优选的是式(I)的单体构造块，其中一个或两个肽寡聚化结构域D1或D2选自 下述优选的肽(11)式(Ila)至(Ilg)中任一个的肽，其中aa(a)选自Val，lie，Leu和Met，和其 衍生物，且aa(d)选自Leu，Met和lie，和其衍生物。(12)式(Ila)至(Ilg)中任一个的肽，其中一个aa (a)是Asn，其它aa(a)选自 ASn，Ne和Leu，且aa(d)是Leu。这样的肽通常是二聚化结构域(m或n = 2)。(13)式(Ila)至(Ilg)中任一个的肽，其中aa (a)和aa(d)都是Leu或都是lie。 这样的肽通常是三聚化结构域(m或n = 3)。(14)式(Ila)至(Ilg)中任一个的肽，其中aa(a)和aa(d)都是Trp。这样的肽 通常是五聚化结构域(m或n = 5)。(15)式(Ila)至(Ilg)中任一个的肽，其中aa(a)和aa(d)都是Phe。这样的肽 通常是五聚化或四聚化结构域(m或n = 4或5)。
(16)式(Ila)至(Ilg)中任一个的肽，其中aa(a)和aa(d)都是Trp或Phe。这 样的肽通常是五聚化结构域(m或n = 5)。(17)式(Ila)至(Ilg)中任一个的肽，其中aa (a)是Leu或lie，且一个aa (d)是 Gln，且其它aa(d)选自Gln，Leu和Met。这样的肽具有成为五聚化结构域的潜力(m或n = 5)。其它优选的肽是在上文中定义的肽(1)，(2), (11), (12)，(13)，(14)，(15)，(16) 和(17)，且其中另外(21)至少一个aa(g)选自Asp和GIu，且在下述七肽中的aa(e)是Lys，Arg或His ； 和/或(22)至少一个aa(g)选自Lys，Arg和His，且在下述七肽中的aa(e)是Asp或GIu， 和/或(23)至少一个aa(a至g)选自Lys，Arg和His，且序列中间隔3或4个氨基酸的 aa(a至g)是Asp或GIu。这样的氨基酸aa (a至g)对是，例如aa(b)和aa(e)或aa(f)。卷曲螺旋预测程序例如COILS(http://www. ch. embnet. org/software/COILS_form. html ；Gruber M.等 人， J.Struct.Biol. 2006,155(2) 140-5)或 MULTICOIL (http://groups, csail. mit. edu/cb/ multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi)可以预测形成卷曲螺旋的肽序列。因此，在式(I)的 一个优选的单体构造块中，D1和/或D2是含有至少一个长度为2个七肽重复的序列的肽， 用卷曲螺旋预测程序COILS预测，利用14、21或28的窗大小中的至少一个，所有它的氨基 酸形成卷曲螺旋的概率高于0. 9。在式(I)的一个更优选的单体构造块中，D1和/或D2是含有至少一个长度为3个 七肽重复的序列的肽，用卷曲螺旋预测程序COILS预测，利用14、21或28的窗大小中的至 少一个，所有它的氨基酸形成卷曲螺旋的概率高于0. 9。在式(I)的另一个更优选的单体构造块中，D1和/或D2是含有至少2个分开的 长度为2个七肽重复的序列的肽，用卷曲螺旋预测程序COILS预测，利用14、21或28的窗 大小中的至少一个，所有它的氨基酸形成卷曲螺旋的概率高于0.9。在另一个优选的实施方案中，一个寡聚化结构域D1或D2是C0MP(MalaShkeVich V.N.等人，Science 1996，274 :761_765)的五聚化结构域(m或n = 5)或其衍生物。该五 聚化结构域具有序列 LAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLKNTVMECDACG(SEQ ID NO :1)。 也预见到该结构域的小修饰。这样的修饰可以是，例如，用Cys置换在五聚体外侧在位置 aa(b),aa(c)或aa (f)、优选在位置aa (f)处的氨基酸，其目的是在邻近的结构域之间形成 二硫键。该结构域的表面氨基酸的其它修饰可以包括氨基酸的置换，用于优化邻近的寡聚 化结构域之间的界面处的相互作用，例如疏水的、亲水的或离子的相互作用或共价键如二 硫键。也预见到该结构域更短的构建体，例如缺少C-末端CDACG基序，其中半胱氨酸在该 五聚化结构域的C-末端形成分子间二硫键。也预见到影响该结构域的寡聚化状态的氨基 酸修饰，导致例如从五聚体向四聚体的转变。该结构域的表面氨基酸的其它修饰可以包括， 氨基酸的置换(例如置换为半胱氨酸或赖氨酸)，以产生官能团的结合部位。在另一个优选的实施方案中，一个寡聚化结构域D1或D2是色氨酸拉链(Liu J等 人，Proc Natl Acad Sci U S A 2004 ； 101 (46) : 16156-61)的五聚化结构域(m 或 n = 5)或其衍生物。该五聚化结构域具有序列SSNAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARW NQRWDNWAT(SEQ ID NO :2)。也预见到该结构域的小修饰。这样的修饰可以是，例如，用Cys 置换在五聚体外侧在位置aa(b)、aa(C)或aa(f)、优选在位置aa(f)处的氨基酸，其目的是 在邻近的结构域之间形成二硫键。该结构域的表面氨基酸的其它修饰可以包括氨基酸的置 换，用于优化邻近的寡聚化结构域之间的界面处的相互作用，例如疏水的、亲水的或离子的 相互作用或共价键如二硫键。也预见到该结构域更短的构建体。也预见到影响该结构域的 寡聚化状态的氨基酸修饰，例如用Phe交换核心残基Trp，导致从五聚化结构域向四聚化结 构域的转变。也考虑在实施例10中的其它核心残基突变，但是至少70%的核心位置aa (a) 和aa(d)必须是Trp或另一种芳族氨基酸。该结构域的表面氨基酸的其它修饰可以包括， 氨基酸的置换(例如置换为半胱氨酸或赖氨酸)，以产生官能团的结合部位。在另一个优选的实施方案中，一个寡聚化结构域D1或D2是 tetrabrachion (Stetefeld J.等人，Nature Structural Biology, 2000 ；7 (9) :772_776) 的卷曲螺旋结构域的四聚化结构域(m或n = 4)或其衍生物。该四聚化结构域具有序列I INETADDIVYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLMIINDNVSTILASG(SEQ ID NO :64)。卷曲螺旋序列的 特征在于7个残基的七肽重复，其中含有3，4-疏水的重复。在小数目的折叠(turn)后允 许残基假定半价位置的下一个周期性是3个折叠或11个残基。基于11-残基重复的存在， 来自超嗜热的古细菌Staphylothermusmarinus的表面层糖蛋白tetrabrachion的C-末端 形成右手卷曲螺旋结构。它形成长70nm的四聚体的a-螺旋状的卷曲螺旋茎，后者在它的 C-末端锚定在细胞膜上。该四聚体卷曲螺旋含有一系列HTL表位(实施例9)，因此理想地 适合作为自装配肽纳米颗粒(SAPN)的核心寡聚体。在另一个优选的实施方案中，一个寡聚化结构域D1或D2是噬菌体T4蛋白 fibritin(Tao, Y.等人，Structure 1997,5:789-798)的三聚化结构域(foldon)或其衍生 物。该三聚化结构域(m或 n = 3)具有序列 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 3)。也预见到该结构域的小修饰。这样的修饰可以是，用Cys置换Asp9，其目的是在邻近的 结构域之间形成二硫键。该结构域的表面氨基酸的其它修饰可以包括残基的置换，用于优 化邻近的寡聚化结构域之间的界面处的相互作用，例如疏水的、亲水的或离子的相互作用 或共价键如二硫键。该结构域的表面氨基酸的其它修饰可以包括，氨基酸的置换(例如置 换为半胱氨酸或赖氨酸)，以产生官能团的结合部位。最优选的是在实施例中所述的卷曲螺旋序列和单体构造块。自装配肽纳米颗粒均勻单元自装配肽纳米颗粒(SAPN)由式⑴的单体构造块制成。如果这样的构造块装配， 它们会形成所谓的"均勻单元"。将装配成这样的均勻单元的单体构造块的数目，由最小 公倍数(LCM)决定。因此，如果例如单体构造块的寡聚化结构域形成三聚体(Dl)3(m = 3) 和五聚体(02)5(11 = 5)，15个单体会形成一个均勻单元(图2幻。如果连接区段L具有适 当的长度，该均勻单元可以装配成球形肽纳米颗粒的形式。类似地，如果单体构造块的寡聚 化结构域D1和D2形成三聚体(Dl)3(m = 3)和四聚体(D2) 4 (n = 4)，形成一个均勻单元所 需的单体的数目是12 (图2B)。由于m和n不能彼此相同或成倍数，最小公倍数(LCM)总是大于m和n。通过仅一个或超过一个均勻单元的装配，可以形成自装配肽纳米颗粒(SAPN)(表2)。这样的SAPN代表拓扑上封闭的结构。表2 寡聚化状态的可能组合 规则的多角体存在5种规则的多角体，四面体，立方体，八面体，十二面体和二十面体。它们具有 不同的内部旋转对称元件。四面体具有1个2-倍和2个3-倍轴，立方体和八面体具有1个 2-倍、1个3-倍和1个4-倍旋转对称轴，十二面体和二十面体具有1个2-倍、1个3-倍和 1个5-倍旋转对称轴。在立方体中，这些轴的空间定向与在八面体中完全一样，在十二面 体和二十面体中，这些轴相对于彼此的空间定向也完全一样。因此，为了本发明的SAPN的 目的，立方体和八面体，类似地十二面体和二十面体，可以视作相同。立方体/八面体由24 个相同的三维构造块构成，而十二面体/ 二十面体由60个相同的三维构造块构成(表2)。 这些构造块是多面体的不对称单位(AU)。它们是三锥体，每个锥体边缘对应着一个旋转对 称轴，因此这些AU会在它们的边缘具有2-倍、3-倍和4-倍或5-倍对称元件，这依赖于多 面体类型。如果这些对称元件由肽寡聚化结构域制成，这样的AU是由上述的单体构造块构 成。足以沿着AU的2个对称轴排列两个寡聚化结构域D1和D2 (图3)。如果这两个寡聚化 结构域形成稳定的寡聚体，将自动产生沿着第三个对称轴的对称界面，且它可以通过优化 沿着该界面的相互作用(例如疏水的、亲水的或离子的相互作用或共价键例如二硫键)来 稳定化。装配具有规则多角体对称性的自装配肽纳米颗粒(SAPN)为了生成具有规则几何形状(十二面体，立方体)的自装配肽纳米颗粒(SAPN)， 需要超过一个均勻单元。例如，为了用含有三聚体和五聚体寡聚化结构域的单体形成十二 面体，需要4个均勻单元，每个由15个单体构造块组成，即具有规则几何形状的肽纳米颗粒 由60个单体构造块组成。在表2中列出了形成任意的规则多角体所需的两个寡聚化结构 域的寡聚化状态的组合和均勻单元的数目。均勻单元是否能进一步装配形成由超过一个均勻单元组成的规则多角体，依赖于 2个寡聚化结构域D1和D2相对于彼此的几何排列，特别是两个寡聚化结构域的旋转对称轴 之间的角度。这由下述因素决定i)纳米颗粒中邻近结构域之间的界面处的相互作用，ii) 连接区段L的长度，iii)单个寡聚化结构域的形状。与在规则多面体中的排列相比，该角 度在均勻单元中更大。在单体构造块中该角度也不相同，这不同于规则的多面体。如果该
25角度限制为规则多面体(借助于疏水的、亲水的或离子的相互作用，或共价二硫键)的更小 的值，且连接区段L足够短，给定数目的拓扑上封闭的均勻单元(每个含有确定数目的单体 构造块)将会进一步对合，形成规则的多面体(表2)，或包围更多单体构造块，形成缺乏多 面体的严格内部对称性的纳米颗粒。如果两个寡聚化结构域之间的角度足够小(甚至小于在具有二十面体对称性 的规则多面体中)，则大数目的(几百)肽链可以装配成肽纳米颗粒。这可以如下实现: 用小残基丙氨酸替换位于两个螺旋之间的界面处(如在Raman S.等人，Nanomedicine Nanotechnology, Biology, andMedicine 2006,2 95-102 的原始设计中)且形成两个螺旋 之间的二硫键的2个半胱氨酸，如在序列SEQ ID N0:33中。两个螺旋之间的角度可以更 小，结果超过60个肽链可以装配进SAPN。在这样的设计中，SAPN具有约4MD的分子量，这 对应着约330个肽链(实施例6)。T-细胞表位和B-细胞表位由于T-细胞表位(相对于B-细胞表位)不需要显示在载体表面上来引起免疫接 种，它们可以掺入SAPN的核心支架(即寡聚化结构域的卷曲螺旋序列)中。在本发明中， 证实了如何将T-细胞表位的MHC结合(MHC结合需要展开构象(图1))的特征与卷曲螺旋 形成(卷曲螺旋形成需要a-螺旋构象)的特征相结合，使得这些表位都成为SAPN的卷曲 螺旋支架的一部分，并能结合各个MHC分子。应当指出，并非所有的卷曲螺旋序列都能结合 MHC分子，也并非所有的T-细胞表位都可以掺入卷曲螺旋结构中。本发明提供了一般规则， 如何选择适当的T-细胞表位，并描述了如何将它们掺入特定卷曲螺旋寡聚化结构域，使得 这些肽会形成SAPN。通过使用这些规则，可以将许多种T-细胞表位掺入SAPN的卷曲螺旋 支架中。在本发明的另一个方面，如下将不是卷曲螺旋的B-细胞表位掺入SAPN寡聚化结 构域的卷曲螺旋序列中通过将它们插入2串卷曲螺旋区段之间，使得该整个序列起单个 寡聚化结构域的作用。这是特别令人感兴趣的，因为卷曲螺旋支架可以提供工具，使B-细 胞表位的构象限制为几何与它的天然构象相同的构象。T-细胞表位的来源为了将T-细胞表位掺入寡聚化结构域，最终产生自装配肽纳米颗粒(SAPN)，T_细 胞表位可以选自不同的来源例如，T-细胞表位可以通过文献已知的实验方法来测定，它 们可以通过基于特定病原体的现有蛋白序列的预测算法来预测，或它们可以是从新设计的 肽或它们的组合。在科学文献中可得到已知的T-细胞表位的知识。这些T-细胞表位可以选自特定 病原体(例如在实施例12，13和14中)，选自癌症特异性的肽序列(例如在实施例4中)， 或它们可以是具有特定特征的从新设计的肽，例如结合许多不同的MHC II分子的PADRE 肽(美国专利5，736，142)，这使它成为所谓的泛宿主性的T-细胞表位(例如在实施例1 中)。存在公众可接近的含有数千不同T-细胞表位的数据库，例如MHC-数据库"MHCBN VERSION 4. 0 “ (http//www. imtech. res. in/raghava/mhcbn/index. html) ^ PDB- Wi M 库〃 Protein Data Bank" (http://www. rcsb. org/pdb)，或其它。众所周知且有很多文献记载，将HTL表位掺入原本非免疫原性的肽序列中或使它 结合非肽抗原，可以使它们具有高得多的免疫原性。结合pan-DR的肽HTL表位PADRE已经广泛地用于疟疾、阿尔茨海默氏病的疫苗设计和许多其它疫苗。根据MHCBN数据库(同上)的定义，T_细胞表位是与对应的MHC分子的结合亲和 力(IC5Q值)小于50，OOOnM的肽。这样的肽视作MHC结合物。根据该定义，截止2006年8 月，在MHCBN数据库的4. 0版中，可以得到下述数据20717种MHC结合物和4022种MHC不
结合物。合适的T-细胞表位也可以使用预测算法得到。这些预测算法可以扫描来自病原 体的现有蛋白序列中的推定T-细胞表位，或它们可以预测，从新设计的肽是否结合特定的 MHC分子。公众在因特网上可接近许多这样的预测算法。实例是SVRMHCdb (http //svrmhc. umn. edu/SVRMHCdb ;J. Wan 等人，BMC Bioinformatics 2006,7 463)，SYFPEITHI (http:// www. syfpeithi. de) ,MHCPred(http://www. jenner. ac. uk/MHCPred),基序扫描器(http:// hcv. lanl. gov/content/immuno/motif_scan/motif_scan)或针对 MHC II 结合分子的 NetMHCIIpan (http: //www. cbs. dtu. dk/services/NetMHCIIpan)和针对 MHC I 结合表位的 NetMHCpan(http://www. cbs. dtu. dk/services/NetMHCpan)。本文所述的和设计优选的HTL表位是通过生物物理学方法测得或通过 NetMHCIIpan预测会以优于500nM的结合亲和力(IC5(1值)结合任意MHC II分子的肽序列。 这些被视作弱结合物。优选地，这些表位通过生物物理学方法测得或通过NetMHCIIpan预 测会以优于50nM的IC5(I值结合任意MHC II分子。这些被视作强结合物。本文所述的和设计优选的CTL表位是通过生物物理学方法测得或通过NetMHCpan 预测会以优于500nM的结合亲和力(IC5Q值)结合任意MHC I分子的肽序列。这些被视作弱 结合物。优选地，这些表位通过生物物理学方法测得或通过NetMHCpan预测会以优于50nM 的IC5(I值结合任意MHC I分子。这些被视作强结合物。T-细胞表位的位置T-细胞表位可以掺入卷曲螺旋寡聚化结构域D1和/或D2肽序列内的几个位置。 为此，含有T-细胞表位的特定序列必须服从卷曲螺旋形成的规则以及MHC结合的规则。卷 曲螺旋形成的规则已经在上面详细描述。结合MHC分子的规则混入MHC结合预测程序中， 该程序使用复杂的算法来预测MHC结合肽。存在许多不同的HLA分子，其中在它们的序列中具有氨基酸限制的每一个会最佳 地结合它。在表3中总结了结合基序。在该表中，基序在显示x的位置可以具有任意氨基 酸，在方括号中，氨基酸(列表)仅可以在结合基序的特定位置。表3 :HLA基因型的MHC-结合基序 1)锚残基显示在方括号中。在锚位置优选的但是非优势的氨基酸显示在圆括号 中。例如，基序X-[VTILF]-X-X-X-X-X-X-[YF(ML)]是指，第二个和C-末端位置是锚位置。 在第二个位置的优势氨基酸是V，T，I，L，F，在C-末端锚位置的优势氨基酸是Y和F，同时 M和L是优选的，但是非优势的。2)Marsh2000 :Marsh S. G. E. , Parham P.和 Barber L. D.，The HLAFactsbook. Academic Press, San Diego,2000. URL :http://www.anthonynolan. com/HIG/. SYFPEITHI The SYFPEITHI Databaseof MHC Ligands, Peptide Motifs and Epitope Prediction. Jan. 2003. URL :http://www. syfpeithi. de. Luscher2001 :Luscher M. A.等人， Immunogenetics. 2001,53(1) :10-14. Yusim2004 :Yusim K.等人，Appl Bioinformatics 2005,4(4) :217-225。许多MHC分子具有非常类似的结合基序，因此它们可以分组成所谓的HLA超型。在 表4中总结了这些超型的结合基序。表4 :HLA超型的MHC-结合基序 也可以总结特定氨基酸在T-细胞表位的某个位置出现的频率。对于MHC结合， T-细胞表位中的位置1、4、6和9是最关键的位置。在表5中列出了在这些位置最优选的残 基，但是，这些位置的特定氨基酸偏好在不同的MHC分子之间有很大差异。因此，如上所述， 上面列出的预测程序可以更精确地预测特定氨基酸序列与MHC分子的结合。表5 在T-细胞表位的特定位置氨基酸的总频率(源自基序扫描器http://hcv. lanl. gov/content/immuno/motif_scan/motif_ scan) 从该表5可以容易地看出，例如，在位置1和位置4最频繁遇到的氨基酸是在卷曲 螺旋七肽重复的核心位置处发现的那些(用下划线指出)。位置1和4可以重叠在七肽重 复位置aa (a)和aa (d)。因此，在位置1具有氨基酸L和在位置4具有氨基酸V的T_细胞 表位与在七肽重复的核心位置aa (a)和aa(d)具有相同氨基酸的卷曲螺旋肽完全一致。因 此，如果肽序列服从两项T-细胞结合基序限制以及卷曲螺旋七肽重复基序限制，可以将它 掺入SAPN的卷曲螺旋寡聚化结构域中。通过调节肽序列的排列，使得T-细胞结合基序与 卷曲螺旋形成基序重叠，这可以对大量T-细胞表位实现。将T-细胞表位构建进卷曲螺旋为了构建SAPN，其在SAPN的卷曲螺旋寡聚化结构域中掺入T_细胞表位，必须 采取三步。在第一步中，必须使用来自文献或来自数据库的已知T-细胞表位或使用合适 的表位预测程序预测的T-细胞表位，选择候选T-细胞表位。在第二步中，必须将蛋白酶 体切割位点插入CTL表位的C-末端。这可以如下实现使用蛋白酶体切割位点预测程 序 PAProc (http://www. paproc2. de/paproc 1/paprocl. html ；Hadeler K. P.等人，Math.
36Biosci. 2004，188 :63_79)，并修饰紧挨在目标切割位点之后的残基。HTL表位不需要这第 二步。在第三步也是最重要的步骤中，必须将T-细胞表位序列与卷曲螺旋序列比对，使它 最佳地符合上述的卷曲螺旋形成规则。可以预测具有掺入的T-细胞表位的序列是否实 际上形成卷曲螺旋，使用可以从因特网上得到的卷曲螺旋预测程序s例如COILS(http:// www. ch. embnet. org/software/C0ILS_form. html ；Gruber M.等人，J. Struct. Biol. 2006, 155(2) 140-5) ^ MULTIC0IL(http://groups, csail.mit. edu/cb/multicoil/cgi-bin/ multicoil. cgi)，可以优化T-细胞表位序列和卷曲螺旋重复序列之间的最佳比对。即使不可能发现合适的比对(可能因为T-细胞表位含有与卷曲螺旋结构不相容 的一个甘氨酸或甚至一个脯氨酸)，也可以将T-细胞表位掺入寡聚化结构域(参见实施例 3)。在该情况下，T-细胞表位必须侧接相同寡聚化状态的强卷曲螺旋形成序列。这将会稳 定化卷曲螺旋结构至足够的程度，或者，它可以在该卷曲螺旋寡聚化结构域内产生环结构。 这基本上是与下一部分关于将B-细胞表位掺入SAPN的卷曲螺旋核心序列所述相同的程 序。将B-细胞表位构建进卷曲螺旋核心在本发明的一个特定方面，预见到将非a -螺旋状的小B-细胞表位掺入SAPN的 卷曲螺旋核心。这可以通过与上面关于与卷曲螺旋结构不相容的T-细胞表位所述相同的 程序来实现。T4 fibritin(pdb 登记码 laaO，http://www.rcsb.org/pdb/)的结构在它的 卷曲螺旋内含有2个环结构。环从2个螺旋回转之间的卷曲螺旋伸出，从而不阻断卷曲螺 旋的螺旋结构。在fibritin中，环在卷曲螺旋的位置aa(b)离开螺旋，在卷曲螺旋序列的 位置aa(c)重新进入螺旋。一个环是短的折叠，而另一个环是更不规则的环结构。卷 曲螺旋中残基aa(b)和aa(c)之间的距离理想地适合用作反向平行的折叠肽的锚点。 当残基aa(b)或aa(c)或它们二者是甘氨酸残基时，这允许存在蛋白二级结构所需的柔性， 并重新进入卷曲螺旋的a-螺旋。. . VQNLQVEIGNNSAGIKGQVVALNTLVNGTNPNGSTVEERGLTNSIKANETNIASVTQEV...ad ad a d ad ad ad a(SEQ ID NO 4)在上面fibritin的序列中，用斜体显示环结构，用下划线指示在aa(b)和aa(c) 位置处的残基(这里存在2个环，并重新进入螺旋)。这4个残基中的3个是甘氨酸残基。 用它作为模板，具有反向平行的0 “折叠构象的B-细胞表位现在可以掺入SAPN的卷曲螺 旋核心。卷曲螺旋结构必须足够稳定，以允许掺入这样的环结构，因此它必须能在环的两侧 形成卷曲螺旋。到目前为止描述的最小的自动折叠的卷曲螺旋序列是2个七肽重复长。在 下面的序列中，将来自HIV的蛋白gpl20的V3表位的尖端(它是一种反向平行的折叠 肽)掺入设计的稳定的卷曲螺旋的卷曲螺旋，其在两侧侧接超过2个七肽重复的螺旋。这 些是源自Burkhard P.等人，JMol Biol 2002，318 :901_910的非常稳定的卷曲螺旋片段。LEELERRLEELERRLEELERRLGSIRIGPGQTFYAGVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 5)ad ad ad adadad 核心残基这会使卷曲螺旋内的V3环的构象限制为反向平行的折叠构象，后者对应着该 肽在蛋白上的天然构象。优选的设计
为了构建用于特定用途的具有最佳免疫学性能的SAPN，必须考虑下述方面CTL表位在它们的C-末端需要蛋白酶体切割位点。表位应当不类似于人序列，以 避免自身免疫应答，除了当目标是引起针对人肽的免疫应答以外。可能的实例是实施例4 的癌症特异性的CTL表位。因此，这样的SAPN是优选的，其中至少一个T-细胞表位是CTL表位，且具体地，其 中所述序列在CTL表位后另外含有蛋白酶体切割位点。同样优选这样的SAPN，其中至少一个T-细胞表位是HTL表位，具体地，结合 pan-DR的HTL表位。这样的结合pan-DR的HTL表位会结合表3底部列出的许多MHC II类 分子，因此会在大多数健康个体中被识别，这对于好疫苗是至关重要的。也优选这样的SAPN，其中序列D1-L-D2含有一系列重叠的T_细胞表位，如果D1或 D2是三聚体(实施例7和8)、四聚体(实施例9)或五聚体(实施例10)。B-细胞表位需要显示在SAPN的表面。它们可以是或不是卷曲螺旋序列的一部 分，即卷曲螺旋自身可以部分地是B-细胞表位，这取决于卷曲螺旋的该部分是否是表面 可接触的。例如，由有包膜病毒的表面蛋白的三聚体卷曲螺旋组成的B-细胞表位可以 显示在SAPN的表面，同时是卷曲螺旋序列的一部分。在Raman S.等人，Nanomedicine Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006 ；2 :95_102 中，显示了这种设计的一个实 例。通常，任意寡聚化状态的卷曲螺旋特别适合以构象特异性的方式被SAPN呈递。卷曲螺 旋是丰富的，不仅在有包膜病毒的表面蛋白中，而且在例如疟疾病原体镰状疟原虫的基因 组中(Villard V 等人，PLoS ONE 2007 ；2 (7) :e645)。但是，一般而言，B_细胞表位不是卷曲螺旋寡聚化结构域的一部分，或它们可以由 卷曲螺旋和另一个不是卷曲螺旋的部分组成，例如细菌的三聚体自运载体粘连(TAA)，它们 具有卷曲螺旋茎和球形头结构域，例如脑膜炎萘瑟菌的TAA。特别感兴趣的是蛋白作为B-细胞表位，它们自身是寡聚体的，例如三聚体血凝素 和四聚体唾液酸酶或流感的M2表面蛋白。设计针对病原体的疫苗时的考虑方面这样的疫苗优选含有所有3类表位、B-细胞、HTL和CTL表位。(1)优选地，仅一 个(或非常少的)B-细胞表位应当位于肽链的任一端。在重复的抗原显示中，这会使B-细 胞表位位于SAPN的表面。(2)HTL表位应当尽可能是泛宿主性的。它们不一定需要源自病 原体，但是可以是引起强T-辅助免疫应答的肽。一个实例是PADRE肽。优选地，它们是掺 入SAPN的D1-L-D2核心序列中的T-细胞表位。(3)CTL表位需要是病原体特异性的，它们 需要具有C-末端蛋白酶体切割位点。因为T-细胞表位不需要重复的抗原显示，可以如下 将几种不同的T-细胞表位掺入一个单独的SAPN 通过共装配不同的肽链，所述不同的肽链 都具有相同的形成纳米颗粒的D1-L-D2核心，但是携带不作为核心形成序列的一部分因而 不会掺入卷曲螺旋序列中的不同T-细胞表位。以类似的方式，可以将携带靶向内质网的信号(即信号肽，其诱导蛋白或肽向内 质网(ER)的运输)的肽链共装配进同一个SAPN，以使CTL表位进入内质网，被MHC I分子 适当呈递，因为交叉呈递在人中不是非常有效。但是，靶向内质网的信号不需要在分开的 肽链上，它可以在与CTL表位相同的肽中。合适的内质网信号肽是例如靶向内质网的信号 (E3/19K)MRYMILGLLALAAVCSA(SEQ ID NO :6)。
目的在于产生强抗体应答的治疗疫苗目的在于产生强抗体应答的治疗疫苗特别地用于治疗阿尔茨海默病、高血压、肥 胖症、药瘾或炎症。对于这样的疫苗，优选使用仅一个B-细胞表位。通过在SAPN中包含 一个或更多个泛宿主性的HTL表位，可以进一步增强归因于重复抗原显示的强体液免疫应 答。优选地，它们是掺入SAPN的D1-L-D2核心序列中的T-细胞表位。此外，应当存在尽可 能少的和尽可能弱的结合CTL表位——特别不针对人肽，以避免自身免疫应答。用于诱导CTL应答例如针对癌症的治疗疫苗在该情况下，不必使用B-细胞表位。通过在SAPN中包含一个或更多个泛宿主性 的HTL表位，进一步增强针对特定CTL表位(例如MAGE-1，2，3 ；MART-1，2，3 ；或Her-2/neu， 也参见实施例4)的免疫应答。作为佐剂的自装配肽纳米颗粒(SAPN)由许多HTL表位组成的SAPN会诱导强T_辅助免疫应答(参见实施例2)。如果 以与任意其它疫苗制剂相同的剂量施用，这会导致免疫应答的刺激。这样的SAPN将成为佐 剂，不需要任意CTL或B-细胞表位。但是，B-细胞和CTL表位可以与这样的佐剂SAPN相 组合。另外，可以将特定佐剂分子共价偶联至SAPN，作为寡聚化结构域D1或D2的取代物， 以进一步刺激SAPN的佐剂效应。特别感兴趣的是免疫刺激的核酸，优选含有脱氧肌苷的寡 脱氧核苷酸，含有脱氧尿苷的寡脱氧核苷酸，含有CG基序的寡脱氧核苷酸，或含有肌苷和 胞苷的核酸分子。其它免疫刺激的分子是，例如，抗微生物的肽，例如阳离子肽，它们是一类 能促进和/或提高适应性免疫应答的免疫刺激性的、带正电荷的分子。这样的具有免疫增 强性质的肽的一个实例是带正电荷的人工的抗微生物的肽KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO :63)， 它在激发_强化免疫接种后会诱导有效的蛋白特异性的类型_2驱动的适应性免疫。优选地，本发明的抗原选自(a)适合诱导针对癌细胞的免疫应答的蛋白；(b)适 合诱导针对感染性疾病的免疫应答的蛋白或碳水化合物；(c)适合诱导针对变应原的免疫 应答的蛋白；(d)适合诱导治疗人疾病的免疫应答的肽激素；和(e)适合诱导治疗成瘾或其 它病症的免疫应答的半抗原分子。包含这样的蛋白、其肽片段、肽、碳水化合物或半抗原的 肽纳米颗粒，可以适合诱导人或畜牧动物和宠物的免疫应答。在本发明的一个优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是可用于预防感染性疾病 的那些。这样的治疗可用于预防影响广范围宿主的多种感染性疾病，例如人或非人动物，例 如牛、羊、猪、狗、猫、其它哺乳动物物种和非哺乳动物物种。具体地，本发明涉及包含下述抗原之一的SAPN
(a)适合诱导针对细菌的免疫应答的抗原；
(b)适合诱导针对病毒的免疫应答的抗原；
(c)适合诱导针对寄生虫的免疫应答的抗原；
(d)适合诱导针对癌细胞的免疫应答的抗原；
(e)适合诱导针对变应原的免疫应答的抗原；
(f)适合诱导针对成瘾的免疫应答的抗原；
(g)适合诱导针对疾病和代谢性病症的免疫应答的抗原
(h)适合诱导畜牧动物的免疫应答的抗原；和
(i)适合诱导宠物的免疫应答的抗原。
可治疗的感染性疾病是本领域技术人员众所周知的。实例包括病毒的、细菌的或 寄生虫的病因学感染，例如下述疾病阿米巴病，炭疽，弯曲杆菌感染，水痘，霍乱，登革，白 喉，脑炎，埃博拉，流感，日本脑炎，利什曼病，疟疾，麻疹，脑膜炎球菌疾病，腮腺炎，医院感 染，百日咳，肺炎球菌疾病，小儿麻痹症(脊髓灰质炎)，风疹，带状疱疹，血吸虫病，破伤风， 蜱传脑炎，滴虫病，锥虫病，结核病，伤寒，水痘，和黄热病。具体地，本发明涉及包含来自下述寄生虫的下述抗原之一的SAPN:弯曲杆菌属， 巨细胞病毒，EB病毒，口蹄疫病毒，B型流感嗜血杆菌，幽门螺旋杆菌，乙型肝炎病毒，丙型 肝炎病毒，戊型肝炎病毒，单纯疱疹病毒，人免疫缺陷病毒，人乳头状瘤病毒，脑膜炎萘瑟 菌，绿脓假单胞菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，呼吸道合胞病毒，轮状病毒，蛔虫，钩虫， 和西尼罗病毒。在本发明的一个优选的方面，预见到用于预防和治疗疟疾的组合物(实施例11)。 疟疾寄生虫的生命周期提供了几个在这期间的干扰会导致感染过程停止的阶段。在疟疾寄 生虫的生命周期中，因为雌性疟蚊的叮咬，人受到疟疾的感染。蚊子将它的探针插入宿主， 在这过程中，注射子孢子形式的镰状疟原虫(或间日疟原虫)，后者存在于蚊子的唾液中。 可能适用于设计肽疫苗的蛋白和肽序列可以含有来自下述疟原虫蛋白的序列MSP-1 ( — 种在寄生虫细胞表面表达的大多形蛋白)，MSA1 (主要的裂殖子表面抗原1)，CS蛋白(天然 的环子孢子)，根据美国专利4，735，799的35KD蛋白或55KD蛋白或195KD蛋白，AMA-1 (顶 膜抗原1)，或LSA (肝阶段抗原)。在一个优选的设计中，B-细胞表位之一是8至约48个残基的序列，其构成环子孢 子(CS)蛋白的B细胞表位。该B-细胞表位是镰状疟原虫的氨基酸序列NANP的多余重复 区域。在一个优选的SAPN设计中，该B细胞表位包含氨基酸残基序列NANP或其变换ANPN、 NPNA和PNAN的2至约5个重复。间日疟原虫中对应的重复区域由下述高度相似的序列中 的任一个组成表6 间日疟原虫CS重复B-细胞表位序列 在一个优选的设计中，B-细胞表位之一是由这些序列中的任一个组成的8至约48 个残基的序列。在下面的3个表中为B-细胞表位、HTL-表位和CTL-表位列出了用于设计治疗疟 疾的SAPN的具体肽序列。下面的表7列出了优选的镰状疟原虫卷曲螺旋B-细胞表位(Villard V.等人， PLoS ONE 2007,2(7) :e645 和 Agak G. W.，Vaccine (2008) 26，1963-1971)。因为对于 B_ 细 胞表位，仅表面可接近的残基对于它们与B-细胞受体的相互作用和抗体的生产是至关重 要的，可以在一定程度上修饰非表面暴露的在aa(a)和aa(d)位置的卷曲螺旋核心残基，而 不改变免疫原的引起中和抗体的能力。例如，用异亮氨酸交换在aa(a)位置的缬氨酸，不会 影响卷曲螺旋B-细胞表位的以便免疫学性质。因此，通过为最好的卷曲螺旋形成和稳定性 优化核心残基，可以人工地稳定化这些卷曲螺旋序列(实施例13)，而不消除它们的免疫学 潜力。因此，也为这些B-细胞表位预见到在它们于aa (a)和/或aa(d)处的核心残基中的 一个或更多个处修饰这些肽B-细胞表位，且保持上面详述的形成卷曲螺旋的倾向。因而，在一个优选的设计中，在它们的一个或更多个核心位置具有修饰的卷曲螺 旋B-细胞表位是这样的肽，其含有至少一个长度为2个七肽重复的序列，用卷曲螺旋预测 程序COILS预测，利用14、21或28的窗大小中的至少一个，所有它的氨基酸形成卷曲螺旋 的概率高于0.9。在一个更优选的设计中，在它们的一个或更多个核心位置具有修饰的卷曲螺旋 B-细胞表位是这样的肽，其含有至少一个长度为3个七肽重复的序列，用卷曲螺旋预测程 序COILS预测，利用14、21或28的窗大小中的至少一个，所有它的氨基酸形成卷曲螺旋的 概率高于0. 9。在另一个更优选的设计中，在它们的一个或更多个核心位置具有修饰的卷曲螺旋 B-细胞表位是这样的肽，其含有至少两个分开的长度为2个七肽重复的序列，用卷曲螺旋 预测程序COILS预测，利用14、21或28的窗大小中的至少一个，所有它的氨基酸形成卷曲 螺旋的概率高于0.9。表7 镰状疟原虫卷曲螺旋B-细胞表位序列 下面的表8列出了优选的镰状疟原虫HTL表位(Doolan，D. L.，Thejournal of Immunology, 2000,165 :1123_1137 ；美国专利 5，114，713)表8 镰状疟原虫HTL表位序列 下面的表9列出了优选的镰状疟原虫CTL表位(美国专利5，028，425，5，972，351， 6，663，871)表9 镰状疟原虫CTL表位序列 在本发明的另一个优选的方面，预见到用于预防和治疗HIV的组合物(实施例5 和12)。为了制备抗-HIV疫苗，可以使用能引起HIV-特异性的抗体的合成肽，所述合成肽 具有HIV-1的外膜或gag蛋白或gpl20或gp41的功能性的T-细胞表位或B-细胞表位的氨 基酸序列，以提供免疫应答。特别感兴趣的是在gp41或gpl20内的序列，它们可以诱导构 象特异性的能干扰融合过程的中和抗体，如已知的抗体2F5和4E10，或来自gp41或gpl20 的V3-环。这样的序列主要位于HR1和HR2和簇I和簇II区域中或附近。结合例如gp41 的卷曲螺旋三聚体且由本发明的掺入该卷曲螺旋三聚体的肽纳米颗粒引起的抗体，会抑制 发夹形成，并从而抑制病毒融合。类似地，针对埃博拉或具有类似融合过程的另一种病毒的 三聚体卷曲螺旋产生的抗体，会抑制这些病毒的病毒进入。使用Letourneau S.等人，PLoS ONE 2007,10 :e984所述的高度保守的HIV蛋白序 列，使用 SVRMHCdb (http //svrmhc. umn. edu/SVRMHCdb ；Wan J.等人，BMC Bioinformatics 2006，7 :463)，预测CTL表位。这些保守的蛋白序列含有CTL表位，据预测其会结合在表10 中列出的HLA分子，且是设计SAPN-HIV疫苗的优选CTL表位。这些肽表位含有大量重叠的 序列，它们可以组合成更长的肽序列，后者在一个单独的连续肽串中具有多个CTL表位(表 11)。表10 预测的保守的HIV CTL表位 表11 预测的保守的组合的HIV CTL表位 在本发明的另一个优选的方面，预见到用于预防和治疗流感的组合物。甲型流感 编码完整的膜蛋白M2，它是一种同源四聚体，它的亚基具有一个23个氨基酸残基的小外部 结构域(M2e)。天然M2蛋白以几个拷贝存在于病毒颗粒中，并通过大量的其它2种表面蛋白 血凝素和唾液酸酶回避免疫系统。另一方面，它大量存在于病毒感染的细胞的膜表面。M2e 的序列是高度保守的。已经证实，M2e作为嵌合的GNC4-M2e蛋白中的四聚体呈递给免疫系 统，产生高度特异性的且保护性的体液免疫应答(DeFilette M.等人，J Biol Chem 2008 ； 283(17) 11382-11387)。对于人和禽特异性的流感株而言，M2e四聚体是高度保守的B_细胞表位(表12和 13)。在本发明的一个优选的实施方案中，当结合来自SAPN的tetrabrachion (或任意其它 四聚体卷曲螺旋)的四聚体卷曲螺旋的N-末端时，它可以显示它的天然四聚体构象(实施 例9)。表12 :M2e人特异性的M2e序列 表13 :M2e禽特异性的M2e序列 通过前体蛋白切割成2个分开的肽链，激活流感血凝素(HA) (Steinauer D. S.等 人，Virology 1999 ；258 :1_20)。需要HA前体分子HAO的切割来激活病毒感染力，激活蛋 白酶在宿主中的分布是趋向性和相应病原性的决定因素之一。哺乳动物和非病原性的禽病 毒的HAs在细胞外切割，这会限制它们在宿主中传播至遇到适当蛋白酶的组织。另一方面， 病原性病毒的HAs在细胞内被广泛存在的蛋白酶切割，因此具有感染不同的细胞类型并造 成全身感染的能力。不同于M2e序列，切割肽的N-末端部分不是高度保守的(切割肽的C-末端实际 上是高度保守的)。在HA前体蛋白中，切割肽是表面暴露的，在切割位点周围的6个残基 (切割位点每一侧3个残基)是该肽序列的最大特征(在表14中用粗体突出显示)。在一 个优选的SAPN设计中，这6个残基代表B-细胞表位，它们可以诱导抗体，后者在结合该肽 后，可以保护HA前体蛋白免于切割。通过共装配具有相同的SAPN形成核心D1-L-D2、但是结合不同B-细胞表位的的 肽，可以将SAPN理想地用于显示对不同HA类型特异性的多种不同的切割序列(表14)(实 施例15)。表14 来自甲型流感和乙型流感的血凝素切割位点序列
类型序列SEQ ID NO HlSIQSRGLFGA211 例如，包含H1、H2和H3切割位点序列(其具有插入的天冬氨酸氨基酸，使该序列更 易溶和碱性更低)的血凝素B-细胞表位串看起来象SIQSRGLFGDIESRGLFGERQTRGire (SEQ ID NO 227)。可以将具有相同核心序列、但是具有不同B-细胞表位或表位串的肽共装配进一 个SAPN，生成多价SAPN免疫原，其可能包括表14的所有或大部分重要的(对于人疫苗而 言，HI, H2，H3，H5，H7 和 H9)序列(实施例 15)。在一个类似的方案中，可以将由6条肽链组成的流感疫苗SAPN共装配进一个 SAPN,所述肽链含有相同的核心和相同的N-末端B-细胞表位M2e和约20个在C-末端的 CTL表位(每条肽链3个或4个)(实施例14)。在表15中，列出了来自Parida R.等人， Vaccine 2007,25 :7530_7539的优选的保守的CTL表位。由于这6条肽链的核心是相同的， 这6条肽链共装配进一个SAPN，会将约20个不同的CTL表位掺入一个SAPN。
表15 来自Parida R.等人的保守的流感CTL表位 在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物是免疫治疗剂，其可以用于治疗代 谢性病症和疾病或成瘾。最优选的是用于治疗阿尔茨海默病、高血压、肥胖症、尼古丁和可 卡因成瘾的免疫治疗剂。表16 用于SAPN疫苗的B细胞表位 Αβ-片段(Αβ)是42个氨基酸长的肽(Αβ1-42)。因为整个42个残基长的肽 序列也含有可以造成自身免疫反应的CTL表位，希望仅使用该肽的更短的片段用于疫苗设 计，例如A β 1-12或甚至象A β 1-6这样的短肽(美国专利7，279，165)。同样，全长TNFa蛋白作为免疫原具有一些限制。局部过量生成的促炎症细胞因 子TNFa至关重要地参与几种慢性阳性病症的发病机理，包括类风湿性关节炎、银屑病和 克罗恩病。用单克隆抗体(mAbs，英夫利昔单抗，阿达木单抗)或嵌合的可溶性受体(依那 西普)中和TNFa，可以有效地治疗这些病症，但是具有几个潜在的缺点。它可能诱导同种 异型-或个体基因型特异性的抗体，后者可能限制在许多患者中的长期功效。此外，随着 治疗的患者的数目的增加，越来越明显的是，用TNFa-拮抗剂(具体地，mAbs)进行治疗会 增加机会性感染的风险，特别是由细胞内病原体如结核分支杆菌、单核细胞增多性李司忒 菌或夹膜组织胞浆菌造成的那些。已经证实，用仅包含残基4-23的TNF α的更短片段进行 免疫接种，会避免一些这样的问题(G. Spohn等人，The Journal of Immunology, 2007,178 7450-7457)。因此，免疫接种TNF α 4_23是类风湿性关节炎和其它自身免疫病的一种新颖 的有效疗法，这会为现有的抗-TNF α疗法增加新水平的安全性。通过选择性地仅靶向可溶 形式的TNF α和节省跨膜形式，用疫苗中和TNF α的致病效应，同时在宿主对细胞内病原体 的应答中的重要功能保持完整。除了尼古丁和可卡因以外，下述化合物也可以用作半抗原分子，用于设计针对成 瘾的B-细胞SAPN疫苗阿片制剂，大麻，苯异丙胺，巴比妥酸盐，格鲁米特，甲乙哌酮，水合 氯醛，甲喹酮，苯并二氮卓，LSD，抗胆碱能药，抗精神病药，色胺，其它精神症状药物，镇静 药，苯环利定，赛洛西宾，挥发性的亚硝酸盐，和诱导躯体依赖性和/或精神依赖性的其它 药物。在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物是可以用于治疗变态反应的免疫治 疗剂。用于治疗变态反应的组合物和方法的抗原或抗原决定簇的选择，是治疗这样的病症 的医学领域的技术人员已知的。这类抗原或抗原决定簇的代表性实例包括蜂毒磷酸脂肪 酶A2，Bet ν 1(白桦花粉变应原)，5DoI m V(白脸大黄蜂毒液变应原)，和Der ρ I (房尘 螨变应原)。在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物是可以用于治疗癌症的免疫治疗 剂。靶向疫苗设计的主要癌症如下脑癌，乳腺癌，子宫颈癌，结肠直肠癌，食管癌，成胶质细 胞瘤，白血病(急性骨髓性和慢性髓细胞样)，肝癌，肺癌(非小细胞肺癌，小细胞肺癌)，淋 巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，黑素瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肾癌。用于治疗癌症的组合物和方法的抗原或抗原决定簇的选择，是治疗这样的病症的医学领域的技术人员已知的。这类抗原或抗原决定簇的代表性实例包括下述的HER2/ neu(乳腺癌)，GD2(神经母细胞瘤)，EGF-R (恶性成胶质细胞瘤)，CEA (髓样甲状腺癌)， ⑶52(白血病)，MUC1 (在血液恶性肿瘤中表达)，gpl00蛋白，或肿瘤抑制基因WTl的产物。 在表17中，显示了感兴趣的癌症特异性的T-细胞表位和相关的起源蛋白和MHC限制。表17 =SAPN疫苗的癌症T-细胞表位 最优选的是在实施例中所述的卷曲螺旋序列、B-细胞_、HTL-和CTL-表位、单体 构造块、SAPN和疫苗设计。
实施例下面的实施例用于进一步解释本发明，但是不以任何方式限制本发明的范围。实施例1 :PADRE(P5c-8_Mal)使用下述的设计标准，将含有序列AKFVAAWTLKAAA (SEQ IDNO 296)的pan_DR表 位PADRE掺入SAPN的三聚体卷曲螺旋残基丙氨酸(A)具有形成α-螺旋的强倾向。排 列卷曲螺旋核心位置，使得残基缬氨酸、色氨酸和丙氨酸位于七肽重复图谱的aa(a)、aa(d) 和另一个aa(a)位置。设计位于HTL表位的N-末端和C-末端的三聚体卷曲螺旋的剩余部 分，使得该序列预测会形成非常强的卷曲螺旋。RLLARLEELERRLEELAKFVAAffTLKAAAVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO 7)d ad ad ad ad ad ad 核心残基用预测程序COILS预测，该肽的序列(SEQ ID NO 7)会形成卷曲螺旋。使用21个 氨基酸的窗口用于卷曲螺旋预测，序列中的所有残基形成卷曲螺旋的概率超过95% (参见 下面的表18)。因此这是预测的也含有T-细胞表位的卷曲螺旋。非常重要地认识到，如果窗口仅包含14个氨基酸，在T-细胞表位序列内卷曲螺旋 预测下降至小于2%概率的非常低的值。在整个序列中具有高预测卷曲螺旋倾向的21个氨 基酸的更大的窗大小显示出在T-细胞表位的N-和C-末端的侧接区域的效应。如果它们
55是强烈有利于卷曲螺旋形成的序列，则可以补偿T-细胞表位的不太有利于卷曲螺旋倾向， 且可以诱导整个序列形成卷曲螺旋，即使T-细胞表位不含有非常有利的卷曲螺旋序列。表18 包含PanDR表位PADRE的SEQ ID NO 7的卷曲螺旋倾向 然后将SEQ ID NO 7的该三聚体卷曲螺旋包含进下面SEQ ID NO 8的SAPN序列 中，后者包含His-标签、COMP的五聚体卷曲螺旋、由包含PADRE T-细胞表位的SEQ ID NO 7序列组成的三聚体卷曲螺旋、和来自柏格鼠疟原虫的CS-蛋白的B-细胞表位。MGHHHHHHGDffKffDGGLVPRGSDEMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLRALLMGGRLLARLEE
LERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELARGGS⑶PPPPNPNDPPPPNPND(SEQ ID NO 8)在大肠杆菌中表达具有该序列的肽，并通过标准的生物技术操作，在镍亲和柱 上纯化° 根据 Raman S.等人，Nanomedicine :Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 95-102，进行重新折叠。通过动态光散射(DLS)技术和透射电子显微术(TEM)，分析 重新折叠的SAPN的纳米颗粒形成。DLS分析显示出平均粒径为32. Olnm的良好大小分布， 多分散性指数为12. 9% (图4A)。TEM照片(图4B)显示出通过DLS测得相同大小的纳米 颗粒。实施例2 :P5c-6- 一般的该卷曲螺旋序列含有4个重叠的HTL表位，各自具有序列LEELERSIW、IWMLQQAAA、 WMLQQAAAR和MLQQAAARL，它们通过算法SVRMHC预测会分别结合不同的MHC II分子 DQA1*0501、DRB1*0501、DRB5*0101 和 DRB1*0401，预测的结合亲和力(pIC50 值)分别是 6. 122,8. 067,6. 682和6. 950。使这些HTL表位与卷曲螺旋七肽重复对齐，使得它们预测会 形成非常强的卷曲螺旋。卷曲螺旋的aa(a)和aa(d)核心位置被Leu、Leu、lie、Leu、Ala 和Leu占据，它们中的大多数对于高形成卷曲螺旋的倾向而言是非常好的残基，仅Ala是稍 微不太有利的。RLLARLEELERSIWMLQQAAARLERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO 9)d ad ad ad ad ad ad 核心残基结果，通过预测程序COILS预测该肽的序列会形成卷曲螺旋。该序列中HTL表位 的所有残基形成卷曲螺旋的概率超过99% (表19)。对比用于卷曲螺旋预测的小和大窗尺 寸，再次显示出侧接序列对卷曲螺旋稳定性的影响。利用28个氨基酸的窗大小，预测完整 序列形成卷曲螺旋的概率是100%，而14个氨基酸的更小的窗大小显示出N-末端处T-细 胞表位的更低卷曲螺旋倾向的效应，卷曲螺旋形成具有更低的预测值。因此，对于完整序 列，预测该肽会形成包含4个不同HTL表位的稳定卷曲螺旋。表19 包含4个不同HTL表位的SEQ ID NO 9的卷曲螺旋倾向
然后将该三聚体卷曲螺旋包含进下面SEQ ID NO 10的SAPN序列中，后者包含 His-标签、COMP的五聚体卷曲螺旋、SEQ ID NO 9的三聚体卷曲螺旋、和来自柏格鼠疟原虫 的CS-蛋白的B-细胞表位。MGHHHHHHGDffKffDGGLVPRGSDEMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLRALLMGGRLLARLEELERSIWMLQQAAARLERAINTVDLELAALRRRLEELARGGS⑶PPPPNPNDPPPPNPND(SEQ ID NO: 10)在大肠杆菌中表达具有该序列的肽，并通过标准的生物技术操作，在镍亲和柱上 纯化。根据Raman S.等人，Nanomedicine (同上)，进行重新折叠。通过动态光散射(DLS) 技术和透射电子显微术(TEM)，分析重新折叠的SAPN的纳米颗粒形成。DLS分析显示出平 均粒径为46. 96nm的良好大小分布，非常低的多分散性指数为8. 7%。TEM照片(图5)显 示出约30nm大小的纳米颗粒。实施例3 :Tlc-7_流感该卷曲螺旋序列含有2个具有序列IRHENRMVL和YKIi7KIEKG的共有HTL表位，它 们分别来自甲型流感病毒的蛋白Ml和神经氨酸酶。通过计算机算法SVRMHC，预测它们强烈 地结合MHC II分子DRB1*0405和DRB1*0401，预测的结合亲和力(pIC50值)分别是8. 250 和 6. 985。此外，根据 Parida R.等人，vaccine 2007，25 :7530_7539，预测第一个 T-细胞 表位IRHENRMVL也会结合许多其它的HLA分子，例如B14，B1510，B2705，B2706，B3909，DP9， DRl 1, DR12，DR17，DR53，和DRB1，即它是预测的泛宿主性的表位。下面显示了这些HTL表位与卷曲螺旋七肽重复的最佳比对(SEQ IDN0:11)。但 是，这些表位中的第二个表位的序列含有一个不利的甘氨酸残基，它通常作为破坏螺旋的 残基。卷曲螺旋三聚体的侧接部分是相对短的序列，但是具有强烈的形成卷曲螺旋的倾向。 当在卷曲螺旋预测程序COILS中使用14个氨基酸的小窗口时，显然为T-细胞表位的两侧 预测出卷曲螺旋结构(参见下面的表20)。因此，整个序列会再次作为单个折叠单元，并形 成具有三聚体寡聚化状态的稳定卷曲螺旋。RLLARLEEIRHENRMVLYKIFKIEKGINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO 11)d ad ad ad ad ad ad 核 4、残基表20 包含2个来自甲型流感病毒的HTL-表位的SEQ ID NO 11的卷曲螺旋倾向 然后将该三聚体卷曲螺旋包含进下面的SAPN序列SEQ ID N0:12，后者包含 His-标签、五聚体Trp-拉链卷曲螺旋、上述的三聚体卷曲螺旋和来自柏格鼠疟原虫的 CS-蛋白的B-细胞表位。MGHHHHHHGDffKffDGGLVPRGSffQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEEIRHENRMVLYKIFKIEKGINTVDLELAALRRRLEELARGGS⑶PPPPNPNDPPPPNPND(SEQ ID NO: 12)在大肠杆菌中表达具有该序列的肽，并通过标准的生物技术操作，在镍亲和柱上 纯化。根据Raman S.等人，Nanomedicine (同上)，进行重新折叠。通过动态光散射(DLS)技术和透射电子显微术(TEM)，分析重新折叠的SAPN的纳米颗粒形成。DLS分析显示出平 均粒径为57. 70nm的稍微更宽的大小分布，多分散性指数为21.6%。TEM照片(图6)显示 出约30-50nm大小的纳米颗粒。它们中的一些具有粘到一起的倾向，重新折叠条件需要更 多的改进。实施例4 癌症CTL表位的卷曲螺旋的预测在下面的实施例中，证实了如何将癌症特异性的T-细胞表位包含进形成SAPN的 肽中。将19种不同的T-细胞表位构建进SAPN的三聚体卷曲螺旋，计算这些序列的前10 个的对应的卷曲螺旋倾向。非常清楚地发现，T-细胞表位的卷曲螺旋倾向相当低，但是具 有非常高卷曲螺旋倾向的侧接序列会在整个序列中补偿和诱导卷曲螺旋形成，这类似于上 面实施例1-3所证实的。VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEMLLAYLYQLERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO: 13)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEELLDGTATLRLAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 14)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLLIYRRRLMKLERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 15)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEILTYILGYLERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 16)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERELAGIGILTYELERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 17)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRMSLQRQFLRELERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 18)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEKIFGSLAFLERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 19)WQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALMGGRLLARLEELERRLEnMYVGILERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 20)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERLLHETDSAYEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 21)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERALFDIESKYEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 22)表21 包含癌症CTL表位的SEQ ID NO 13至SEQ ID NO 22的卷曲螺旋倾向
64 下面的序列同样显示出高卷曲螺旋倾向，尽管T-细胞表位的卷曲螺旋倾向相当 低，但是具有非常高卷曲螺旋倾向的侧接序列会在整个序列中补偿和诱导卷曲螺旋形成。
VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLSLFRAYITKLERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 23)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERKMYELVHFLEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 24)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRYLQLYFGIEYLERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 25)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERAARAVFLALEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 26)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEEQDLTMKYQIFAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 27)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELEREAYGLDFYILELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 28)ffQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLSYLDSGIHFLERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 29)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEETYSEQSNYERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 30)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELEEKLIYYLFRLEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 31)实施例5 :HIV-V3该卷曲螺旋序列含有反向平行的β -折叠肽，它是来自HIV的gpl20的V3环的尖 端。该肽是HIV的众所周知的B-细胞表位。通过在卷曲螺旋的位置aa(b)和aa(c)处的 2个甘氨酸残基，将它插入卷曲螺旋七肽重复。卷曲螺旋三聚体的侧接部分是相对短的序列，但是具有强烈的形成卷曲螺旋的倾 向。当在卷曲螺旋预测程序COILS中使用14个氨基酸的小窗口时，显然为B-细胞表位的 两侧预测出卷曲螺旋结构(参见下面的表22)。因此，整个序列会作为单个折叠单元，并形 成稳定的卷曲螺旋，其具有含有突出的折叠肽的三聚体寡聚化状态。RLLARLEELERRLEELERRLEELERRLGSIRIGPGQTFYAGVDLELAALRRRLEELARdadadadad ad ad 核 4、残基(SEQ ID NO 32)表22 包含HIV的2个B-细胞表位的SEQ ID NO 32的卷曲螺旋倾向实施例6 :P5c的分析超速离心使用His-标签亲和纯化方案，在标准的大肠杆菌表达系统中重组表达下述序列 (SEQ ID NO 33)的肽MGHHHHHHGDffKffDGGLVPRGSDEMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLRALLMGGRLLARLEELERRLEELERRLEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 33)该序列与来自实施例1和2的序列(SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 10)相关，但是没 有C-末端B-细胞表位。形成的SAPN不具有2个螺旋之间的二硫键(标下划线的残基55 禾口 64，与 Raman S.等人，Nanomedicine :Nanotechnology，Biology，and Medicine 2006 ；2 95-102的原始设计相比，用丙氨酸替代2个半胱氨酸)，但是具有替代的更小的氨基酸丙氨 酸，允许2个螺旋之间实现更小的角度，因此超过60个肽链被掺入SAPN中。为从单体构造块SEQ ID NO :33装配纳米颗粒，测试了 3种条件。通过分析超速 离心，评估 SAPN 的分子量(MW)以 0. 42mg/ml、0. 34mg/ml 和 0. 21mg/ml，将肽溶于 150mM NaCl、20mM Tris、pH 7.5。测量的分子量对应着由约330个单体组成的SAPN，即比60个不 对称单位的规则多面体所需单体更多的纳米颗粒(表23)。两个寡聚化结构域的2个螺旋 不是通过二硫键固定它们彼此的相对方位，更小的氨基酸丙氨酸允许2个螺旋更接近，因 此允许它们之间的角度更小。表23 =SEQ ID NO 33的分析超速离心 实施例7 具有一系列重叠的测量的HTL表位的三聚体卷曲螺旋(pan3m)下面是包含来自乙型肝炎病毒聚合酶的肽表位的三聚体卷曲螺旋设计的一个 实例，已经测量了它们对不同MHCII分子的结合亲和力(Mizukoshi E.等人，J Immunol 2004,173 :5863-5871)。根据该文件中所述的原理，将这些肽中的2个先后设计进三聚体卷 曲螺旋。RLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDYSAAFRRLEELEARYM(SEQ ID NO 34)d ad ad ad ad ad ad a 核 4、残基测量的来自乙型肝炎病毒聚合酶的序列LQSI DRBl * 0301 (62)，DRBl * 0401(10)，DRBl * 0405(17), DRBl * 0701 (173)，DRBl * 0802 亲和(598)，DRBl * 0901(791)， DRBl * 1101(303),DRBl * 1201(397)，DRBl * 1302(143)，DRBl * 1501(21)， DRB3 * 0101(5)，DRB4 * 0101 (7)，通过预测程序C0ILS，预测该肽的序列会形成卷曲螺旋。序列中所有残基形成卷曲 螺旋的概率超过98% (表24)，因此预测整个序列会形成完全折叠的卷曲螺旋。表24 =SEQ ID NO 34的卷曲螺旋倾向 实施例8 具有一系列重叠的预测的HTL表位的三聚体卷曲螺旋(pan3p)下面是三聚体卷曲螺旋设计的一个实例，其包含来自(Mizukoshi E.等人，J Immunol 2004,173:5863-5871)的 SEQ ID NO :34 的 HTL 表位的小部分以及作为 PADRE HTL 表位序列的小部分的序列。RLLARLEELERRLEELARFYAAffTLKYREVERELSffLSLDYSAAFR(SEQ ID NO 35)d ad ad ad ad ad ad 核心残基下面是通过算法NetMHCII预测的序列ARFVAAWTLKVREVERELSWLSLDVSAAF中含有 的表位对下述不同MHCII分子的结合亲和力(括号中是结合亲和力，按nM计算)DRBl * 0101(23)， DRBl * 0401(72)，DRBl * 0405(37), DRBl * 0701 (164)，DRBl * 0802 (462)，DRBl * 0901(440)，DRBl * 1101 (271)，DRBl * 1302 (303)，DRBl * 1501(16), DRB3 * 0101(60)， DRB4 * 0101(51).该序列在有些部分含有与序列pan3m(SEQ ID NO :34)相同的表位，它们实际上已经表现出比NetMHCII程序预测更强的对MHCII分子的结合力(Mizukoshi E.等人，J Immunol 2004，173 :5863_5871)。通过预测程序COILS预测，该肽的序列会形成卷曲螺旋。除了最后8个残基以外， 序列中的所有残基(表25)形成卷曲螺旋的概率超过80%，因此预测该序列形成完全折叠 的卷曲螺旋，C-末端扰乱(fray) —部分距离，这不会妨碍SAPN形成，因为在N-末端的大 部分序列形成卷曲螺旋。表25 =SEQ ID NO 35的卷曲螺旋倾向 实施例9 具有一系列部分重叠的预测的HTL表位的四聚体卷曲螺旋(BN5c_M2eN)tetrabrachion(Stetefeld J. ^X, Nature Structural Biology 2000, 7(9) 772-776)的四聚体卷曲螺旋序列的特征在于十一肽卷曲螺旋重复，而不是七肽重 复。下面是源自该四聚体卷曲螺旋的轻微修饰的序列。LYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLM(SEQ ID NO 36)efghi jkabcdefghi jkabcdefghi jkabcdefghi jkab 核jI^残基该四聚体卷曲螺旋特别适合作为SAPN的核心卷曲螺旋，因为它含有一系列重叠 的预测的 HTL 表位。通过算法 NetMHCII 预测，表位 YRLTVIIDD、LKNLITLRA、LITLRADRL、 IINDNVSTLR、INDNVSTLRA和VSTLRALLM的序列会分别结合不同的MHC II分子DRBl * 0101，DRBl * 0401，DRBl * 0404，DRBl * 0405，DRBl * 0701，DRBl * 1101，DRBl * 1302 JPDRBl * 1501预测的结合亲和力(nM)分别是3、48、78、162、243、478、12和420。该四聚体卷曲螺旋也特别适合呈递四聚体B-细胞表位，例如来自流感的M2e肽， 这已经在具有下面的序列(SEQ ID NO 37)的人疫苗SAPN设计中实现MGHHHHHHASLVPRGSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELERRLEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 37)该肽(SEQ ID NO :37)含有，从N-末端开始His-标签，来自人特异性的流感株 的M2e B-细胞表位，具有HTL表位的四聚体卷曲螺旋，连接物，和三聚体卷曲螺旋。在大肠 杆菌中表达具有该序列的肽，并通过标准的生物技术操作，在镍亲和柱上纯化。根据Raman S.等人，Nanomedicine :Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006 ;2 :95_102，进行重 新折叠。通过透射电子显微术(TEM)，分析重新折叠的SAPN的纳米颗粒形成。TEM照片(图 7A)显示出约30nm相同大小的纳米颗粒。来自流感的鸡特异性的M2e肽也可以以它的天然寡聚化状态和构象显示，作为 tetrabrachion的四聚体卷曲螺旋上的四聚体，这已经在具有下面的序列(SEQ ID NO 38) 的动物疫苗SAPN设计中实现MGHHHHHHASLVPRGSLLTEVETPTRNGWECKCSDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELERRLEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 38)
在大肠杆菌中表达具有该序列(SEQ ID NO 38)的肽，并通过标准的生物技术操 作，在镍亲和柱上纯化。它含有，从N-末端开始His-标签，来自鸡特异性的流感株的M2e B-细胞表位，具有HTL表位的四聚体卷曲螺旋，连接物，和三聚体卷曲螺旋。根据Raman S.等人，Nanomedicine :Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006 ;2 :95_102,进行重 新折叠，缓冲液为20mM Tris-HCl pH 7. 5、150mM NaCl和5%甘油。通过动态光散射(DLS) 技术和透射电子显微术(TEM)，分析重新折叠的SAPN的纳米颗粒形成。DLS分析显示出平 均粒径为45nm的大小分布，多分散性指数为8. 9%。TEM照片(图7B)显示出约30nm相同 大小的纳米颗粒。实施例10 具有一系列重叠的预测的HTL表位的五聚体卷曲螺旋根据二级结构预测程序PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/-The PSIPRED Protein StructurePrediction Server)，预测该序列高概率地(大部分最高评分9)形成α-螺 旋(H)。由于卷曲螺旋的七肽重复的核心位置aa (a)和aa(d)大部分是色氨酸残基，预 测该序列会形成五聚体卷曲螺旋(Liu J等人，Proc Natl AcadSci USA 2004 ； 101 (46) 16156-61)。ERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWM(SEQ ID NO 39)ad ad ad ad a卷曲螺旋核心残基567899998899899999999999999999994 二级结构的评分HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH 二级结构的类型该五聚体卷曲螺旋序列含有部分重叠的HTL表位，具有序列FVAAWTLKV、 WKIffKSLffK和KSLWKAWRL，通过算法NetMHCII预测它们会分别结合不同的MHC II分子DRBl * 0101，DRBl * 0401， DRBl 女 0405,DRBl 女 0701,DRBl 女 0801,DRBl 女 0901,DRBl 女 1101,DRBl 女 1501，和 DRB5 * 0101，预测的结合亲和力(nM)分别是24、73、13、120、42、596、396、6 和 13。实施例11 具有镰状疟原虫HTL表位的三聚体卷曲螺旋(t811c-9-pf)下面是三聚体卷曲螺旋设计的一个实例，其包含来自镰状疟原虫的结合pan DR的 表位。该序列对应着17个C-末端氨基酸，2个半胱氨酸被丙氨酸替换，也称作来自环子孢 子蛋白 CS 的 CS. T3 肽(SEQ IDNO 40)。RLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 40)d ad ad ad ad ad ad 核心残基在细胞增殖试验中已经证实，该CS. T3肽具有pan DR活性，且对于DR1、DR2、DR4、 DR5、DRw6、DR7和DR9分子是刺激性的(美国专利5，114，713)。通过预测程序C0ILS，预测该肽的序列会形成卷曲螺旋。除了最后2个氨基酸以 外，序列中所有残基形成卷曲螺旋的概率超过99% (表26)。因此，预测整个序列会形成完 全折叠的卷曲螺旋。表26 =SEQ ID NO 40的卷曲螺旋倾向
77 该卷曲螺旋(SEQ ID NO 40)已经用于设计具有下述序列(SEQ IDNO 41)的 SAPN MGHHHHHHASWKffDGGLVPRGSffQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDWAFffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELARGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO 41)该序列(SEQ ID NO 41)含有his-标签、五聚体卷曲螺旋色氨酸拉链、连接物、三 聚体卷曲螺旋SEQ ID NO :40、和镰状疟原虫B-细胞表位，它是相同环子孢子蛋白CS的重 复序列的的四肽重复(NANP)。在大肠杆菌中表达具有该序列的肽，并通过标准的生物技术操作，在镍亲和柱上 纯化。根据Raman S.等人，Nanomedicine (同上)，进行重新折叠。通过动态光散射(DLS) 技术和透射电子显微术(TEM)，分析重新折叠的SAPN的纳米颗粒形成。在pH 6. 5的DLS分 析显示出粒径为44. 6nm的大小分布，多分散性指数为19.6%。TEM照片(图8)显示出约 30nm大小的纳米颗粒。实施例12 =HIV疫苗HTL、CTL、B-细胞共装配下面是HIV疫苗设计的一个实例。它们是保守的蛋白序列，含有预测会结合在表 10中列出的HLA分子的CTL表位。ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELARPLDEGFRKYTAFTIPSINNE(SEQ ID NO 42)ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSYFNYYLAALRRRLEELARKGPAKLLffKGEGAYFIHNFKRKGGIGG(SEQ ID NO 43)ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELARIIGRNLLTQIGCTLNFPISPIETVPV(SEQ ID NO 44)ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKlAKMEKASSYFNYYLAALRRRLEELARDFffEYQLGIPHPAGLKKKKSY(SEQ ID NO 45)ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELARLTEEAELELAENREILKDPVHGV(SEQ ID NO 46)ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELARLVSQGIRKVLFLDGIDK(SEQ ID NO:47)将表10的前7个CTL表位串构建在具有相同核心和相同N-末端B-细胞表位的 6个肽链的C-末端，从而共装配进单个SAPN。
核心含有与实施例11相同的三聚体，具有泛宿主性的镰状疟原虫HTL表位，其连 接含有PADRE HTL表位的Trp-拉链五聚体卷曲螺旋。B-细胞表位是GP41的膜近侧区，通过单克隆中和抗体2F5和4E10的结合，证实它 具有中和潜力。该表位在溶液中是α-螺旋状，通过部分地构建进五聚体卷曲螺旋，保持处 于α-螺旋构象。在该设计中，表面可接近的残基(即不是卷曲螺旋核心残基的残基)是 被抗体4Ε10结合的那些。实施例13 疟疾疫苗=HTL-CTL-B-细胞-核心、B-细胞、CTL共装配下面是6个肽链组成的疟疾疫苗SAPN的一个实例，所述肽链具有相同的核心和相 同的C-末端B-细胞表位和在N-末端的约18个CTL表位(每条肽链3个)，共装配进单个 SAPN。KPNDKSLYKPKDELDYEAKPIVQYDNFMNGSERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMGGRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO 48)ASKNKEKALIIAAGIAGGLALLRSLLMDCSGSIGSERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMG
GRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO:49)MNPNDPNRNVQQMPNDPNRNVQQKSLYDEHIGSERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMGGRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO:50)MlNAYLDKLRAlSKYEDEIFAHLGNYKYLYGSERFYAAffTLKYAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMGGRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO:51)ENDIEKKIAKMEKASKSLYDEHILLMDCSGSIGSERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMGGRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO:52)KSKDELDYEAIPSLALMLIMPLETQLAIGSERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMGGRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO 53)核心(标有下划线)是含有CTL表位MEKLKELEK和修饰的B-细胞表位 KLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELT(在Villard V.等人，PLoS ONE 2007,2(7) :e645 中的序列 27)的三聚体卷曲螺旋和在实施例10中证实具有优良的panDR结合性质的五聚体的组合。 在C-末端，所有6个肽链具有相同的B-细胞表位，它是来自镰状疟原虫的环子孢子蛋白 CS的重复序列的四肽重复(NANP)。在N-末端是约18个不同的镰状疟原虫CTL表位(美 国专利5，028，425，5，972，351，6，663，871)，每条链3个不同的表位。CTL-表位被优化的蛋 白酶体切割位点隔开(http://www.paproc2.de/paprocl/paprocLhtml ；Hadeler K. P.等 人，Math. Biosci. 2004，188 :63_79)。由于这6条肽链的核心是相同的，将这6条肽链共装 配进一个单独的SAPN，允许将约18个不同的CTL表位掺入一个单独的SAPN。实施例14 流感疫苗HTL-核心、B-细胞四聚体、CTL共装配下面是6个肽链组成的流感疫苗SAPN的一个实例，所述肽链具有相同的核心和相
81同的N-末端B-细胞表位M2e和在C-末端的约20个CTL表位(每条肽链3个或4个)， 共装配进单个SAPN。核心(标有下划线)是实施例7的三聚体和实施例9的具有优良的 panDR结合性质的四聚体的组合。四聚体N-末端B-细胞表位与在实施例9中相同。来自 Parida R.等人，Vaccine 2007，25 :7530_7539 保守的 CTL 表位(表 15)放置在 C-末端。 由于这6条肽链的核心是相同的，将这6条肽链共装配进一个单独的SAPN，允许将约20个 不同的CTL表位掺入一个单独的SAPN。SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDVSAAFRRLEELEARVIRHENRMVLQAYQKRMGVLKMPASRYLSRYLTDMTL(SEQ ID NO 54)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDVSAAFRRLEELEARVFMLMPKQKVMRMGDFHSLYLLAffKQVL(SEQ ID NO 55)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDVSAAFRRLEELEARVAPIEHIASMRRNYFTAEVIQMCTELKL(SEQ ID NO 56)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDYSAAFRRLEELEARYAAGAAYKGYYGTMYMELINPTLLFLKV(SEQ ID NO 57)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDVSAAFRRLEELEARVRLIDFLKDVMQIRGFVYFIMFSNKMARL(SEQ ID NO 58)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDYSAAFRRLEELEARYERNEQGQTLYAYMLERELLRHFQKDAKVRDQRGNVL(SEQ ID NO 59)实施例15 流感疫苗HTL_核心、B-细胞四聚体、切割肽共装配下面是3个肽链组成的流感疫苗SAPN的一个实例，所述肽链具有相同的核心和相 同的N-末端B-细胞表位M2e和在C-末端的9个B-细胞表位(每条肽链3个)，共装配进 单个SAPN0SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELAKFYAAffTLKYREYERELSffLSLDYSAAFLERKKRGLFGDIQSRGLFGDERQTRGIFG(SEQ ID NO 60)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELAKFYAAffTLKYREYERELSffLSLDVSAAFLERKTRGLFGDPKGRGLFGDQIESRGLFG(SEQ ID NO 61)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELAKFYAAffTLKYREYERELSffLSLDVSAAFLEKKGRGLFGDASYRGLFGDKREKRGLFG(SEQ ID NO 62)核心(标有下划线)是实施例8的三聚体和实施例9的具有优良的panDR结合性 质的四聚体的组合。四聚体N-末端B-细胞表位与在实施例9中相同。C-末端B-细胞表位来自表8，H1、H2、H3、H5共有1、H5共有2、H7共有1、H7共有2、H7共有3、H9在表位之 间带有负电荷，使B-细胞表位串带更少的正电荷。
权利要求
由多个式(I)构造块的聚集体组成的自装配肽纳米颗粒，所述式(I)构造块由包含肽寡聚化结构域D1、连接区段L和肽寡聚化结构域D2的连续链组成，D1 L D2 (I)，其中D1是其具有形成m个亚基D1的寡聚体(D1)m的倾向的肽，D2是具有形成n个亚基D2的寡聚体(D2)n的倾向的肽，m和n各自是2至10之间的数字，条件是，m不等于n，且m不是n的倍数，且n不是m的倍数，L是键或短连接区段，D1或D2中的任一个或D1和D2两者是在寡聚化结构域中掺入一个或更多个T 和/或B 细胞表位的卷曲螺旋，且其中D1、D2和L任选地被进一步取代。
2.根据权利要求1的肽纳米颗粒，其中所述卷曲螺旋寡聚化结构域由七肽和/或十一 肽重复组成。
3.根据权利要求1或2的肽纳米颗粒，其中D1肽链在它的N-末端和/或D2肽链在它 的C-末端被一个或更多个另外的T-和/或B-细胞表位、一个或更多个其它的功能性肽或 蛋白、或一个或更多个另外的半抗原或其它功能性分子取代。
4.式S1-D1-L-D2、D1-L-D2-S2或S1-D1-L-D2-S2的根据权利要求3的肽纳米颗粒，其 中S1和S2是肽取代物。
5.由相同构造块D1-L-D2组成的根据权利要求1-4中任一项的肽纳米颗粒，其中至少 一个相同的构造块在D1的N-末端和/或D2的C-末端携带一个或更多个不同的取代物。
6.根据权利要求1-5中任一项的肽纳米颗粒，其中寡聚化结构域D1和D2之一是色氨 酸拉链的五聚化结构域或其衍生物。
7.根据权利要求1-6中任一项的肽纳米颗粒，其中寡聚化结构域D1和D2之一是 tetrabrachion的四聚化结构域或其衍生物。
8.根据权利要求1-7中任一项的肽纳米颗粒，其中至少一个表位是CTL表位。
9.根据权利要求1-7中任一项的肽纳米颗粒，其中至少一个表位是HTL表位。
10.根据权利要求1-7中任一项的肽纳米颗粒，其中至少一个表位是B-细胞表位。
11.根据权利要求8-10中任一项的肽纳米颗粒，其中所述序列D1-L-D2包含一系列任 选重叠的T-和/或B-细胞表位。
12.—种组合物，其包含根据权利要求1-11中任一项的肽纳米颗粒。
13.权利要求12的组合物，其中至少一个B-或T-细胞表位选自(a)适合诱导针对细菌的免疫应答的抗原；(b)适合诱导针对病毒的免疫应答的抗原；(c)适合诱导针对寄生虫的免疫应答的抗原；(d)适合诱导针对癌细胞的免疫应答的抗原；(e)适合诱导针对变应原的免疫应答的抗原；(f)适合诱导针对成瘾的免疫应答的抗原；(g)适合诱导针对疾病和代谢性病症的免疫应答的抗原；(h)适合诱导畜牧动物的免疫应答的抗原；和(i)适合诱导宠物的免疫应答的抗原。
14.权利要求12的组合物，其中至少一个B-或T-细胞表位选自造成选自下述的疾病 的病原体的蛋白阿米巴病，炭疽，弯曲杆菌感染，水痘，霍乱，登革，白喉，脑炎，埃博拉，流感，日本脑炎，利什曼病，疟疾，麻疹，脑膜炎球菌疾病，腮腺炎，医院感染，百日咳，肺炎球菌 疾病，小儿麻痹症(脊髓灰质炎)，风疹，带状疱疹，血吸虫病，破伤风，蜱传脑炎，滴虫病，锥 虫病，结核病，伤寒，水痘，和黄热病。
15.权利要求12的组合物，其中至少一个B-或T-细胞表位选自下述的病原体的蛋白 弯曲杆菌属，巨细胞病毒，EB病毒，口蹄疫病毒，B型流感嗜血杆菌，幽门螺旋杆菌.乙型肝 炎病毒，丙型肝炎病毒，戊型肝炎病毒，单纯疱疹病毒，人免疫缺陷病毒，人乳头状瘤病毒， 脑膜炎萘瑟菌，绿脓假单胞菌，金黄色葡萄球菌.肺炎链球菌，呼吸道合胞病毒，轮状病毒， 蛔虫，钩虫，和西尼罗病毒。
16.权利要求12的组合物，其中至少一个B-或T-细胞表位选自流感蛋白血凝素和/ 或M2。
17.权利要求16的组合物，其中所述M2B-细胞表位是该蛋白M2e的胞外部分的四聚体 形式，其结合在四聚体卷曲螺旋寡聚化结构域D1的N-末端。
18.权利要求17的组合物，其中所述四聚体寡聚化结构域D1是tetrabrachion的四聚 体卷曲螺旋结构域或其衍生物。
19.权利要求12-18中任一项的组合物，其中至少一个T-细胞表位选自下述流感肽
20.权利要求12-19中任一项的组合物，其中至少一个B-细胞表位选自下述流感肽 和其片段，其至少包含从SEQ ID N0:211-226的第三个氨基酸开始的6个氨基酸的序列。
21.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位是8至48个残基的序列，其构成 镰状疟原虫环子孢子(CS)蛋白的B细胞表位，所述B细胞表位包含2至约12个氨基酸残 基序列Asn-Ala-Asn-Pro重复或其变换。
22.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位是8至48个残基的序列，其构成 间日疟原虫环子孢子(CS)蛋白的B细胞表位，所述B细胞表位包含1至约6个下述任意氨 基酸残基序列的重复
23.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位选自下述疟疾肽 或其在一个或更多个核心位置aa(a)和/或aa(d)处的修饰。
24.权利要求12的组合物，其中至少一个HTL表位选自下述疟疾肽
25.权利要求12的组合物，其中至少一个CTL表位选自下述疟疾肽SEQ ID NO KPNDKSLY112KPKDELDY113KPIVQYDNF114ASKNKEKALII115GIAGGLALL116MNPNDPNRNV117MINAYLDKL118ISKYEDEI119HLGNVKYLV120
26.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位是选自蛋白gp41、gpl20或gpl60 的HIV蛋白。
27.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位是选自gp41与中和抗体2F5和 /或4E10的结合部位的HIV肽。
28.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位是选自HIV的gpl20的V3-环的 HIV 肽。
29.权利要求12的组合物，其中至少一个T-细胞表位选自下述HIV肽
30.权利要求12的组合物，其中至少一个T-细胞表位选自下述HIV肽
31.权利要求12的组合物，其中所述B-细胞表位是适合诱导针对选自下述成瘾的免疫 应答的抗原阿片制剂，大麻，苯异丙胺，可卡因，巴比妥酸盐，格鲁米特，甲乙哌酮，水合氯 醛，甲喹酮，苯并二氮卓，LSD，尼古丁，抗胆碱能药，抗精神病药，色胺，其它精神症状药物， 镇静药，苯环利定，赛洛西宾，挥发性的亚硝酸盐，和诱导躯体依赖性和/或精神依赖性的 其它药物。
32.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位是尼古丁。
33.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位是可卡因。
34.权利要求12的组合物，其中至少一个B-或T-细胞表位选自适合诱导针对选自下 述癌症类型的癌细胞的免疫应答的抗原脑癌，乳腺癌，子宫颈癌，结肠直肠癌，食管癌，成 胶质细胞瘤，白血病(急性骨髓性和慢性髓细胞样)，肝癌，肺癌(非小细胞肺癌，小细胞肺 癌)，淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，黑素瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，和肾癌。
35.权利要求12的组合物，其包含选自下述的序列
36.权利要求12的组合物，其中至少一个B-或T-细胞表位选自下述抗原A0 —片段(A0)血管紧张素I/II(ATII//I)胆固醇酯转移蛋白(CETP)
37.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位是A0-肽或其片段，其至少包含 从N-末端氨基酸开始6个氨基酸的序列。
38.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位是血管紧张素I或血管紧张素II。
39.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位是grehlin。
40.权利要求12的组合物，其中至少一个B-细胞表位是TNFa或其片段，其至少包含 从TNF a的第四个N-末端氨基酸开始20个氨基酸的序列。
41.给人或非人动物免疫接种的方法，其包含，给需要这种免疫接种的受试者施用有效 量的根据权利要求1-11中任一项的肽纳米颗粒或根据权利要求12-39中任一项的组合物。
42.式(I)的单体构造块，其由包含肽寡聚化结构域D1、连接区段L和肽寡聚化结构域 D2的连续链组成，D1-L-D2(I)，其中D1是其具有形成m个亚基D1的寡聚体(Dl)m的倾向的肽，D2是具有形成n个亚 基D2的寡聚体(D2)n的倾向的肽，m和n各自是2至10之间的数字，条件是，m不等于n， 且m不是n的倍数，且n不是m的倍数，L是键或短连接区段，D1或D2中的任一个或D1和 D2两者是在寡聚化结构域中掺入一个或更多个T-和/或B-细胞表位的卷曲螺旋，且其中Dl、D2和L任选地被进一步取代。
全文摘要
描述了掺入T-和/或B-细胞表位的自装配肽纳米颗粒(SAPN)。本发明的纳米颗粒由连续肽链的聚集体组成，所述连续肽链包含通过连接区段相连的两个寡聚化结构域，其中一个或两个寡聚化结构域在它们的肽序列中掺入T-和/或B-细胞表位。这些纳米颗粒可用作疫苗的和佐剂。
文档编号C07K14/00GK101932594SQ200980103767
公开日2010年12月29日 申请日期2009年1月29日 优先权日2008年2月1日
发明者P·布克哈德 申请人:阿尔法-O肽股份公司