专利名称：糖蛋白质的制造方法以及筛选方法
技术领域：
本发明为涉及制造氨基酸序列、糖链结构以及高阶结构为一致的糖蛋白质的方 法。
背景技术：
近年来，进行糖蛋白质作为各种医药使用的研究。糖蛋白质的糖链部分具有附加 对蛋白酶的耐性而使血中的代谢延缓的功能，以及作为掌管细胞内对小器官的输送的信号 的功能等。因此，通过加成适当的糖链，可控制糖蛋白质的血中半衰期以及细胞内的输送。作为糖链影响糖蛋白质的生理活性的代表例，可列举促红细胞生成素 (erythropoietin，亦即ΕΡ0)。此糖蛋白质为通过作用于红血球系前驱细胞，并促进其增殖、 分化，而具有维持末梢血中红血球数目的功能的血球分化荷尔蒙。对EPO的糖链结构与生 理活性的相关关系进行研究的结果可知，虽然于活体外(in vitro)即使不结合糖链也具有 生理活性，但于活体内(in vivo)若无糖链则快速地由肾脏排出，无法获得充分的生理活 性。再者，糖蛋白质在糖链为不完全时、结合不同糖链时，会被辨识为血液中的巨噬细 胞等，而由血中排出。因此，使用糖蛋白质作为医药品时，期望于各蛋白质的相同位置均加成一致结构 的糖链。以往，糖蛋白质的制造方法，虽广泛使用将糖予以酵素加成于蛋白质的方法，但 是于此方法中，无法加成一致的糖链，再者，加成糖链后也難以一致地实施修饰或整饰 (trimming)。再者，一般而言，蛋白质制剂虽是使用力价来评估，但即使是具有相同力价的制 剂，也有时会包含糖链结构为杂乱不均者，造成血中半衰期为杂乱不均的，于质量管理方面 成为问题。本发明人们截至目前为止已开发以经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸与糖链天 门冬酰胺(asparagine)作为材料，而可较大量地制造具有一致的氨基酸序列与糖链的糖 蛋白质的方法(例如参照专利文献1)。进一步地，已开发可维持充分的血中浓度的氨基化 复合型糖链衍生物及糖蛋白质(参照专利文献幻。任一种的糖蛋白质皆期待作为医药品的 有用性。因此，为了作为医药品使用，而需要制造生理活性不会为杂乱不均的糖蛋白质，关 于糖蛋白质的功能，不仅与氨基酸序列及糖链结构为有关，相信与蛋白质部分的高阶结构 也有密切关联。蛋白质的高阶结构为通过氨基酸残基间的氢键、离子键、疏水性相互作用、半胱氨 酸残基间的S-S键等而使其安定化，多数的蛋白质具有各别固有的高阶结构。然而，S-S键 以外的键为比较弱的键，通过比较温和的加热或加压等破坏高阶结构，使其生理活性降低、 消失。此称为蛋白质的变性。再者，特别是在氨基酸链为长时，由于产生多个赋予能量极小点的结构，故有产生异常的高阶结构(错误折叠(misfolding))的情况。于此情况中，也已 有蛋白质的活性会变化或消失的报告。由于這些事实，一般而言，为了使蛋白质发挥功能而必须有正确的高阶结构，并认 为若使蛋白质折叠，則会分成具有生理活性的正确折叠，以及不具有生理活性的错误折叠。关于蛋白质的高阶结构与生理活性的关系虽然已有种种研究，但在人工合成的糖 蛋白质中，截至目前为止未有关于糖链对于折叠与生理活性可赋予何种影响的报告。本发明人们使用专利文献1的方法合成糖蛋白质片段，通过自然型化学连接法 (Native Chemical Ligation，亦即NCL法)与其它的肽片段连结，合成单核细胞驱化性蛋 白质-3 (monocyte chemotactic protein-3)。使所合成的单核细胞驱化性蛋白质_3折叠 后，使用胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)处理而确认双硫键的位置时，可知虽然约90%的糖 蛋白质为双硫键形成在正确位置，但约10%則是双硫键形成在与通常不同的位置(非专利 文献1)。然而，于同文献中，不同的2种以上的糖蛋白质在折叠的状态下未分离。胰凝乳蛋 白酶处理时，若也考虑双硫键再形成的可能性，則也无法否定不是发生2种以上的折叠，而 只是胰凝乳蛋白酶处理的结果分成2种以上的可能性。因此，当然，也未探讨双硫键形成于 正确位置的糖蛋白质与形成于不同于通常位置的糖蛋白质的生理活性的差异。再者，在较常被研究功能与结构的糖蛋白质中，有属于包含于蛋白中的一种蛋白 质的卵类粘蛋白(ovomucoid)。卵类粘蛋白为分子量约观，000的蛋白质，分子内具有3个 功能域(domain)，各功能域分别对于不同的蛋白酶具有抑制活性。特别是第3功能域，由于 单独也会显示抑制活性，所以被详细地研究。截至目前为止，已有关于100种以上的来自鸟 的第3功能域的结构的报告，通过X射线结晶解析也了解立体结构。关于化学上所合成的卵类粘蛋白第3功能域的立体结构，例如已有通过NCL法，合 成其肽骨架有改变的卵类粘蛋白第3功能域，并进行X射线结晶解析的报告(参照非专利 文献2)。再者，已有卵类粘蛋白第3功能域通过逐步合成(st印wise synthesis)法与NCL 法合成，使其折叠，通过热安定性的解析，得到强烈暗示会正确折叠的结果的报告(参照非 专利文献3)。
背景技术：
文献专利文献专利文献1 国际公开第2004/005330号小册子专利文献2 国际公开第2004/011036号小册子非专利文献非专利文献 1 Yamamoto et al. ,Journal of American Chemical Society, 2008, 130,501-510非专禾Ij 文献 2 :Batemen et al. , Journal of Molecular Biology (2001) 305, 839-849非专利文献 3 :Lu et al. , Journal of American Chemical Society, 1996,118, 8518-8523
发明内容
《发明欲解决的技术问题》但是，上述背景技术中，所合成的糖蛋白质未加成糖链，于糖蛋白质中，糖链对于 折叠及生理活性造成的影响并不明确。因此，本发明是以提供制造除了血中半衰期等基于糖链的功能外，生理活性也为 一致的糖蛋白质，也就是氨基酸序列、糖链结构以及高阶结构均为一致的糖蛋白质的方法 为目的。再者，本发明是以提供由生理活性强度不同的多种糖蛋白质中选择具有既定活性 的糖蛋白质的筛选方法，以及提供具有所期望活性的糖蛋白质混合物为目的。《解决技术问题的技术方案》本发明人们发现，在合成氨基酸序列与糖链结构为一致的卵类粘蛋白的的3功能 域且使其折叠時，会再现性佳地获得以一定比率包含多种高阶结构的混合物。然后，将其分 离且测定生理活性时，与以往的理解不同，确认到具有同一种类的生理活性被认为是较高 活性的程度的高阶结构为存在多种；虽然为较高活性，但依高阶结构而有活性差异；高阶 结构不同的糖蛋白质可通过柱层析而各别分离、精制。再者，发现具有既定活性的糖蛋白质以外者，使其展开后，若使其再度折叠，則可 变换成以上述一定比率获得的高阶结构，因此，通过重复进行展开/折叠步骤，可以最大限 度回收具有具既定活性的高阶结构的糖蛋白质。也就是说，本发明提供一种方法，所述的方法为制造氨基酸序列、糖链结构及高阶结构为一致的糖蛋白 质的方法，包含以下步骤(a)至(c)(a)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠的步骤；(b)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分的步骤；以及(c)将具有既定活性的区分回收的步骤。上述方法中，优选为在前述步骤(C)后，复包含(d)使于前述步骤(C)未回收的区分中所包含的糖蛋白质展开的步骤；(e)使前述所展开的糖蛋白质再度折叠的步骤；(f)使前述再度折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分，将具有前述既定活性的 区分回收的步骤；以及(g)根据需要而重复进行步骤(d)至⑴的步骤。本发明再提供一种方法，所述的方法为筛选具有既定的生理活性的糖蛋白质的方法，包含以下 步骤⑴至(iii)(i)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠的步骤；(ii)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分的步骤；以及(iii)测定各区分的活性，判定是否具有既定的活性的步骤。本发明再提供一种方法，所述的方法为获得具有所期望的生理活性的糖蛋白质混合物的方法，包含以下步骤㈧至⑶(A)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠的步骤；(B)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分的步骤；(C)测定各区分的活性的步骤；以及(D)求出用以获得所期望活性的各区分的混合比率，根据所述比率使各区分混合 的步骤。本发明的糖蛋白质的制造方法、糖蛋白质的筛选方法或获得具有所期望的生理活 性的糖蛋白质混合物的方法中，优选为氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质的至少一部分是通过包含为以下步骤(1) 至(6)的方法所制造，(1)使具有羟基的树脂的羟基，与经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸的羧基或经 脂溶性保护基保护氨基的糖链加成氨基酸的羧基，进行酯化反应的步骤；(2)使前述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基的步骤；(3)使前述游离氨基，与经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸的羧基或经脂溶性保 护基保护氨基的糖链加成氨基酸的羧基，进行酰胺化反应的步骤；(4)前述步骤(3)后，使前述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基的步骤；(5)将前述步骤(3)及⑷的步骤重复进行1次以上的步骤；以及(6)将前述步骤(1)所形成的酯键以酸切断的步骤。再者，在上述氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质的制造方法中，优选为在前述氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质的一部分是通过前述步骤(1)至(6) 制造时，所述糖蛋白质复包含以下步骤(7)(7)将于前述步骤(6)所得的糖蛋白质的一部分，与其它肽或糖肽，通过连接法而 连结的步骤。《发明的效果》根据本发明的糖蛋白质的制造方法，由于会获得除了氨基酸序列、糖链结构以外， 高阶结构也为一致的糖蛋白质，故可制造不仅血中半衰期及细胞内的输送不会发生杂乱不 均，且一致地具有既定的生理活性的糖蛋白质。再者，根据本发明的糖蛋白质的筛选方法，可从因高阶结构不同而于生理活性产 生杂乱不均的糖蛋白质群中，选择一致地具有既定的生理活性的糖蛋白质。所述糖蛋白质 由于糖链结构为一致的，故血中半衰期及细胞内的输送等基于糖链的功能也为一致的。再者，根据本发明，可控制使糖蛋白质的混合物具有所期望活性。根据本发明的這些效果，特别有利于糖蛋白质作为医药品使用的情况。
图1是表明白鹇(silver pheasant)的卵类粘蛋白第3功能域(0MSVP3)与其化 学合成所使用的片段(fragment) 1至3的氨基酸序列。图2是表明0MSVP3的化学合成所使用的片段1 (硫酯体)。图3是表明具有糖链的0MSVP3的化学合成所使用的片段2 (硫酯体)。图4是表明0MSVP3的化学合成所使用的片段3。
图5是表明片段1合成时于各阶段中的波长220nm的色谱图(chromatogram)。图6是表明片段2合成时于各阶段中的波长220nm的色谱图。图7是表明片段3合成时于各阶段中的波长220nm的色谱图。图8是表明片段2及片段3通过NCL法连结的各阶段中的波长220nm的色谱图。图9是表明片段2及3，与片段1通过NCL法连结的各阶段中的波长220nm的色谱 图。图10是表明使具有糖链的0MSVP3折叠后，通过HPLC分离时的波长220nm的色谱图。图11是表明图10的区分B的匪R谱图(匪R spectrum)。图12是表明图10的区分B的⑶谱图。图13是表明图10的各区分对于胰凝乳蛋白酶的抑制活性的测定结果。图14是表明不具有糖链的0MSVP3的化学合成所使用的片段2’ (硫酯体)。图15是表明片段2’合成时于各阶段中的波长220nm的色谱图。图16是表明片段2’及片段3通过NCL法连结的各阶段中的波长220nm的色谱图。图17是表明片段2’及3，与片段1通过NCL法连结的各阶段中的波长220nm的色 谱图。图18是表明使不具有糖链的0MSVP3折叠后，通过HPLC分离时的波长220nm的色谱图。图19是表明图18的区分F的NMR谱图。图20是表明图18的区分F的⑶谱图。图21是表明图18的各区分对于胰凝乳蛋白酶的抑制活性的测定结果。图22是表明区分F的标准曲线(calibration curve)。图23是表明区分A至D对于胰凝乳蛋白酶的抑制率。图M是表明区分A至D的IC5tl值。图25是表明区分E至H对于胰凝乳蛋白酶的抑制率。图沈是表明区分E至H的IC5tl值。图27是表明通过区分B的温度变化所得到的⑶谱图。图28是表明通过区分F的温度变化所得到的⑶谱图。图四是表明对于区分B在嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)消化中的波长220nm的 色谱图。图30是表明对于区分B在嗜热菌蛋白酶消化后的肽片段的质量分析结果。图31是表明对于区分F在嗜热菌蛋白酶消化中的波长220nm的色谱图。图32是表明对于区分F在嗜热菌蛋白酶消化后的肽片段的质量分析结果。图33是表明对于区分B通过嗜热菌蛋白酶消化所得到的双硫键的位置决定结果。图34是表明对于区分F通过嗜热菌蛋白酶消化所得到的双硫键的位置决定结果。图35是表明基质肽的标准曲线。图36是表明基质月太的Michaelis-Menten plot图。图37是表明基质肽的每单位时间的反应速度。
具体实施例方式以下，说明本发明的较佳实例。本说明书中，「蛋白质」只要为多个氨基酸通过酰胺键结合者即可，并无特别限定， 包含众所周知的蛋白质以及新颖的蛋白质与蛋白质改质体。优选实施方式中，根据本发明 的制造方法所制得的糖蛋白质中的蛋白质部分，与天然型相同是通过酰胺键(肽键)使多 个氨基酸结合。本说明书中的蛋白质是通过使其折叠而为具有可取得既定的高阶结构的长度者。本说明书中，「蛋白质改质体」为使蛋白质进行天然或人工改质的化合物，关于 這些方式的改质，例如可列举蛋白质的1个或多个氨基酸残基的烷基化、酰基化(例如乙 酰基化)、酰胺化(例如蛋白质的C末端的酰胺化)、羧基化、酯形成、双硫键形成、糖基化 (glycosylation)、脂质化(Iipidation)、磷酸化、羟基化(hydroxylation)、标识成分的结
口寸ο又，本说明书中，用语「肽」在原则上虽与蛋白质以相同意义使用，但也有使用于指 称蛋白质的一部分或未采取高阶结构的比较短的氨基酸链的情况。本说明书中，「氨基酸」是以其最广泛的意义使用，不仅包含天然的氨基酸，例如 丝氨酸(Ser)、天门冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Ler)、异亮氨酸(lie)、丙氨酸 (Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天门冬氨酸 (Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯 基丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)，也包含如氨基酸突变体及衍生物的非天然氨 基酸。此项技术领域者考虑此广泛的定义，可理解本说明书中的氨基酸可列举例如L-氨 基酸；D-氨基酸；氨基酸突变体及衍生物等经化学修式的氨基酸；正亮氨酸(norleucine)、 β-丙氨酸、鸟氨酸(ornithine)等于活体内不会成为蛋白质构成材料的氨基酸；以及熟习 此项技术者众所周知的具有氨基酸特性的化学合成的化合物等。非天然氨基酸的例子可列 举α -甲基氨基酸(α -甲基丙氨酸等)、D-氨基酸、组氨酸类氨基酸(2-氨基-组氨酸、 β-羟基-组氨酸、高碳组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸以及α-甲基-组 氨酸等)、侧链具有额外的亚甲基(methylene)的氨基酸(「高碳」氨基酸)及侧链中的羧 酸官能基氨基酸经磺酸基取代的氨基酸(半胱磺酸等)。优选实施方式中，利用本发明的制造方法所制得的糖蛋白质的蛋白质部分，是全 部由在活体内作为蛋白质或糖蛋白质的槽成氨基酸而存在的氨基酸所構成。本说明书中，「糖蛋白质」只要为在前述蛋白质加成至少1个糖链的化合物即可， 并无特别限定，包含众所周知的糖蛋白质以及新颖的糖蛋白质。再者，本说明书中，用语「糖 肽」在原则上虽与糖蛋白质以相同意义使用，但也有使用于指称糖蛋白质的一部分或在上 述肽結合糖链者的情况。优选实施方式中，利用本发明的制造方法所制得的糖蛋白质，为具有N结合型糖 链或0结合型糖链的糖蛋白质，例如可列举促红细胞生成素、白细胞介素(interleukin)、 干扰素-β、抗体、单核细胞驱化性因子蛋白质-3 (monocyte chemotactic protein-3，亦即 MCP-3)、卵类粘蛋白(ovomucoid)蛋白质等肽的一部分或全部。糖蛋白质中，糖链与蛋白值中的氨基酸残基，可为直接结合，也可为通过连结子 (linker)而结合。糖链与氨基酸的结合部位并无特别限制，优选为在糖链的还原末端结合氨基酸。糖链结合的氨基酸的种类并无特别限定，可与天然氨基酸、非天然氨基酸的任一 种结合。从糖蛋白质与存在于活体内的糖蛋白质具有相同或类似结构的观点来看，糖链优 选为以N结合型糖链的方式与Asn结合，或以0结合型糖链的方式与Ser或Thr结合。特 别是N结合型的情况，根据本发明的制造方法所制得的糖蛋白质，优选为具有使糖链与Asn 结合，在所述Asn的C末端侧以酰胺键(肽键)結合脯氨酸以外的氨基酸(X)，且在所述X 的C末端侧以酰胺键(肽键)結合11^或％1·的结构(-糖Asn-X-Thr/Ser-)的糖蛋白质。 在糖链与氨基酸为通过连结子结合时，从与联结子的结合容易性的观点来看，糖链结合的 氨基酸优选为天门冬氨酸或谷氨酸等分子内具有2个以上的羧基的氨基酸；赖氨酸、精氨 酸、组氨酸、色氨酸等分子内具有2个以上氨基的氨基酸；丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等分子内 具有羟基的氨基酸；半胱胺酸等分子内具有硫醇基的氨基酸；或天门冬酰胺、谷氨酰胺等 分子内具有酰胺基的氨基酸。特别是从反应性的观点来看，优选为天门冬氨酸、谷氨酸、赖 氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱胺酸、天门冬酰胺或谷氨酰胺。糖蛋白质中，在糖链与氨基酸为通过连结子结合时，作为连结子，可广泛使用所述 技术领域中所使用者，例如可列举-NH-(CO)-(CH2)a-CH2-(式中，a为整数，只要是不阻碍目的的连结子功能者，即无限定，优选为0至4的 整数)；CVici聚亚甲基；-CH2-R3-(此处，R3为从选自由烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔 基、芳基、经取代的芳基、碳环基、经取代的碳环基、杂环基及经取代的杂环基所成群中的基 使1个氢原子脱离所产生的基)；等。本说明书中，「糖链」除了包含单位糖(单糖及/或其衍生物)为2个以上相连 的化合物以外，也包含由1个单位糖((单糖及/或其衍生物)所構成的化合物。這些糖 链，可列举例如活体内所含有的单糖类及多糖类(polysaccharide)(葡萄糖、半乳糖、甘 露糖、岩藻糖、木糖、N-乙酰基葡糖胺(N-acetylglucosamine)、N-乙酰基半乳糖胺、唾 液酸以及這些的复合物及衍生物)，此外也可列举从经分解的多糖、糖蛋白质、蛋白聚糖 (proteoglycan)、葡糖胺聚醣(glycosaminoglycan)、糖脂质等复合活体分子所分解或衍生 的糖链等广范围者，但不以這些为限定。单位糖为2个以上相连时，各单位糖彼此间是通过 糖苷键(glycoside bond)的脱水缩合而结合。糖链可为直链型或分支链型。再者，本说明书中，「糖链」也包含糖链的衍生物，作为糖链的衍生物，例如可列举 构成糖链的糖为具有羧基的糖(例如，C-I位被氧化而成为羧酸的醛糖酸(aldonic acid) (例如，D-葡萄糖被氧化的D-葡萄糖酸)、末端的C原子成为羧酸的糖羰酸(uronic acid) (D-葡萄糖被氧化的D-葡萄糖醛酸))、具有氨基或氨基的衍生物(例如经乙酰基化的氨 基)的糖(例如，N-乙酰基-D-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺等)、具有氨基及羧基两 者的糖(例如，N-乙酰基神经氨酸(唾液酸)、N-乙酰基胞壁酸等)、去氧化糖(例如，2-脱 氧-D-核糖)、含硫酸基的硫酸化糖、含磷酸基的磷酸化糖等糖链，但不以這些为限定。本发明的糖链，优选为于活体内作为复合糖质(糖蛋白质(或糖肽)、蛋白聚糖、糖脂质等)而存在的糖链，优选为于活体内作为糖蛋白质(或糖肽)而结合于蛋白质(或肽) 的糖链之N-结合型糖链、0-结合型糖链等。0-结合型糖链结合的糖蛋白质中，是在肽的 Ser或Thr以0-糖苷键结合N-乙烯基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)、 木糖、海藻糖等，并于其再加成糖链。N结合型糖链，例如，可列举高甘露糖(high mantose) 型、复合(complex)型、混成(hybrid)型，优选为复合型。本发明中，优选的糖链，例如为下述式⑷表示的糖链。
权利要求
1.一种糖蛋白质的制造方法，所述的方法为制造氨基酸序列、糖链结构及高阶结构为 一致的糖蛋白质的方法，其特征在于，包含以下步骤(a)至(C)(a)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠(folding)的步骤；(b)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分(fractionating)的步骤；以及(c)将具有既定活性的区分(fraction)回收的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(c)后，复包含(d)使于前述 步骤(c)未回收的区分中所包含的糖蛋白质展开(unfolding)的步骤；(e)使前述所展开的糖蛋白质再度折叠的步骤；(f)使前述再度折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分，将具有前述既定活性的区分 回收的步骤；以及(g)根据需要而重复进行步骤(d)至(f)的步骤。
3.一种糖蛋白质的筛选方法，所述的方法为筛选具有既定生理活性的糖蛋白质的方 法，其特征在于，包含以下步骤(i)至(iii)(i)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠的步骤；( )使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分的步骤；以及(iii)测定各区分的活性，判定是否具有既定的活性的步骤。
4.一种获得糖蛋白质混合物的方法，所述的方法为获得具有所期望的生理活性的糖蛋 白质混合物的方法，其特征在于，包含以下步骤㈧至⑶(A)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠的步骤；(B)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分的步骤；(C)测定各区分的活性的步骤；以及(D)求出用以获得所期望活性的各区分的混合比率，根据所述比率使各区分混合的步马聚ο
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列及糖链为一 致的糖蛋白质的至少一部分是通过包含以下步骤(1)至(6)的方法所制造，(1)使具有羟基的树脂的羟基，与经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸的羧基或经脂溶 性保护基保护氨基的糖链加成氨基酸的羧基，进行酯化反应的步骤；(2)使前述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基的步骤；(3)使前述游离氨基，与经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸的羧基或经脂溶性保护基 保护氨基的糖链加成氨基酸的羧基，进行酰胺化反应的步骤；(4)在前述步骤(3)后，使前述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基的步骤；(5)将前述步骤C3)及的步骤重复进行1次以上的步骤；以及(6)将前述步骤(1)所形成的酯键以酸切断的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在前述氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋 白质的一部分是通过前述步骤(1)至(6)制造时，所述糖蛋白质是通过复包含以下步骤(7) 的方法所制造(7)将于前述步骤(6)所得的糖蛋白质的一部分，与其它肽或糖肽，通过连接法 (ligation)而连结的步骤。
全文摘要
本发明的目的为提供制造除了血中半衰期等基于糖链的功能外，生理活性也为一致的糖蛋白质(glycoprotein)，亦即，氨基酸序列、糖链结构以及高阶结构(higher-order structure)均为一致的糖蛋白质的方法。本发明提供制造氨基酸序列、糖链结构以及高阶结构为一致的糖蛋白质的方法，包含以下步骤(a)至(c)(a)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠(folding)的步骤；(b)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分(fractionating)的步骤；以及(c)将具有既定活性的区分(fraction)回收的步骤。
文档编号C07K14/00GK102124024SQ200980132399
公开日2011年7月13日 申请日期2009年8月18日 优先权日2008年8月19日
发明者梶原康宏, 深江一博 申请人:大塚化学株式会社