专利名称：基于狂犬病毒的重组免疫避孕组合物及其使用方法
技术领域：
本公开涉及作为免疫避孕组合物用于控制野生和驯养动物的种群增长并保护动物抵抗狂犬病毒感染的重组狂犬病毒。
背景技术：
狂犬病是对公共卫生的重要威胁，每年引起50，000至60，000人死亡(世界卫生组织(World Health Organization)，2003年4月)。人类被狂犬病毒感染主要是通过患狂犬病的驯养和野生动物的叮咬。在发展中国家，约94%的人类狂犬病死亡是由狗造成的。 狗狂犬病仍然在非洲、亚洲和南美洲的大多数国家的动物中流行，并且在这些国家中，大多数人类的患病死亡由狗造成。因此，在驯养和野生动物中控制狂犬病毒感染，不仅将在这些动物中降低死亡率，而且将降低人类暴露的风险。狂犬病毒由被感染动物的叮咬或抓伤引起的破裂皮肤传播。暴露于狂犬病毒导致其侵入外周无髓鞘的神经末梢，然后通过逆向轴突运输传播，专门在神经元中进行复制， 并最终达到中枢神经系统(CNQ。CNS的感染引起细胞机能障碍和死亡(Rupprecht和 Dietzschold, Lab Invest. 57 603,1987) 因为狂犬病毒直接在细胞间传播，因此它大多避开免疫识别(Clark和I^rabhakar，“狂犬病”(Rabies)，在Olson等主编的《病毒性疾病的比较病理学》中(Comparative Pathology of Viral Disease) 2 :165，Boca Raton, FL, CRC Press,1985)。使用旧式的捕捉、监禁和安乐死方法控制狗的种群是不人道的，并且不被公众接受。犬类狂犬病防控和自由放养狗的适合的种群管理，对于最终消灭疾病来说是至关重要的。已经提出了各种手段来打断犬类的繁殖周期，包括动物的手术切除卵巢/阉割、化学绝育和免疫避孕。例如，作为用于狗的免疫避孕肽，促性腺激素释放激素(&iRH)已被当作一种手段。但是，到目前为止的研究显示，&iRH需要被合成并与载体蛋白(或佐剂)结合才具有免疫原性。必需的生产放大在满足现代疫苗供应的法规和经济要求方面，可能有问题。 因此，构建一种在动物中单次给药后能够诱导适合的针对狂犬病毒和免疫避孕靶两者的双重免疫应答的疫苗，将是理想的。此外，在过去30年间，免疫避孕研究还未能产生一种商业化产品。技术限制是主要因素之一。因此，对于工程化改造的、具有表达适合的免疫避孕基因的能力的新的狂犬病毒疫苗，存在长期以来没有被感觉到的需要。这种类型的疫苗将是用于野生和驯养动物包括狗的狂犬病预防和种群控制两者的理想候选物。发明概述本文公开了包含编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列的重组狂犬病毒。重组狂犬病毒使用反向遗传学回收，在培养物中高效复制，并引发高滴度的狂犬病毒中和抗体，引发免疫避孕蛋白特异性抗体，并在接种的动物中提供针对狂犬病毒激惹的保护作用。本文提供了重组狂犬病毒，其中重组狂犬病毒的基因组包含编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列。在某些实施方案中，免疫避孕蛋白是促性腺激素释放激素(&1RH)或透明带 3(ZP;3)，例如狗ZP3。在某些实施方案中，重组狂犬病毒的基因组包含编码ZP3的核酸序列和编码&iRH的核酸序列。还提供了包含本文描述的一种或多种重组狂犬病毒的免疫原性组合物。还提供了包含第一种重组狂犬病毒和第二种重组狂犬病毒的免疫原性组合物，其中第一种重组狂犬病毒的基因组包含&1RH核酸序列，并且第二种重组狂犬病毒的基因组包含ZP3核酸序列。还提供了通过向动物给药治疗有效量的包含本文公开的一种或多种重组狂犬病毒的免疫原性组合物，来免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并抑制动物生育力的方法。从下面几个实施方案的详细描述并同时参考附图，上述以及其他的特点和优点将变得更加明显。附图简述
图1是四种重组ERAZP3病毒的示意图。G*表示在糖蛋白(G)的333位氨基酸处的突变。ZP-表示狗的透明带基因。图2A是狂犬病毒糖蛋白的示意图。箭头指示了一个或两个&1RH拷贝插入的位置。 通过反向遗传学成功地回收到在每个这些位置带有插入的&iRH的重组病毒(Ecto =胞外结构域；SP =信号肽；TM =跨膜；nb、II、IIa、WB+和III是指抗原性位点)。图2B是重组狂犬病毒ERA-3-GnRH的示意图。图3A是列出了包含狗ZP3 (DZP3) ,GnRH或两者的示例性重组狂犬病毒的表。病毒描述指示了 ZP3和/或&iRH在病毒基因组中插入的位置(G3 =具有G333突变的糖蛋白)。 图:3B是显示了未接种的小鼠(对照)或用ERA-N-GnRH (5号病毒)、ERA-3-GnRH(7号病毒) 或ERA-G3-2&iRH(8号病毒)接种的小鼠的存活率的图。每组小鼠随后用致死剂量的狂犬
病毒激惹。图4是蛋白凝胶的照片，显示了与匙孔血蓝蛋白(KLH)结合的&iRH或2&1RH肽。 蛋白在4-12% SDS-PAGE凝胶上分离。GnRH-KLH和2GnRH_KLH分别显示在第2和4道中。 第1和6道含有分子量标志物。第3和5道显示了 KLH标准品。图5A是亲代ERA和重排的ERAg3p基因组的示意图。为了产生ERAg3p，将ERA基因组中的G基因重新定位在P基因前面，并在333位氨基酸残基处从AGA(命名为G)突变成GAG(命名为(T)。图5B是一步生长曲线，显示了重排的ERAg3p病毒的生长特性。回收的ERAg3p病毒以及亲代ERA病毒进行了生长。图5C是比较ERA与ERAg3p的毒力的线图。 在脑内注射后，ERAg3p不引起任何3周龄小鼠的死亡。图6是显示了 ERAg3p狂犬病毒G基因中GnRH或2GnRH编码序列的插入位点的示意图。SP =信号肽；TM =跨膜；CT =胞质尾巴；N =糖蛋白的氨基末端，以及C =糖蛋白的
羧基末端。图 7A 是显示为了产生 ERA-N-GnRH、ERA-N_2GnRH、ERA-IIa-GnRH 和 ERA-C-GnRH， GnRH在ERAg3p基因组中的插入位点的示意图。图7B是线图，显示了带有GnRH的ERAg3p 病毒的回收和生长特性。从12个构建物中的4个中成功回收了重组病毒。回收到的病毒含有插入到紧靠糖蛋白的信号序列、IIa抗原性位点或胞外结构域与跨膜结构域之间的连接处后的氨基末端处的&1RH。图8A是电泳凝胶的照片，显示了纯化的ERA-N-2GnRH (第1道)、ERA-N-GnRH (第 2道)和ERA-IIa-GnRH(第3道)。纯化的病毒在4-12% SDS-PAGE凝胶上分离。第4和 5道含有来自狂犬病毒ERA的纯化的糖蛋白和纯化的核蛋白作为对照。图8B是纯化的 ERA-N-2GnRH(第2道)和ERA-N-GnRH (第3道)的Northern印迹照片。第1和4道含有 RNA分子量标志物。图9是线图，显示了带有&iRH的ERAg3p病毒在小鼠模型中的安全性和效力。肌肉内注射ERA-N-2GnRH、ERA-N-GnRH或ERA-IIa-GnRH后，在小鼠中没有观察到明显的副作用。在接种后三周，用约2. 5-10. OMICLD50狗/丛林狼(coyote)街狂犬病毒的致死剂量激惹的所有小鼠都存活。对照小鼠(注射空白对照剂)在激惹后8至10天之间死亡。在2 个月时结束实验之前，存活的小鼠保持健康。图 10A-10D 是 Western 印迹，显示了 GnRH-KLH 和 2GnRH_KLH 偶联物与用带有 GnRH 的ERA病毒免疫的小鼠血清和GonaCon 血清的反应。对于每个印迹来说，第1和2道分别含有GnRH-KLH和2GnRH-KLH。显示的是来自狂犬病毒ERA-IIa-GnRH免疫的小鼠血清(A)； 来自RVERA-N-GnRH免疫的小鼠血清(B)；来自ERA-N_2GnRH免疫的小鼠血清(C)；和针对 GonaCon 的兔血清(D)。在小鼠和兔血清之间没有检测到针对&iRH偶联物的差异。序列表在随附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列，使用如37C.F.R. 1.822中所定义的用于核苷酸碱基的标准字母缩写和用于氨基酸的三字母编码来显示。每个核苷序列仅显示了一条链，但是对所显示链的任何指称应该理解为包括了互补链。在随附的序列表中SEQ ID NO 1是通过反向遗传学回收的重组狂犬病毒ERA的核苷酸序列。 4370-4372位核苷酸从aga突变成gag，在G蛋白中引入了 Arg到Glu的氨基酸改变。SEQ ID NO 2是狂犬病毒ERA的N蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 3是狂犬病毒ERA的P蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 4是狂犬病毒ERA的M蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 5是狂犬病毒ERA的G蛋白的氨基酸序列。333位氨基酸残基处Arg 到Glu的变化是一个减毒突变。SEQ ID NO 6是狂犬病毒ERA的L蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO :7和8分别是狗透明带3 (ZP3)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO 9~26是用于产生狗ZP3的片段A的寡核苷酸的核苷酸序列。SEQ ID NO :27-46是用于产生狗ZP3的片段B的寡核苷酸的核苷酸序列。SEQ ID NO 47和48分别是GnRH的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO :49和50分别是在紧接19个氨基酸的G蛋白信号序列后插入单个&iRH 拷贝的狂犬病毒ERA的G蛋白的核苷酸和氨基酸序列。该构建物被称为G-N-GnRH。SEQ ID NO :51和52分别是在紧接19个氨基酸的G蛋白信号序列后插入两个&iRH 拷贝的狂犬病毒ERA的G蛋白的核苷酸和氨基酸序列。该构建物被称为G-N-2&1RH。SEQ ID NO 53和M分别是在紧接G蛋白的221位氨基酸(IIa位点)后插入单个foiRH拷贝的狂犬病毒ERA的G蛋白的核苷酸和氨基酸序列。该构建物被称为&iRH-p3 或 G-IIa-GnRH。SEQ ID NO :55 是 GnRH 肽 1780 的氨基酸序列。SEQ ID NO 56 是 GnRH 肽 1781 的氨基酸序列。SEQ ID NO 57是2GnRH(GnRH编码序列的两个串联拷贝)的核苷酸序列。SEQ ID NO :58和59是用于将GnRH编码序列插入到狂犬病毒G基因中的引物的
核苷酸序列。SEQ ID NO 60和61是用于将串联的GnRHQfoiRH)编码序列插入到狂犬病毒G基因中的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 62是狗ZP3的核苷酸序列，于2004年8月5日保存在GenBank登记号 NM 001003224 下。SEQ ID NO :63和64分别是具有插入到糖蛋白的胞外结构域与跨膜结构域的连接处(1374位核苷酸、458位氨基酸之后)的一个&iRH拷贝的狂犬病毒ERA的G蛋白的核苷酸和氨基酸序列。该构建物被称为G-C-GnRH。详细描述I.简介狂犬病是全球关注的重要公共卫生问题。在大多数情况下，人类通过患狂犬病的驯养或野生动物的叮咬感染上狂犬病毒。在发展中国家，94%的由狂犬病引起的人类死亡是狗造成的。在拉丁美洲、亚洲和非洲国家中，流浪或未接种的狗是狂犬病的首要储主。此外，在美国，目前有数百万流浪或野生猫。因此，在世界范围内，对于防止狂犬病和控制狂犬病易感动物特别是狗的种群两者都存在着需求。当前的动物种群控制方法包括使用免疫避孕疫苗。免疫避孕涉及刺激针对生殖细胞或生殖激素的免疫应答以阻止妊娠。免疫避孕是用于害虫和种群过度丰富的野生哺乳动物(例如浣熊或鹿)的种群控制的人道方法。大量研究聚焦于使用透明带糖蛋白3 (ZP3)， 它是精子用于使卵受精的主要受体。但是，ZP3或其他免疫避孕蛋白的给药，以前需要共同给药佐剂和/或加强剂量以引发针对蛋白的足够的免疫应答，以便抑制受精。因此，目前的免疫避孕方法具有显著局限性，特别是对于野生动物种群来说。本文公开的免疫原性组合物和方法，提供了同时保护接种动物抵抗狂犬病和通过抑制生育力来控制动物种群的手段。本文中描述了包含至少一种编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列的重组狂犬病毒。在具体实例中，免疫避孕蛋白是&iRH或ZP3。在某些情况下， 重组狂犬病毒包含&iRH和ZP3两者。可选地，可以用两种不同的重组狂犬病毒免疫动物， 一种包含&iRH，第二种包含ZP3。因为免疫避孕蛋白编码在狂犬病毒的基因组中，因此当产生重组狂犬病毒粒子时，免疫避孕肽复合在病毒粒子中(结构蛋白)，或包含在病毒粒子内 (非结构蛋白)。通过将免疫避孕蛋白复合在狂犬病毒粒子中，不需要佐剂来弓I发针对狂犬病毒和免疫避孕蛋白两者的免疫应答。II.缩写CMV细胞肥大病毒CTVT犬传染性生殖道肿瘤DFA直接荧光测定法DNA脱氧核糖核酸ERAEvelyn-Rokitnicki-AbelsethFFU病灶形成单位FITC荧光素异硫氰酸酯FSH卵泡剌激激素
权利要求
1.一种重组狂犬病毒，其中重组狂犬病毒的基因组包含狂犬病毒核蛋白(N)、磷蛋白 (P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)基因以及编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列，其中免疫避孕蛋白选自促性腺激素释放激素(&iRH)和透明带3(ZP3)。
2.权利要求1的重组狂犬病毒，其中基因组包含编码&iRH的核酸序列和编码ZP3的核酸序列。
3.权利要求1或2的重组狂犬病毒，其中G基因被重新定位在重组狂犬病毒基因组中 N基因与P基因之间。
4.权利要求1-3任一项的重组狂犬病毒，其中基因组源自于狂犬病毒ERA株。
5.权利要求4的重组狂犬病毒，其中ERA株的核苷酸序列包括SEQID NO :1。
6.权利要求1-5任一项的重组狂犬病毒，其中狂犬病毒糖蛋白包含在第333位氨基酸位置(根据SEQ ID NO 5编号)上的Glu。
7.权利要求1-6任一项的重组狂犬病毒，其中GnRH核酸序列与SEQID NO :47有至少 95%的同一性。
8.权利要求7的重组狂犬病毒，其中GnRH核酸序列包括SEQIDNO :47。
9.权利要求7的重组狂犬病毒，其中GnRH核酸序列由SEQIDNO 47构成。
10.权利要求1-6任一项的重组狂犬病毒，其中ZP3核酸序列是狗的ZP3核酸序列。
11.权利要求10的重组狂犬病毒，其中狗的ZP3核酸序列与SEQIDNO 7有至少95% 的同一性。
12.权利要求10的重组狂犬病毒，其中狗的ZP3核酸序列包括SEQID NO :7。
13.权利要求10的重组狂犬病毒，其中狗的ZP3核酸序列由SEQIDNO 7构成。
14.权利要求1-13任一项的重组狂犬病毒，其包含两个拷贝的&iRH核酸序列。
15.权利要求1-13任一项的重组狂犬病毒，其包含两个拷贝的ZP3核酸序列。
16.权利要求14或15的重组狂犬病毒，其中两个拷贝是毗邻的。
17.权利要求14或15的重组狂犬病毒，其中两个拷贝不是毗邻的。
18.权利要求1-17任一项的重组狂犬病毒，其中&iRH核酸序列插入到狂犬病毒糖蛋白基因内。
19.权利要求18的重组狂犬病毒，其中&iRH核酸序列插入到糖蛋白基因的信号序列 (SEQ ID NO 49的1-57位核苷酸)之后。
20.权利要求19的重组狂犬病毒，其中糖蛋白基因包括SEQIDN0:49或SEQ ID NO 51 的核酸序列。
21.权利要求18的重组狂犬病毒，其中&iRH核酸序列插入到紧接糖蛋白基因的抗原性位点IIa(SEQ ID NO 53的第663位核苷酸)之后。
22.权利要求21的重组狂犬病毒，其中糖蛋白基因包括SEQIDNO :53的核酸序列。
23.权利要求18的重组狂犬病毒，其中&iRH核酸序列插入到糖蛋白基因的胞外结构域与跨膜结构域的连接处(SEQ ID NO 63的第1374位核苷酸之后)。
24.权利要求23的重组狂犬病毒，其中糖蛋白基因包括SEQIDNO 63的核酸序列。
25.权利要求1-17任一项的重组狂犬病毒，其中ZP3核酸序列插入到狂犬病毒的P与 M基因之间。
26.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-25任一项的重组狂犬病毒。
27.权利要求26的免疫原性组合物，其还包含可药用载体。
28.权利要求26或27的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
29.一种免疫原性组合物，其包含第一种重组狂犬病毒和第二种重组狂犬病毒，其中第一种重组狂犬病毒的基因组包含&iRH核酸序列，并且第二种重组狂犬病毒的基因组包含 ZP3核酸序列。
30.权利要求29的免疫原性组合物，其中第一种重组狂犬病毒是权利要求1-9、14和 16-24任一项的狂犬病毒。
31.权利要求29或30的免疫原性组合物，其中第二种重组狂犬病毒是权利要求1-6、 10-13、15-17和25任一项的重组狂犬病毒。
32.权利要求29-31任一项的免疫原性组合物，其还包含可药用载体。
33.权利要求29-32任一项的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
34.一种免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并抑制动物生育力的方法，所述方法包括向动物给药治疗有效量的权利要求26-33任一项的免疫原性组合物。
35.权利要求34的方法，其中免疫原性组合物经口服给药。
36.权利要求35的方法，其中免疫原性组合物通过食物诱剂给药。
37.权利要求34-36任一项的方法，其中动物是驯养动物。
38.权利要求34-36任一项的方法，其中动物是野生动物。
39.权利要求34-36任一项的方法，其中动物是狗、猫、大鼠、小鼠、蝙蝠、狐狸、浣熊、松鼠、负鼠、丛林狼或狼。
40.权利要求沈-33任一项的组合物在制备用于免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并抑制动物的生育力的药物中的应用。
41.权利要求沈-33任一项的组合物，其用于免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并抑制动物的生育力的方法中。
全文摘要
本文描述了含有编码免疫避孕蛋白，例如促性腺激素释放激素(GnRH)或透明带3(ZP3)的异源核酸序列的重组狂犬病毒。本文公开的重组狂犬病毒通过反向遗传学回收，复制高效，在接种的动物中引发狂犬病毒中和抗体和免疫避孕肽特异性抗体，并保护接种的动物抵抗野生型狂犬病毒的激惹。此外，还提供了免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并在同时抑制动物生育力的方法，所述方法包括给药包含上述一种或多种重组狂犬病毒的免疫原性组合物。
文档编号C07K14/145GK102159240SQ200980136612
公开日2011年8月17日 申请日期2009年8月20日 优先权日2008年9月17日
发明者吴贤福, 查尔斯·拉普里奇特 申请人:美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心