双特异性抗-egfr/抗-igf-1r抗体的制作方法

专利名称：双特异性抗-egfr/抗-igf-1r抗体的制作方法
双特异性抗-EGFR/抗-丨GF-1R抗体本发明涉及针对EGFR和针对IGF-IR的双特异性抗体，制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。
背景技术：
EGFR 和抗-EGFR 抗体人表皮生长因子受体(也已知为HER-I或Erb-Bl，并且在本文中称作〃 EGFR") 是170kDa的跨膜受体，其由c-erbB原癌基因编码，并且显示固有的酪氨酸激酶活性 (Modjtahedi, H.，等，英国癌症杂志(Br. J. Cancer) 73 (1996) :228-235 ；Herbst, R. S.和 Shin, D.M.，癌症(Cancer)94(2002) :1593_1611)。SwissProt 数据库登录号 P00533 提供了 EGFR的序列。还存在EGFR的同种型和变体(例如，可变RNA转录物，截短形式，多态性等)，包括但不限于 Swissprot 数据库登录号 P00533-1，P00533-2, P00533-3，和 P00533-4 确定的那些。已知EGFR结合包括以下各项的配体表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-a (TGf-a )，双调蛋白，肝素结合EGF(hb-EGF)，β动物纤维素，和印iregulin(Herbst， R. S.和 Shin, D. Μ.，癌症(Cancer)94(2002) 1593-1611 ；Mendelsohn, J.，和 Baselga, J.，原癌基因(Oncogene) 19 (2000) 6550-6565)。EGFR经由酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节许多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖、分化、细胞存活、程序性细胞死亡、血管发生、有丝分裂发生和转移的信号转导途径(Atalay等，Ann. Oncology 14(2003) 1346-1363 ；Tsao,A. S. ^P Herbst, R. S.信号(Signal) 4 (2003) 4-9 ；Herbst, R. S., 和 Shin，D. Μ.，癌症(Cancer)94(2002) 1593-1611 ；Modjtahedi, H.，等，英国癌症杂志(Br. J. Cancer)73(1996)228-235)。EGFR的过量表达已经在许多人类恶性病症中报道，包括膀胱癌、脑癌、头和颈癌、 胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌。(Atalay，G.，等，Ann. Oncology 14(2003) 1346-1363 ；Herbst, R. S.，和 Shin, D. Μ·，癌症(Cancer)94 (2002) 1593-1611 ； Modjtahedi, H.，等，英国癌症杂志(Br. J. Cancer) 73 (1996) 228-235)。在这些病症的许多中，EGFR的过量表达与患者的差的预后相关或关联。(Herbst，R. S.，和^ η， D. Μ.，癌症(Cancer)94(2002) 1593-1611 ；Modjtahedi, H.，等，英国癌症杂志(Br. J. Cancer) 73 (1996) 228-235)。EGFR也在正常组织的细胞中表达，特别是皮肤、肝脏和胃肠道的上皮组织，尽管通常水平比在恶性细胞中低(Herbst，R. S.，和Siin，D.M.，癌症 (Cancer)94(2002)1593-1611)。未缀合的单克隆抗体(mAbs)可以是用于治疗癌症的有用的药，如由美国食品和药物管理局(U. S. Food and Drug Administration)所批准的下列药物所证明用于治疗晚期乳腺癌的曲妥珠单抗(Herceptin ；Genentech Inc,) (Gri 1 Io-Lopez，A. -J.，等，Semin. Oncol. 26(1999)66-73 ；Goldenberg, Μ· M.，临床治疗(Clin. Ther.) 21(1999) :309-18)， 用于治疗⑶20阳性B细胞，低级或滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤的利妥昔单抗(Rituxan ; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA,禾口 Genentech Inc. , San Francisco, CA),用于治疗复发性急性骨髓白血病的吉妥珠单抗(Mylotarg ，Celltech/Wyeth-Ayerst)，和用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的阿仑珠单抗(CAMPATH ，Millenium Pharmaceuticals/Schering AG)。这些产品的成功不仅依赖于它们的功效，还依赖于它们突出的安全模式 (GrilIo-Lopez，A. -J.，等·，Semin. Oncol. 26(1999) :66-73 ；Goldenberg, Μ. M.，临床治疗 (Clin. Ther). 21 (1999) 309-18)。尽管在这些药物上所取得的成就，目前在获得更高特异性抗体活性方面存在巨大的兴趣，所述特异性活性比典型地由未缀合的mAb疗法所提供的要高。许多研究的结果显示Fc-受体依赖性机制相当大地有利于对针对肿瘤的细胞毒性抗体的作用，并且指示针对肿瘤的最佳抗体将优先结合以激活Fc受体，并且与抑制性配偶体 Fc YRIIB 结合程度最小。(Clynes，R.A.，等，自然药物(Nature Medicine) 6 (4) 443-446 (2000) ；Kalergis, Α. M.，和 Ravetch, J. V.，J. Exp. Med. 195 (12) (2002) 1653-1659。 例如，至少一项研究的结果显示Fc YRIIIa受体中的多态性特别地与抗体疗法的功效紧密相关(Cartron, G.，等，血液(Blood) 99 (3) (2002)754-757。该研究显示对于 Fc γ RIIIa 是纯合的患者，与对于Fc YRIIIa是杂合的患者相比，具有更好的针对利妥昔单抗的应答。作者得出结论为更优的应答是由于抗体与Fc YRIIIa的更好的体内结合，其导致了针对淋巴瘤细胞的更好的 ADCC 活性(Cartron, G.，等，血液(Blood) 99 (3) (2002)754-758) 已经报道了靶向EGFR和阻断EGFR信号传导途径的各种策略。小分子酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼，厄洛替尼和CI-1033在胞内酪氨酸激酶区域内阻断EGFR的自磷酸化， 由此抑制下游信号传导事件(Tsao，A. S.，和Herbst, R. S.，信号(Signal) 4 (2003) 4-9)。另一方面，单克隆抗体，靶向EGFR的胞外部分，导致阻断配体结合并由此抑制下游事件如细胞增殖(Tsao, A. S.，和 Herbst，R. S.，信号(Signal) 4 (2003) 4-9)。已经产生了几种鼠单克隆抗体，其获得这种体外阻断并且已经在小鼠异种移植模型中评估它们影响肿瘤生长的能力(Masui，等，癌症研究(Cancer Res. )46(1986)5592-5598 ；Masui, H.，等，癌症研究(Cancer Res). 44 (1984) 1002-1007 ； Goldstein,等，临床癌症研究(Clin. Cancer Res.) (1995) 11311-1318)。例如，EMD 55900 (EMD Pharmaceuticals)是针对人表皮样癌细胞系A431产生的鼠抗-EGFR单克隆抗体，并且在喉或下咽部晚期鳞状细胞癌患者的临床研究中检验(Bier，H.，等，Eur. Arch. Otohinolaryngol. 252 (1995) 433-9)。另外，结合EGFR胞外结构域的大鼠单克隆抗体 ICR16，ICR62，和ICR80已经显示有效抑制EGF和TGF-α受体的结合(Modjtahedi，H.，等， Int. J. Cancer 75(1998)310-316)。鼠单克隆抗体425是另一种针对人A431癌细胞系产生的Mab并且发现在人表皮生长因子受体的外部结构域上与多肽表位结合。(Murthy，U.，等， 生物化学生物物理进展(Arch. Biochem. Biophys). 252 (2) (1987) M9-560。在治疗性治疗中使用鼠抗体的潜在问题是非人单克隆抗体可以被人宿主识别为外源蛋白；因此，重复注射这些外源抗体可导致诱导免疫反应，导致有害的超敏反应。对于基于鼠的单克隆抗体，这经常被称为人抗小鼠抗体应答，或"HAMA"应答，或人抗大鼠抗体，或"HARA"应答。此外， 这些“异源”抗体可以被宿主的免疫系统所攻击从而使它们，在达到它们的靶位点前被有效地中和。另外，非人单克隆抗体(例如，鼠单克隆抗体)典型地缺乏人效应子功能性，即它们不能，特别是通过抗体依赖性细胞毒性或Fc-受体介导的吞噬作用来介导补体依赖性的裂解或溶解人靶细胞。已经开发了嵌合抗体作为“缀合”抗体的置换物，所述嵌合抗体包含来自两种或多种不同物种(例如，小鼠和人类)的抗体的部分。例如US5，891，996 (Mateo de Acosta delRio, C.M.，等)讨论了小鼠/人嵌合抗体，R3，针对EGFR，并且US 5，558，864讨论了产生嵌合和人源化形式的鼠抗-EGFR MAb 425。此外，IMC-C225 (Erbitux ImClone)是嵌合小鼠/人抗-EGFR单克隆抗体(基于小鼠M225单克隆抗体，其在人临床试验中导致HAMA 应答)，其已经报道在各种人异种移植模型中显示抗肿瘤功效。(Herbst，R.S.，和^ η， D.M.，癌症(Cancer) 94 (2002) 1593-1611) IMC-C225的功效已经归因于几个机制，包括抑制通过EGFR信号传导途径，和可能通过增加的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)活性调节的细胞事件(Herbst, R. S.，和 Shin，D.M·，癌症(Cancer)94Q002) 1593-1611)。IMC-C225 也用于临床试验中，包括与放射疗法和化学疗法联合(Herbst，R. S.，和Siin，D. Μ.，癌症 (Cancer)94(2002) 1593-1611) 最近，Abgenix, Inc. (Fremont, CA)开发了用于癌症治疗的 ABX-EGF。ABX-EGF 是一种完全人的抗-EGFR 单克隆抗体。(Yang，X. D.，等，Crit. Rev. Oncol. /Hematol. 38(2001) 17-23)。WO 2006/082515涉及源自大鼠单克隆抗体ICR62的人源化的抗-EGFR单克隆抗体并且涉及它们用于癌症治疗的糖改造形式。IGF-IR 和抗-IGF-IR 抗体胰岛素样生长因子I受体(IGF-1R，IGF-IR，⑶221抗原)属于跨膜蛋白酪氨酸激酶家族)(LeRoith，D.，等，内分泌学综述(Endocrin. Rev.) 16(1995) 143-163 ；和 Adams, Τ. Ε.，等，细胞分子生命科学(Cell. Mol. Life Sci.) 57 (2000) 1050-1093) IGF-IR 以高亲和性结合IGF-I并在体内起始针对这种配体的生理反应。IGF-IR还与IGF-II结合，但是以稍微更低的亲和性结合。IGF-IR的过量表达促进细胞的致瘤性转化，并且存在这样的证据，即IGF-IR涉及细胞的恶性转化并且因此成为有用的靶标用于开发治疗癌症的治疗剂 (Adams, Τ. Ε.，等，细胞分子生命科学(Cell. Mol. Life Sci.) 57 (2000) 1050-1093)。针对IGF-IR的抗体是现有技术中公知的并且关于它们在体外和体内的抗肿瘤功效进行了研究(Benini, S.，等，临床癌症研究(Clin. CancerRes.) 7 (2001) 1790-1797 ； Scotlandi, K.，等，癌症基因治疗(Cancer Gene Ther.) 9 (2002) 296-307 ；Scotlandi， K.，等，国际癌症杂志(Int. J. Cancer) 101 (2002) 11-16 ；Brunetti, Α.，等，生物化学生物物理研究通讯(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 165 (1989) 212-218 ；Prigent, S. A.， 等，生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 265 (1990) 9970-9977 ；Li，S. L.，等，癌症免疫学免疫治疗(Cancer Immunol. Immunother.) 49 (2000) 243-252 ；Pessino, A.，等，生物化学生物物理研究通讯(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 162(1989) 1236-1243 ；Surinya, K. H.,等，生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 277 (2002) 16718-16725 ；Soos, Μ. A.，等，生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 267 (1992) 12955-12963 ；Soos, Μ. A.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 86 (1989) 5217-5221 ；0 ‘ Brien, R.，Μ·，等，EMBO J. 6 (1987) 4003-4010 ；Taylor, R.，等，生物化学杂志(Biochem. J.) 242 (1987) 123-129 ； Soos, Μ. Α.，等，生物化学杂志(Biochem. J. )235(1986) 199-208 ；Li, S. L.，等，生物化学生物物理通讯(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 196(1993)92-98 ；Delafontaine, P.，等，J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673 ；Kull, F. C.，Jr.，等生物化学杂志(J. Biol. Chem. )258(1983)6561-6566 ;Morgan，D. 0.，和 Roth，R. Α.，生物化学 (Biochemistry) 25 (1986) 1364-1371 ；Forsayeth, J. R.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 84 (1987) 3448-3451 ；Schaefer, Ε· Μ·，等，生物化学杂志(J. Biol.Chem.) 265 (1990) 13248-13253 ；Gustaf son，Τ. Α.，和 Rutter，W. J.，生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 265 (1990) 18663-18667 ；Hoyne, P. A.，等，FEBS 通信(FEBS Lett.) 469 (2000) 57-60 ； Tulloch, P. A.，等，结构生物学杂志(J. Struct. Biol.) 125(1999) 11-18 ；Rohlik, Q. Τ.， 等，生物化学生物物理研究通讯(Biochem. Biophys. Res. Comm.) 149 (1987) 276-281 ； 和 Kalebic, T.，等，癌症研究(Cancer Res.) 54 (1994) 5531-5534 ；Adams, Τ. Ε.，等， 细胞分子生命科学(Cell. Mol. Life Sci.) 57 (2000) 1050-1093 ；Dricu, Α.,等，糖生物学(Glycobiology)9(1999) 571-579 ；Kanter-Lewensohn, L.，等，黑素瘤研究 (Melanoma Res.) 8 (1998) 389-397 ；Li, S. L.，等，癌症免疫学免疫治疗(Cancer Immunol. Immunother.) 49 (2000) 243-252)。针对IGF-IR的抗体在许多其他的文献中进行了描述，例女口 Arteaga，C. L.,等，乳腺癌研究治疗(Breast Cancer Res. Treatment) 22 (1992) 101—106 ； 和 Hailey，J.，等，分子癌症治疗(Mol. Cancer Ther.) 1 (2002) 1349-13530具体地，针对IGF4R被称为α IR3的单克隆抗体广泛用于研究IGF-IR介导的过程和IGF-I介导的疾病如癌症的研究中。α -IR-3由Kull, F. C.，生物化学杂志(J. Biol. Chem. )258(1983)6561-6566描述。同时，约有百篇已经出版的出版物涉及α IR3抗肿瘤效果的研究和治疗应用，其中α IR3单独地和与细胞生长抑制剂如多柔比星(doxorubicin) 和长春新碱(vincristine) —起进行治疗。α IR3是一种已知抑制IGF-I与IGF受体的结合，但是不抑制IGF-II与IGF-IR结合的鼠单克隆抗体。α IR3以高浓度刺激肿瘤细胞增殖和 IGF-IR 磷酸化作用(Bergmann，U.，等，癌症研究(Cancer Res.) 55 (1995) 2007-2011 ； Kato, H.,等，生物化学杂志(J. Biol. Chem. )268 (199 洸55-2661)。存在其他的抗体(例如，1H7，Li，S.，L.，等，癌症免疫学免疫疗法(Cancer Immunol. Immunother. )49 0000043-252)，所述抗体抑制 IGF-II 与 IGF-IR 的结合比抑制 IGF-I 结合更有效。抗体和它们的性质和特征的现有技术的简述由Adams，T.E.，等，细胞分子生命科学(Cell. Mol. Life Sci.) 57 OOOO) 1050-1093 描述。在现有技术中描述的大多数抗体是小鼠起源的。所述抗体，如在现有技术中所公知的，如果不经过进一步改变如嵌合或人源化对于人患者的治疗是无效的。基于这些缺陷， 明显地优选人抗体作为治疗剂用于治疗人患者。人抗体在现有技术中是公知的(van Dijk, Μ. Α.，和 van de Winkel，J. G.，Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374)。基于这些技术，可以产生针对多种靶标的人抗体。将针对IGF-IR的人抗体的实例描述在WO 02/053596中。WO 2005/0056:35 涉及人抗-IGF-IR 抗体 <IGF-1R>HUMAB 克隆 18 (DSM ACC 2587) 或<16 -1心而獻8克隆22(0511 ACC 2594)以及它们在癌症治疗中的应用。双特异性抗体最近已经开发了广泛多样的重组抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Coloma，Μ. J.，等，自然生物技术(Nature Biotech.) 15(1997) 159-163 ；WO 2001/077342 和 Morrison，S. L.等，自然生物技术(Nature Biotech.)25 (2007) 1233-1234)。此外，开发了能够结合两种以上抗原的若干其他新型形式，其中抗体核心结构 (IgA, IgD, IgE, IgG或IgM)不再保持诸如双抗体(diabodies)、三链抗体或四链抗体 (tetrabodies)，微型抗体(minibodies)，若干单链形式(scFv，双-scFv) (Holliger P, 等，Nature Biotech (自然生物技术)23 ^00 11洸_11362005 ;Fischer N.，和 L6ger，0.，病理学(Pathobiology) 74 (2007) 3-14 ；Shen J，等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods) 318 (2007) 65-74 ；ffu, C.等，自然生物技术(Nature Biotech)25 (2007) 1290-1297)。所有这样的形式使用接头将抗体核心(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)与其他结合蛋白(例如scFv)融合或融合例如两个Fab片段或scFv(Fischer N. , Leger 0.，病理学 (Pathobiology) 74 (2007) 3-14)。人们可能一直希望保持效应子功能，诸如例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，它们通过保持与天然存在的抗体的高度相似性而通过Fc受体结合来介导。在WO 2007/024715中，报道了双重可变的结构域免疫球蛋白作为改造的多价和多特异性结合蛋白。在US 6，897，044中报道了具有生物活性的抗体二聚体的制备方法。在 US 7，129，330中报道了具有至少四个彼此通过肽接头连接的可变结构域的多价Fv抗体构建体。在US 2005/0079170中报道了二聚体和多聚体抗原结合结构。在US 6，511，663中报道了三价或四价单特异性抗原结合蛋白，其包含通过连接结构彼此共价结合的三个或四个Fab片段，所述蛋白不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报道了这样的四价双特异性抗体，其可以在原核细胞和真核细胞中有效表达，并且用于治疗和诊断方法中。在US 2005/0163782中报道了在包含两种类型的多肽二聚体的混合物中将通过至少一个链间二硫键连接的二聚体与不通过至少一个链间二硫键连接的二聚体分离或优先合成通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。在US 5，959，083中报道了双特异性四价受体。在 WO 2001/077342中报道了具有三个或多个功能性抗原结合位点的改造的抗体。在WO 1997/001580中报道了多特异性和多价抗原结合多肽。WO 1992/004053报道了共轭对配合物(homoconjugate)，其典型地由结合相同抗原决定簇的IgG类的单克隆抗体制备，通过合成交联共价连接。在WO 1991/06305中报道了对于抗原具有高亲和力的低聚单克隆抗体，其中分泌典型地是IgG类的低聚物，其具有两种以上的免疫球蛋白单体， 所述免疫球蛋白单体缔合在一起形成四价或六价IgG分子。在US 6，350，860中报道了绵羊来源的抗体和改造的抗体构建体，其可以用于治疗其中干扰素Y活性是致病性的疾病。 在US 2005/0100543中，报道了可靶向的构建体，所述构建体是双特异性抗体的多价载体， 即可靶向的构建体的每个分子可以作为两种以上双特异性抗体的载体。在WO 1995/009917 中报道遗传改造的双特异性四价抗体。在WO 2007/1092M中，报道了由稳定的scFv组成或包含稳定的scFv的稳定的结合分子。自Lu，D.，等，生物化学和生物物理研究通讯(Biochemical and Biophysical Research Communications)318 (2004)507-513 ；生物化学杂志(J. Biol. Chem.), 279 (2004) 2856-2865 ；和生物化学杂志(J. Biol Chem.) 280 (2005) 19665-72 已知针对 EGFR和IGF-IR的双特异性抗体。然而，当与母体单特异性抗体的组合比较，这些双特异性抗-EGFR/抗-IGF-IR抗体清楚地显示减少的肿瘤生长抑制(尤其在这两者，即EGFR和 IGF-IR具有相等(高)表达水平的肿瘤细胞中)。发明简述我们目前令人惊奇地发现新的双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体，与母体单特异性抗体的组合比较，其显示至少类似的肿瘤生长抑制(仅使用减少量的双特异性抗体)(尤其在这两者，即EGFR和IGF-IR具有相等(高)表达水平的肿瘤细胞中)。
本发明的第一方面是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-IR的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO=I的⑶R3区域， SEQ ID NO :2的⑶R2区域，和SEQ ID NO :3的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含 SEQ ID NO 4 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 区域；禾口iii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 11的⑶R3区域，SEQ ID NO 12的⑶R2区域，和SEQ ID NO 13的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含 SEQ ID NO 14 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 15 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 16 的 CDRl 区域；或所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 17的⑶R3区域， SEQ ID NO 18的⑶R2区域，和SEQ ID NO: 19的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含 SEQ ID NO 20 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 21 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 22 的 CDRl 区域。在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于i)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 10作为轻链可变结构域，ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO 23或SEQ ID NO 24作为重链可变结构域，和包含SEQ ID N0:25或SEQ ID NO J6作为轻链可变结构域。在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于i)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO :8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 10作为轻链可变结构域，ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO 23作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 25作为轻链可变结构域。所述双特异性抗体至少是二价的，并且可以是三价、四价或多价的。优选地，根据本发明的双特异性抗体是二价、三价或四价的。本发明的另一方面是编码所述双特异性抗体的链的核酸分子。本发明的另一方面是包含所述双特异性抗体的药物组合物，所述组合物用于治疗癌症，所述双特异性抗体用于制备治疗癌症的药物的应用，通过向需要所述治疗的患者施用所述双特异性抗体来治疗患有癌症的患者的方法。根据本发明所述的双特异性抗体对于需要EGFR和IGF-IR靶向疗法的患者显示益处。根据本发明所述的抗体具有新的和有创造性的性质，从而导致对于患有所述疾病的患者，尤其是患有癌症的患者的益处。发明详述本发明的一个实施方案是结合EGFR和IGF-IR的双特异性抗体，其包含结合EGFR 的第一抗原结合位点和结合IGF-IR的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO=I的⑶R3区域， SEQ ID NO :2的⑶R2区域，和SEQ ID NO :3的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含 SEQ ID NO 4 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 区域；禾口
iii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO 11的⑶R3区域，SEQ ID NO 12的⑶R2区域，和SEQ ID NO 13的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含 SEQ ID NO 14 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 15 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 16 的 CDRl 区域。本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合 EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-IR的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO=I的⑶R3区域， SEQ ID NO :2的⑶R2区域，和SEQ ID NO :3的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含 SEQ ID NO 4 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 区域；禾口iii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID N0:17的⑶R3区域，SEQ ID NO 18的⑶R2区域，和SEQ ID NO 19的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含 SEQ ID NO 20 的 CDR3 区域，SEQ ID NO :21 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 22 的 CDRl 区域。本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-IR的双特异性抗体，其包含结合 EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-IR的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；ii)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 10作为轻链可变结构域iii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO 23或SEQ ID NO 24作为重链可变结构域，和包含SEQ ID N0:25或SEQ ID NO J6作为轻链可变结构域。本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合 EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-IR的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；ii)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO :7作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 10作为轻链可变结构域iii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO :23作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 25作为轻链可变结构域。本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合 EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-IR的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；ii)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO :8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 10作为轻链可变结构域iii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO :23作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 25作为轻链可变结构域。
本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合 EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-IR的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；ii)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO :7作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 10作为轻链可变结构域iii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO : 作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 26作为轻链可变结构域。本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合 EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-IR的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；ii)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO :8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 10作为轻链可变结构域iii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO 作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 26作为轻链可变结构域。用于本文时，“抗体"指包含抗原结合位点的结合蛋白。术语“结合位点”或“抗原结合位点”用于本文时，指配体实际上结合的抗体分子的区域。在根据本发明所述的抗体中的结合位点每个可以由两个可变结构域的对形成，即一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的一对形成。在抗体中的最小结合位点决定簇是重链CDR3区域。在本发明的一个实施方案中，每个结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域 (VL)，和优选地由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的对形成。抗体特异性指抗体对于抗原的特定表位的选择性识别。天然抗体，例如是单特异性的。根据本发明所述的“双特异性抗体”是具有两种不同的抗原结合特异性的抗体。如果抗体具有超过一种特异性，识别的表位可以与单抗原或一种以上的抗原相关。本发明的抗体特异于两种不同的抗原，即作为第一抗原的EGFR和作为第二抗原的IGF-1R。术语“单特异性”抗体，用于本文时指具有一个或多个分别结合于相同抗原的相同表位的结合位点的抗体。术语“价”在本申请中使用时指结合位点在抗体分子上存在的具体数量。象这样， 术语“二价”，“四价”，和“六价”指在抗体分子上分别存在两个结合位点，四个结合位点，和六个结合位点。根据本发明的双特异性抗体是至少“二价的”，并且可以是“三价”或“多价” 的(例如(“四价”或六价)的)。优选地，根据本发明的双特异性抗体是二价，三价或四价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是二价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的。本发明的抗体具有两个以上的结合位点，并且是双特异性的。即，即使是在存在两个以上结合位点(即，抗体是三价或多价的)的情形中，所述抗体可以是双特异性的。本发明的双特异性抗体包括，例如多价单链抗体、双抗体和三链抗体，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，另外的抗原结合位点(例如单链Fv、VH结构域和/或VL结构域，Fab, 或(Fab) 2))通过一个或多个肽接头连接所述全长抗体的恒定结构域结构。所述抗体可以是来自单一物种的全长抗体，或可以是嵌合化或人源化的。对于具有超过两个抗原结合位点的抗体，一些结合位点可以是相同的，只要所述蛋白具有对于两个不同抗原的结合位点。 即，当第一结合位点特异于EGFR时，第二结合位点特异于IGF-1R。象天然抗体一样，本发明的抗体的抗原结合位点典型地包含六个互补性决定区 (CDRs)，其在不同程度上有助于结合位点对于抗原的亲和性。存在三个重链可变结构域 CDRs (CDRH1，CDRH2 和 CDRH3)和三个轻链可变结构域 CDRs (CDRL1，CDRL2 和 CDRL3)。CDR 和构架区(FRs)的程度通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来确定，所述氨基酸序列中那些区域根据序列之间的可变性来确定。此外，还包括在本发明范围内的是包含更少⑶Rs 的功能性抗原结合位点(即，在结合特异性由三个、四个或五个CDRs决定的情形中)。例如，少于6个⑶Rs的完整组对于结合可能是足够的。在一些情形中，VH或VL结构域是足够的。在某些实施方案中，本发明的抗体还包含一个或多个免疫球蛋白种类的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白种类包括IgG, IgM, IgA, IgD, ^P IgE同种型，并且在IgG和IgA的情形中，包括它们的亚型。在优选的实施方案中，本发明的抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构，但是具有四个抗原结合位点。这是通过将两个特异性结合EGFR的完整抗原结合位点 (例如，单链Fv)与特异性结合IGF-IR的完整抗体的N端或C端重链或轻链进行连接来实现。这四个抗原结合位点优选地对于两种不同结合特异性的每种包含两个结合位点。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。术语“嵌合抗体”指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison，S. L.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad Sci. USA) 81 (1984) 6851-6855 ；US 5，202，238 和 5，204，244。术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与母体免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中， 将鼠⑶R移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见，例如，Riechmann, L.，等，自然 (Nature) 332 (1988) 323-327 ；和 Neuberger，Μ. S.，等，自然(Nature) 314 (1985) 268-270o 特别优选的CDRs对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合。用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel, J. G., 当前化学生物学观点(Curr. Opin. Chem. Biol). 5 (2001) 368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在所述种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见，例如JakobovitsA.， 等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报)90 (1993) 2551-2555 Jakobovits, A.，等·，Nature (自然)362 (1993) 255-258 ；Bruggemann, M.，等·，Year Immunol.(免疫学年度)7(199 33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H. R.，和 Winter, G.，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等.，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)222 (1991) 581-597)。Cole,等和Boerner等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole，S. P. C.，等·，Monoclonal antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R. Liss, (1985)77-96 ；和 Boerner, P.，等·，J. Immunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。如已经对按照本发明的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生按照本发明的特性， 特别是关于Clq结合和/或FcR结合，例如通过“类别转换”即改变或突变Fc部分(例如由 IgGl 到 IgG4 和 / 或 IgGl/IgG4 突变。)用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NSO或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。 这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。按照本发明的重组人抗体已经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管源自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中的序列。“可变结构域”(轻链(VL)的可变结构域，重链(VH)的可变区)用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补性决定区，⑶Rs)相连接。构架区采用β-折叠构象且⑶R可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的CDR —起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和性方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“⑶Rs”的氨基酸残基。“构架”或“FR” 区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从 N端到C端包括结构域FRl，⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3和FR4。各条链上的⑶R通过所述构架氨基酸分开。特别地，重链的⑶R3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat等，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，公众健康服务，国家健康研究所(Public Health Service,National Institutes of Health), Bethesda, MD. (1991))的标准定义确定CDR和FR区域。根据本发明所述的双特异性抗体还包括具有“保守序列修饰”的这些抗体(这是指双特异性抗体的“变体”)。这意味着不影响或改变根据本发明所述的抗体的上述特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。可以通过本领域已知的标准技术引入修饰，如位点定向诱变和 PCR介导的诱变。保守氨基酸置换包括其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基取代的置换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此， 在双特异性<EGFR-IGF1R>抗体中的预测的非必需氨基酸残基可以优选地被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基置换。因此，“变体”双特异性<EGFR-IGF1R>抗体在本文是指这样的分子，其氨基酸序列与“母体”双特异性<EGFR-IGF1R>抗体氨基酸序列的不同之处在于在母体抗体的一个或多个可变区或恒定区中至多10个，优选约2个到约5个添加、缺失和/或置换。氨基酸置换可以通过基于分子建模的诱变进行，如在RieChmann，L.，等，自然 (Nature) 332 (1988) 323-327 和 Queen，C.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 86 (1989) 10029-10033 中所述。在本文将关于所述序列的同一性或同源性定义为在比对序列和引入间隙(如果需要)以获得最大的百分比序列同一性后，在候选序列中与母体序列相同的氨基酸残基的百分比。N端、C端或内部延伸、缺失或插入抗体序列都不应该被认为影响序列同一性或同源性。变体保留结合人EGFR和人IGF-IR的能力。用于本文时，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在用表达野生型抗原的CHO细胞进行的基于细胞的ELISA中，抗体与抗原的表位的结合。结合意为 10、以下，优选地10 M到101的结合亲和性(Kd)0抗体与抗原或Fc γ RIII的结合可以通过 BIAcore 测定法(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)进行研究。结合的亲和性由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，kD (解离常数)和Kd (kD/ ka)定义。术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面分组(groupings)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的带电特性。表位是被抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优选识别其靶抗原时，将该抗体称为与抗原特异性结合。人表皮生长因子受体(也已知为HER-I或Erb-Bl，并且在本文中称作〃 EGFR") 是170kDa的跨膜受体，其由c-erbB原癌基因编码，并且显示固有的酪氨酸激酶活性 (Modjtahedi，H.，等，英国癌症杂志(Br. J. Cancer) 73 (1996) :228-235 ；Herbst, R. S.和 Shin, D.M.，癌症(Cancer) 94 (2002) :1593_1611)。SwissProt 数据库登录号 P00533 提供了 EGFR的序列。还存在EGFR的同种型和变体(例如，可变RNA转录物，截短形式，多态性等)，包括但不限于 Swissprot 数据库登录号 P00533-1，P00533-2, P00533-3，和 P00533-4 确定的那些。已知EGFR结合包括以下各项的配体α )，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-a (TGf-a )，双调蛋白，肝素结合EGF(hb-EGF)，β动物纤维素，和印iregulin(Herbst， R. S.和 Shin，D.M·，癌症(Cancer)94(2002) 1593-1611 ；Mendelsohn, J.,和 Baselga， J.，原癌基因(Oncogene) 19 (2000) 6550-6565)。EGFR经由酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节许多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖、分化、细胞存活、程序性细胞死亡、血管发生、有丝分裂发生和转移的信号转导途径(Atalay，G.，等，Ann. Oncology 14(2003) 1346-1363 ；Tsao,A. S.和 Herbst，R.S.信号(Signal) 4 (2003) 4-9 ；Herbst，R. S.， 和 Shin，D. Μ.，癌症(Cancer) 94 (2002) 1593-1611 ；Modjtahedi, H.，等，英国癌症杂志(Br. J.Cancer)73(1996)228-235)。胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR，⑶221抗原)属于跨膜蛋白酪氨酸激酶家族) (LeRoith，D.，等，内分泌学综述(Endocrin. Rev.) 16 (1995) 143-163 ；和 Adams, Τ. Ε.，等，细胞分子生命科学(Cell. Mol. Life Sci.) 57 (2000) 1050-1093) SwissProt 数据库登录号 P08069提供IGF4R的序列。IGF-IR以高亲和性结合IGF-I并在体内起始针对这种配体的生理反应。IGF4R还与IGF-II结合，但是以稍微更低的亲和性结合。IGF4R的过量表达促进细胞的致瘤性转化，并且存在这样的证据，即IGF4R涉及细胞的恶性转化并且因此成为有用的靶标用于开发治疗癌症的治疗剂(Adams，Τ. Ε.，等，细胞分子生命科学(Cell. Mol. Life Sci. )57(2000) 1050-1093) 在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含全长母体抗体作为支架。术语“全长抗体”指由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体 (见

图10，不具有CH4结构域的“全长抗体”的示意性结构。还见图1和12中，具有单链Fv 连接物(XGFR)和具有单链Fab连接物(scFab-XGFR)的四价双特异性形式的全长部分)。 “全长抗体重链”是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1 (CHl)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2 (CH2)，和抗体重链恒定结构域3 (CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3 ；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4 (CH4)。优选地，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CHl， HR, CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域 (VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域 (CL)可以是K (kappa)或λ (lambda)。两条全长抗体链通过在CL结构域和CHl结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgGl和IgG2)，IgM, IgA, IgD,和IgE0根据本发明所述的全长抗体可以来自单一物种，例如人，或它们可以是嵌合的或人源化的抗体。根据本发明所述的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点都特异性结合于相同的抗原。因此，包含第一抗原结合位点并且由两条抗体轻链和两条抗体重链组成的单特异性二价(=全长)抗体是全长抗体。所述全长抗体的重链或轻链的C 端指在所述重链或轻链的C端的最后的氨基酸。所述全长抗体的重链或轻链的N端指在所述重链或轻链的N端的最后的氨基酸。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是二价的-使用如例如a)在WO 2009/080251，WO 2009/080252 或 WO 2009/080253 (结构域交换的抗体-见实施例 14) 中所述的形式或基于scFab-Fc融合抗体的形式，其中一个单链Fab片段特异于EGFR，而另一个单链Fab片段特异于IGF-IR(见实施例17)或c)在EP申请号07024867. 9 (TO 2009/080251)，Ridgway, J.B.，Protein Eng. 9 (1996)617-621 ；WO 96/027011 ；Merchant A.M，等，自然生物技术(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681 ；Atwel 1, S.，等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol. )270 (1997) 26-35和EP 1870459A1中所述的形式。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ ID NO 30, SEQID NO :31,SEQ ID NO :32和SEQID NO :33的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含 SEQ ID NO 34, SEQ ID NO :35，SEQ ID NO 36 和 SEQ ID NO 37 的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQID NO :38 JPSEQ ID NO :39的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ ID NO :38 JPSEQ IDNO :39的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ ID NO :40 JPSEQ ID NO :41的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ ID NO :42 JPSEQ ID NO :43的氨基酸序列或其变体。这些氨基酸序列基于作为结合EGFR的第一抗原结合位点的SEQ ID NO 8的重链可变结构域，和SEQ ID NO 10的轻链可变结构域(来自人源化的 <EGFR>ICR62)，并且基于作为结合IGF-IR的第二抗原结合位点的SEQID NO :23的重链可变结构域，和SEQ ID NO 25的轻链可变结构域(来自人抗-IGF-1R抗体<IGF_1R>HUMAB克隆 18(DSM ACC 2587))。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的，使用例如基于特异性结合两种受体EGFR或IGF-IR之一的全长抗体的形式，仅在一条重链的一个C端scFab片段融合在所述全长抗体上，所述scFab片段特异性结合于两种受体EGFR或IGF-IR的另一种上，包括凸起-进入-孔洞技术(knobs-into holes technology)，如在EP申请号09004909. 9中所述，或例如基于特异性结合两种受体EGFR或IGF-IR之一的全长抗体的形式，在一条重链的一个C端，所述全长抗体融合VH或VH-CHl片段，并且在第二重链的另一个C端融合 VL或VL-CL片段，所述VL或VL-CL片段特异性结合两种受体EGFR或IGF-IR的另一种，包括凸起-进入-孔洞技术，如在EP申请号09005108. 7中所述。对于凸起-进入-孔洞技术及其变化还见 Ridgway，J. B.，Protein Eng. 9 (1996) 617-621 ；WO 96/027011，Merchant A.M.等，自然生物技术(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681 ； Atwel 1, S.，等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol. )270 (1997) 26-35 ；和EP1870459A1。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性三价抗体特征在于包含SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性三价抗体特征在于包含SEQ ID NO 47, SEQ ID NO :48 JPSEQ ID NO :49的氨基酸序列或其变体。这些氨基酸序列基于作为结合EGFR的第一抗原结合位点的SEQ IDNO :8的重链可变结构域，和SEQ ID NO :10的轻链可变结构域(来自人源化的<EGFR>ICR62)，并且基于作为结合IGF-IR的第二抗原结合位点的SEQ ID NO 23的重链可变结构域，和SEQ ID NO 25的轻链可变结构域(来自人抗-IGF-IR 抗体 <IGF-1R>HUMAB 克隆 18 (DSM ACC2587))。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，使用如例如在WO 2007/024715, 或TO 2007/1092 或EP申请号09004909.9中所述的形式(结合第一抗原的全长抗体，结合其它抗原的两种scFab片段融合在所述全长抗体上)(见，例如实施例1或9)在一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，并且由下列各项组成a)单特异性二价抗体，其包含所述第一抗原结合位点并且由每条链仅包含一个可变结构域的两条抗体轻链和两条抗体重链组成，b)两个肽接头，和c)包含所述第二抗原结合位点的两种单价单特异性单链抗体(单特异性单价单链Fv)，其分别由轻链可变结构域，重链可变结构域和在所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域之间的单链接头组成；其中所述单链抗体(所述单链Fv)连接于单特异性二价抗体轻链或抗体重链的相同末端。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，并且由下列各项组成a)单特异性二价抗体，其包含所述第二抗原结合位点并且由每条链仅包含一个可变结构域的两条抗体轻链和两条抗体重链组成，b)两个肽接头，和c)包含所述第一抗原结合位点的两种单价单特异性单链抗体(单特异性单价单链Fv)，其分别由轻链可变结构域，重链可变结构域和在所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域之间的单链接头组成；其中所述单链抗体(所述单链Fv)连接于单特异性二价抗体轻链或抗体重链的相同末端。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，并且由下列各项组成a)全长抗体，其包含所述抗原结合位点并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；和b)包含所述第二抗原结合位点的两个相同的单链Fab片段，其中在b)下的所述单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C端或N 端的肽连接体融合于在a)下的所述全长抗体。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，并且由下列各项组成a)全长抗体，其包含所述第二抗原结合位点并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；和b)包含所述第一抗原结合位点的两个相同的单链Fab片段，其中在b)下的所述单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C端或N 端的肽连接体融合于在a)下的所述全长抗体。优选地，在b)下的所述单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个重链或轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个重链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体具有下列特征-其由下列各项组成a)由两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链组成的单特异性二价母体(全长)抗体，其中每条链仅包含一个可变结构域，b)两个肽接头，c)两种单特异性单价单链抗体(单特异性单价单链Fv)，每种由抗体重链可变结构域，抗体轻链可变结构域和在所述抗体重链可变结构域和所述抗体轻链可变结构域之间的单链接头组成；
和优选地，所述单链抗体(所述单链Fv)连接于单特异性二价抗体重链的相同末端(C端和N端)，或备选地连接于单特异性二价抗体轻链的相同末端(优选地C端)，和更优选地连接于单特异性二价抗体重链的相同末端(C端和N端)。术语“肽接头”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。这些根据本发明所述的肽接头用于连接不同的抗原结合位点和/或最终包含不同的抗原结合位点的抗体片段(例如单链Fv，全长抗体，VH结构域和/或VL结构域，Fab，(Fab) 2, Fc 部分)从而在一起形成根据本发明所述的双特异性抗体。所述肽接头可以包含下列在表1 中列出的氨基酸序列中的一个或多个以及另外任意选择的氨基酸。所述肽接头是具有至少5个氨基酸长度，优选地至少10个氨基酸长度，更优选地10-50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。优选地，在b)下的所述肽接头是具有至少10个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。 在一个实施方案中，所述肽接头是(focS)n，其中G =甘氨酸，S =丝氨酸，(χ = 3和η = 3， 4，5或6)或(χ = 4和η = 2，3，4或5)，优选地χ = 4和η = 2或3，更优选地χ = 4，n = 2 ((G4S)2).还可以将另外的G=甘氨酸，例如GG，或GGG加入所述(GxS)n肽接头。术语“单链接头”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成起源的。 这些根据本发明所述的单链接头用于连接VH和VL结构域从而形成单链Fv。优选地，在c) 下的所述单链接头是具有至少15个氨基酸长度，更优选地具有至少20个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述单链接头是(fo^)n，其中G=甘氨酸，S=丝氨酸， (χ = 3和η = 4，5或6)或(χ = 4和η = 3，4或5)，优选地χ = 4，n = 4或5，更优选地χ =4, η = 4。此外，所述单链(单链Fv)抗体优选地是二硫化物稳定的。这样的单链抗体的进一步的二硫化物稳定通过在单链抗体的可变结构域之间引入二硫键实现，并且例如在WO 94/029350，Rajagopal，V.，等，Prot. Engin. 10(12) (1997) 1453-59 ；Kobayashi，H.，等，核酸药物和生物学(Nuclear Medicine &Biology) 25 (1998) 387-393 ；或khmidt，M.，等，原癌基因(Oncogene) 18(1999) 1711-1721 中进行描述。在二硫化物稳定的单链(单链Fv)抗体的一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键独立于每种单链抗体选自i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100。在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键在重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键在重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43之间。在一个实施方案中，优选在单链抗体(单链Fv)的可变结构域VH和VL之间不存在所述任选的二硫化物稳定的所述单链(单链Fv)抗体。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于-两个抗原结合位点分别由单特异性二价母体抗体的两对重链和轻链可变结构域形成，并且都结合于相同的表位，-另外的两个抗原结合位点分别由一个单链抗体的重链和轻链可变结构域形成，
-所述单链抗体分别通过肽接头连接于一条重链或一条轻链，其中每个抗体链末端仅连接于单链抗体。在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体特征在于在a)下的所述单特异性二价(全长)抗体部分结合EGFR并且在c)下的所述两种单价单特异性单链抗体结合 IGF-IR0在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体特征在于在a)下的所述单特异性二价(全长)抗体部分结合IGF-IR并且在c)下的所述两种单价单特异性单链抗体结合 EGFR0结合EGFR和IGF-IR的根据本发明所述的双特异性抗体的该第一四价实施方案的结构，其中抗原A或B之一是EGFR，而另一个是IGF-1R。所述结构基于结合抗原A的全长抗体，结合抗原B的两条(任选地二硫化物稳定的)单链Fv’ s通过肽接头连接于所述全长抗体，所述结构在图1和图2的示意图中例示。在第二个四价实施方案中，所述四价、双特异性抗体包含a)特异性结合于所述第一抗原(两种抗原EGFR或IGF-IR之一)并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体；和b)特异性结合于所述第二抗原(两种抗原EGFR或IGF-IR的另一种)的两个相同的单链Fab片段，其中在b)下的所述单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C端或N 端的肽连接体融合于在a)下的所述全长抗体。在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每条重链或轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每条重链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每条轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。“单链Fab片段”(见图11)是由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定结构域 1 (CHl)，抗体轻链可变结构域(VL)，抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头从N端到C端方向具有下列顺序之一 a) VH-CHl-接头-VL-CL，b) VL-CL-接头-VH-CHl，c) VH-CL-接头-VL-CHl或d) VL-CHl-接头-VH-CL ；和其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽，优选地32-50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段a) VH-CHl-接头-VL-CL，b) VL-CL-接头-VH-CH1，c) VH-CL-接头-VL-CH1 和 d) VL-CHl-接头-VH-CL，通过在CL结构域和CHl结构域之间的天然二硫键稳定。术语“N-端”指N端的最后氨基酸。 术语“C-端”指C端的最后的氨基酸。在优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中的所述抗体结构域和所述接头具有从N端到C端方向的下列顺序之一a) VH-CHl-接头-VL-CL，或 b)VL_CL_ 接头-VH-CH1，更优选地 VL-CL-接头-VH-CHl。在另一个优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中的所述抗体结构域和所述接头具有从N端到C端方向的下列顺序之一
a) VH-CL-接头-VL-CH1 或 b) VL-CHl-接头-VH-CL。术语“肽连接体”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，所述肽优选地是合成来源的。将根据本发明所述的这些肽连接体用于将单链Fab片段与全长抗体的C端或N端融合从而形成根据本发明所述的多特异性抗体。优选地，在b)下的所述肽连接体是具有至少5个氨基酸长度的氨基酸序列的肽， 优选地具有5-100个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，更优选地具有10-50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽连接体是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S =丝氨酸，和(χ = 3，η = 3，4，5 或 6，和 m = 0，1，2 或 3)或(χ = 4，η = 2，3，4 或 5 和m = 0，1，2或3)，优选地χ = 4和η = 2或3，更优选地χ = 4，n = 2。在一个实施方案中，所述肽连接体是(G4S)2。术语“接头”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。将根据本发明所述的这些肽用于连接a)VH-CHl与VL-CL，b)VL-CL与VH-CH1，c)VH-CL与 VL-CHl或d) VL-CHl与VH-CL从而形成下列根据本发明所述的单链Fab片段a) VH-CHl-接头-VL-CL，b) VL-CL-接头-VH-CH1，c) VH-CL-接头-VL-CH1 或 d) VL-CHl-接头-VH-CL。在所述单链Fab片段中的所述接头是具有至少30个氨基酸长度的氨基酸序列，优选地具有 32-50个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述接头是(fo^)n，其中G=甘氨酸，S =丝氨酸，(χ = 3，η = 8，9 或 10 和 m = 0，1，2 或 3)或(x = 4 和 η = 6，7 或 8 和 m =0，1，2或3)，优选地其中χ = 4, η = 6或7和m = 0，1，2或3，更优选地χ = 4，n = 7和 m = 2。在一个实施方案中，所述接头是(QS)#2。任选地在所述单链Fab片段中，除了在CL-结构域和CHl结构域之间的天然二硫键之外，还通过在下列位置之间引入二硫键来对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)进行二硫化物稳定i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100 (总是根据Kabat的EU 索引进行编号)。单链Fab片段的这些另外的二硫化物稳定通过在单链Fab片段的可变结构域VH 和VL之间引入二硫键来实现。引入非天然的二硫化物桥来稳定单链Fv的技术例如描述在 WO 94/029350, Rajagopal，V.，等，Prot. Engin. (1997) 1453-59 ；Kobayashi，H.，等；核药物和生物学(Nuclear Medicine & Biology)，卷 25，(1998) 387-393 ；或 khmidt，M.，等，原癌基因(Oncogene) (1999) 18，1711-1721中。在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链Fab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链 Fab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间(总是根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间不具有所述任选的二硫化物稳定的单链Fab片段。优选地，根据本发明所述的四价双特异性抗体的所述第二实施方案包含两个相同的单链Fab片段(优选地VL-CL-接头-VH-CH1)，所述单链Fab片段都融合于在a)下的所述全长抗体的两条重链的两个C端或融合于在a)下的所述全长抗体的两条轻链的两个C 端。这样的融合导致形成两个相同的融合肽((i)重链和单链Fab片段或ii)轻链和单链 Fab片段))，所述融合肽与i)全长抗体的轻链或重链共同表达从而提供根据本发明的双特异性抗体(见图12，13和14)。在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体特征在于在a)下的所述全长抗体部分结合于EGFR并且在b)下的所述两个单链Fab片段结合于IGF-1R。在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体特征在于在a)下的所述全长抗体部分结合于IGF-IR并且在b)下的所述两个单链Fab片段结合于EGFR。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于所述恒定区是人来源的。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgGl亚类的，或是具有突变L234A和L235A的人IgGl亚类的。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgG2亚类的。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgG3亚类的。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgG4亚类的，或具有另外的突变的IgG4亚类的。目前已经发现根据本发明所述的双特异性抗体具有改善的特征。与仅应用一个个体抗体或两个个体抗体的组合比较，或与Lu，D.，等，生物化学和生物物理研究通讯(Biochemical and Biophysical Research Communications)318(2004)507-513 ； 生物化学杂志(J. Biol. Chem. ),279(2004)2856-2865 ；和生物化学杂志(J. Biol Chem.) 280 (2005) 19665-72的双特异性抗体比较，它们显示至少相同或增加的体外和体内抗肿瘤活性/功效。与Lu，D.，等，生物化学和生物物理研究通讯(Biochemical and Biophysical Research Communications) 318 (2004) 507—513 ；生物化学杂志(J. Biol. Chem.), 279 (2004) 2856-2865 ；和生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 280 (2005) 19665-72 的双特异性抗体比较，它们显示提高的体内药物代谢动力学稳定性。另外，与仅应用一种个体抗体或两种个体抗体的组合比较，根据本发明所述的双特异性抗体显示调节的受体下调/内在化。此外，根据本发明所述的双特异性抗体可以提供益处如减少的剂量和/或施用频率和伴随的费用节省。术语“恒定区”用于本申请时指除了可变区之外的抗体的结构域的总合。恒定区不直接涉及抗原的结合，但是显示不同的效应子功能。取决于它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体被分为下述类别IgA，IgD, IgE, IgG和IgM，并且这些中的一些可以被进一步分为类别如IgGl，IgG2，IgG3，和IgG4，IgAl和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、Y和μ。可以在所有5种抗体种类中发现的轻链恒定区被称为 κ (kappa)禾口 λ (lambda)。术语“来自人来源的恒定区”在本申请中使用时，指亚类IgGl，IgG2，IgG3，或IgG4 的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区域。这样的恒定区是现有技术中公知的并且例如由Kabat, Ε. Α.，描述(见，例如Johnson, G.和ffu, Τ. T.，核酸研究(Nucleic Acids Res. )28(2000)214-218 ；Kabat, Ε. Α.，等.，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad.Sci. USA) 72 (1975) 2785-2788)。当 IgG4 亚类的抗体显示减少的 Fc 受体(FcyRIIIa)结合时，其它IgG亚类的抗体显示强烈的结合。然而，Pro238，Asp265, Asp270, AsM97 (失去 Fc 糖)，Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434,和His435是这样的残基，其如果改变的话，还提供减少的Fc受体结合 (Shields, R.，L·，等，生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 276 (2001) 6591-6604 ；Lund, J.，等， FASEB J. 9(1995) 115-119 ;Morgan，A.，等，免疫学(Immunology) 86 (1995) 319-324 ；EP 0 307 434)。在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体与IgGl抗体比较具有减少的FcR结合，并且所述单特异性二价(全长)母体抗体涉及IgG4亚类的FcR结合或具有突变， L234，L235和/或D265的IgGl或IgG2亚类的FcR结合，和/或包含PVA236突变。在一个实施方案中，在单特异性二价(全长)母体抗体中的突变是S2^P，L234A，L235A，L235E 和/或PVA236。在另一个实施方案中，在单特异性二价(全长)母体抗体中的突变在IgG4 中是S2^P，在IgGl中是L234A和L2!35A。恒定重链区在SEQ ID显示。在
一个实施方案中，单特异性二价(全长)母体抗体的恒定重链区是具有突变L234A和L235A 的SEQ ID NO :27的恒定重链区。在另一个实施方案中，单特异性二价(全长)母体抗体的恒定重链区是具有突变的SEQ ID NO 28的恒定重链区。在另一个实施方案中，单特异性二价(全长)母体抗体的恒定轻链区是SEQ ID NO :29的恒定轻链区。抗体的恒定区直接涉及ADCC(抗体依赖性细胞毒作用)和CDC(补体依赖的细胞毒性)。补体激活(CDC)由补体因子Clq与大多数IgG抗体亚类的恒定区结合而起始。Clq与抗体的结合由在所谓的结合位点的定义的蛋白-蛋白相互作用所导致。这样的恒定区结合位点在现有技术中是已知的，并且例如由Lukas，T.J.，等，免疫学杂志(J. Immunol.) 127 (1981) 2555-2560 ；Brunhouse, R.，和 Cebra, J. J.，分子免疫学 (Mol. Immunol.) 16(1979)907-917 ；Burton, D. R.,等，自然(Nature)288(1980)338-344 ； Thommesen, J. Ε.,等，分子免疫学(Mol. Immunol.) 37 (2000) 995-1004 ；Idusogie, Ε. E.， 等，免疫学杂志(J. Immunol.) 164(2000)4178-4184 ；Hezareh, Μ.，等，病毒学杂志 (J. Virol. )75(2001) 12161-12168 ；Morgan, Α.，等，免疫学(Immunology) 86 (1995) 319-324 ； 和EP 0 307 434所描述。所述恒定区结合位点例如特征在于氨基酸L234，L235，D270， N297, E318, K320, K322, P331，和 P329 (根据 Kabat 的 EU 索引编号)。术语“抗体依赖性细胞毒作用(ADCC) ”指在存在效应细胞时，由根据本发明的抗体裂解人靶细胞。ADCC优选地通过用根据本发明的抗体在存在效应细胞时处理表达IGF-IR 和EGFR的细胞的制备物进行测量，所述效应细胞如新鲜分离的PBMC或来自暗黄覆盖层的纯化的效应细胞，如单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系。术语“补体依赖的细胞毒性(⑶C) ”指由补体因子Clq与大多数IgG抗体亚类的 Fc部分结合而起始的过程。Clq与抗体的结合由在所述结合位点的限定的蛋白-蛋白相互作用所导致。这些Fc部分结合位点是现有技术已知的(见上)。这些!^c部分结合位点例如特征在于氨基酸 L234，L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331，和 (根据 Kabat 的 EU索引编号)。亚类IgGl，IgG2，和IgG3的抗体通常显示包括Clq和C3结合的补体激活， 而IgG4不激活补体系统并且不结合Clq和/或C3。单克隆抗体的细胞介导的效应子功能可以通过改造它们的寡糖成分而得以增强，如在 Umana, P.，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.) 17(1999) 176-180，和US 6，602，684中所述。IgGl型抗体是最常用的治疗性抗体，其是在每个CH2结构域的Asn297具有保守的N-连接的糖基化位点的糖蛋白。与Asn297附着的两个复合双触角寡糖隐藏在CH2结构域之间，形成了与多肽主链的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能诸如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)是必要的(Lifely, M. R.,等，糖生物学(Glycobiology) 5 (1995) :813-822 Jefferis, R., 等，免疫学综述(Immunol Rev). 163(1998) :59-76 ；Wright, Α.和 Morrison，S. L.， 生物技术趋势(Trends Biotechnol.) 15 (1997) :26-32)。Umana，P.，等自然生物技术(Nature Biotechnol. ) 17(1999) 176-180 和 WO 99/54342 显示，β (1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶ΠΙ( “&1ΤΙΙΙ”)，一种催化分叉(bisected)寡糖形成的糖基转移酶，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过量表达，显著增加了抗体的体外ADCC活性。在Asn297糖的组成上的改变或其消除也影响Fc γ R和Clq的结合(Umana， ρ·，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.) 17 (1999) 176-180 ；Davies, J.,等， 生物技术生物工程(Biotechnol. Bioeng.) 74 (2001) 288-294 ；Mimura, Y.，等，生物化学杂志(J. Biol. Chem. )276^001) 45539-45M7 ;Radaev，S.，等，生物化学杂志(J. Biol. Chem. )276^001) 16478-16483 ;Shields，R. L.，等，生物化学杂志 (J. Biol. Chem.) 276 (2001) 6591-6604 ；Shields, R. L.，等，生物化学杂志(J.Biol. Chem.) 277 (2002) 26733-26740 ；Simmons, L. C.，等，免疫学方法杂志(J. Immunol. Methods)263(2002)133-147)。增强单克隆抗体的细胞介导的效应子功能的方法例如在WO 2005/044859, WO 2004/065540, W02007/031875, Umana, P.，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.) 17 176-180(1999), WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267， US 2006/0134709， US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/0358 和 WO 2000/061739 中进行报道，或例如在 Niwa，R.，等，免疫方法杂志(J. Immunol. Methods) 306 (2005) 151-160 ；Shinkawa, Τ.，等， 生物化学杂志(J Biol Chem), 278 (2003) 3466-3473 ；WO 03/055993 和 US2005/0249722 中进行报道。因此，在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体是糖基化的(如果其包含IgGl， IgG2，IgG3或IgG4亚类的Fc部分，优选地IgGl或IgG3亚类的Fc部分)，在Asn297具有糖链，其中在所述糖链中的岩藻糖的量是65%以下(根据Kabat的编号)。在另一个实施方案中，岩藻糖在所述糖链中的量在5% -65%，优选地20%-40%o根据本发明所述的“Asn297” 意为在Fc区域的约位置297定位的氨基酸天冬酰胺。基于抗体的微小序列变化，Asn297也可以在定位在位置297上游或下游的一些氨基酸上(通常不超过士 3个氨基酸)，即在位置四4-300之间。在一个实施方案中，根据本发明所述的糖基化的抗体IgG亚类是人IgGl亚类的，具有突变L234A和L235A的人IgGl亚类，或IgG3亚类的。在另一个实施方案中，在所述糖链中N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)的量是以下和/或N端α-1，3-半乳糖的量是
以下。糖链优选地显示与在CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297连接的N-连接的聚糖的特征。术语“糖链显示与在CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297附着的N-连接的聚糖的特征”指在根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区的Asn297的糖链具有与在未修饰的CHO细胞中表达的相同抗体，例如如在WO 2006/103100中报道的那些抗体相同的结构和糖
残基序列，除了岩藻糖残基之外。术语“NGNA”用于本申请时指糖残基N-羟乙酰神经氨酸。人IgGl或IgG3在Asn297发生糖基化，如核心岩藻糖基化的双触角复合寡糖糖基化，末端为多至两个Gal残基。IgGl或IgG3亚类的人恒定重链区由Kabat，Ε. Α.，等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版·公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health), Bethesda, MD. (1991)，禾口由 Bruggemann, Μ.，等，J. Exp. Med. 166(1987) 1351-1361 ；Love, Τ. W.，等，酶学方法(Methods Enzymol. ) 178 (1989) 515-527中详细报道。根据末端Gal残基的量，将这些结构称为G0，Gl (α -1，6-或α _1，3_)，或G2聚糖残基(Raju，T. S.，Bioprocess Int. 1 (2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier，F. H.，糖缀合物杂志 (Glycoconjugate J). 14 (1997) 201-207描述。在未进行糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常在Asn297进行岩藻糖基化，量为至少85%。根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区的修饰的寡糖可以是杂合的或复合的。优选地，所述分叉，还原/未岩藻糖基化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，所述分叉、还原/未岩藻糖基化的寡糖是复合的。根据本发明，“岩藻糖的量”意为与在Asn297附着的所有糖结构的总和(例如， 复合、杂合和高甘露糖结构)相比的在Asn297的糖链中所述糖的量，所述糖的量通过 MALDI-T0F质谱测量并且计算为平均值。岩藻糖的相对量是包含岩藻糖的结构相对于在 N-糖苷酶F处理的样品中由MALDI-T0F鉴定的所有糖结构(例如，复合、杂合和低聚和高甘露糖结构，分别的)的百分比。对于所有的根据本发明所述的双特异性抗体，“GE”意为糖改造的。在本发明的一个其它方面中，根据本发明的双特异性抗体是具有ADCC和/或CDC 的抗体，并具有来自人来源的IgGl或IgG3(优选地IgGl)亚类的恒定区，其结合Fcy受体和/或补体因子Clq。结合Fc受体和/或补体因子Clq的这样的抗体确实激发抗体依赖性的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。根据本发明所述的抗体由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码根据本发明所述的抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码根据本发明所述的抗体的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的并且包含在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以及随后的抗体分离和通常纯化为药用纯度。对于将前述抗体在宿主细胞中的表达，将编码各个修饰的轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如CHO细胞，NSO细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，PER. C6细胞，酵母， 或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(裂解后的上清液或细胞)中回收。 用于重组生产抗体的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在Makrides，S. C.，Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ；Geisse, S.，等，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ； Kaufman, R. J.，分子生物技术(Mol. Biotechnol.) 16(2000) 151-160 ；Werner, R. G.，Drug Res. 48(1998)870-880的综述文章中描述。双特异性抗体适当地从培养基中通过常规免疫球蛋白纯化方法分离，所述纯化方法如，例如蛋白A-琼脂糖，羟基磷灰石层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析法。编码所述单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，所述表达载体接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如HEK 293细胞，CHO细胞，或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。双特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适合的核苷酸变化引入抗体 DNA中，或通过核苷酸合成进行制备。然而，这样的修饰可以仅在例如如上述的非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述提及的抗体特征如IgG同种型和抗原结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或有利于纯化。根据本发明所述的结合EGFR和IGF-IR的双特异性抗体下调EGFR。在A549细胞中，在一个实施方案中，EGFR的下调是至少约30 %，在另一个实施方案中，下调是至少约 35%，和在另一个实施方案中，下调是至少约40%。根据本发明所述的结合EGFR和IGF-IR的双特异性抗体下调IGF-1R。在H322M细胞中，在一个实施方案中，双特异性Cross-Mab (VH/VL)或Cross-Mab (CH/CL)下调IGF-IR 至多约15%，在另一个实施方案中，下调至多约20%，和在另一个实施方案中，下调至多 40% (75 μ g 蛋白 /mL)。术语“宿主细胞”用于本申请时是指可以被改造从而产生根据本发明所述的抗体的细胞系统的任何种类。在一个实施方案中，将HEK293细胞和CHO细胞用作宿主细胞。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物，，可交替使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移数。还理解所有的后代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。 包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异后代。在NSO细胞中的表达记述在，例如，Barnes, L. Μ.，等.，细胞技术学 (Cytotechnology) 32 (2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ.，等.，生物技术和生物工程(Biotech. Bioeng. )73(2001)261-270 中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.，等·，核酸研究(Nuc 1. Acids. Res. )30E9 (2002)中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.，等.，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.，等.，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 89 (1992) 4285-4289 ；和 Norderhaug，L.，等.，免疫学方法杂志(J. Immunol. Method) 204 (1997) 77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记述在 Schlaeger, E. -J.，和 Christensen, K.，在细胞技术学(Cytotechnology) 30 (1999) 71-83 中和 khlaeger，Ε. -J.，在免疫学方法杂志(J. Immunol. Methods) 194 (1996) 191-199 中。适合用于原核生物的控制序列，例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读框中。 然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。具有减少量的岩藻糖的根据本发明所述的抗体可以在被改造以表达编码具有GnTIII活性的多肽和具有ManII活性的多肽的至少一种核酸的糖修饰的宿主细胞中表达， 所述表达以根据本发明使Fc区域中的寡糖岩藻糖基化的量进行。在一个实施方案中，具有 &1TIII活性的多肽是融合多肽。备选地，宿主细胞的α 1，6_岩藻糖基转移酶活性可以根据US 6，946，292减少或消除从而产生糖修饰的宿主细胞。抗体岩藻糖基化的量可以例如通过发酵条件或通过至少两种抗体与不同岩糖基化的量组合来进行预先确定。具有减少量的岩藻糖的根据本发明所述的抗体可以在宿主细胞中，通过包括下列步骤的方法产生(a)在容许所述抗体产生，并容许以根据本发明的量对存在于所述抗体的Fc区域上的寡糖进行岩藻糖基化的条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞被改造从而表达编码具有&1TIII活性和/或ManII活性的融合多肽的至少一种多核苷酸；和(b)分离所述抗体。在一个实施方案中，具有&1TIII活性的多肽是融合多肽，优选含有&1TIII 的催化结构域和异源高尔基体定居(resident)多肽的高尔基体定位结构域，所述定位结构域选自由下列组成的组甘露糖苷酶II的定位结构域，β (1，2)-N-乙酰葡糖胺转移酶 K "GnTI")的定位结构域，甘露糖苷酶I的定位结构域，β (1，2)-Ν-乙酰葡糖胺转移酶 IK "GnTII")的定位结构域，和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选地，该高尔基体定位结构域来自甘露糖苷酶II或&ιΤΙ。用于本文时，“具有&1ΤΙΙΙ活性的多肽”指这样的多肽，所述多肽能够催化以 β-1-4连接将N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基添加到N-联寡糖中的三甘露糖基核心的β 连接的甘露糖苷上。这包括融合多肽，所述多肽显示类似于但不必须相同于β (1，4)-Ν-乙酰葡糖胺转移酶III的活性的酶活性，如在具体的生物测定中所测量的，具有或不具有剂量依赖性，按照国际生化和分子生物学命名委员会(NC-IUBMB)，其也被称为β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰基葡糖胺基-转移酶(EC 2.4. 1. 144)。在其中确实存在剂量依赖性的情形中，其不需要与&1TIII的剂量依赖性相同，但是与&1TIII活性相比，基本类似于在给定活性中的剂量依赖(即，相对于&1TIII，候选多肽将显示更大的活性或不超过约 25倍更少，并且优选地，不超过约10倍更少的活性，并且最优选地，不超过约三倍更少的活性)。用于本文时，术语“高尔基体定位结构域”指负责将多肽锚定在高尔基复合体的位置中的高尔基体定居多肽的氨基酸序列。通常，定位结构域包括酶的氨基末端“尾”。对于生产具有减少量的岩藻糖的根据本发明所述的抗体，同样地也可以使用能够并被改造以容许产生具有修饰的糖形的抗体的宿主细胞。可以进一步操作所述宿主细胞从而表达增加水平的具有&1TIII活性的一种或多种多肽。优选将CHO细胞作为这样的宿主细胞。同样地，产生具有增加的ADCC的抗体组合物的细胞在US 6，946，292中报道。通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl分级(CsCl banding)，柱层析法，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白。见Ausubel，F.，等，编辑，现代分子生物学中的方 法(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing 禾口 Wiley Interscience, New York(1987) 0不同的方法是充分建立的并且广泛用于蛋白纯化，如用微生物蛋白进行的亲和层析法(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析法)，离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)，亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析法(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂，或间氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析法(例如用Ni (II)-和Cu(II)-亲和性材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.，A.，应用生物化学生物技术(Appl. Biochem. Biotech).75(1998)93-102)。本发明的一个方面是包含根据本发明所述的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是将根据本发明所述的抗体用于制备药物组合物的应用。本发明的另一个方面是用于制备包含根据本发明所述的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面中，本发明提供包含与药用载体一起配制的根据本发明所述的抗体的组合物，例如药物组合物。令人惊奇地发现当与单特异性母体抗-EGFR抗体和抗-IGF-1R抗体比较， 或与自Lu，D.，等，生物化学和生物物理研究通讯(Biochemical and Biophysical Research Communications)318 (2004)507-513 ；生物化学杂志(J. Biol. Chem.), 279(2004)2856-2865 ；和生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 280 (2005) 19665-72 已知的针对 EGFR和针对IGF-IR的双特异性抗体比较(如这些双特异性抗体与各个母体抗体的组合比较仅显示在表达EGFR/IGF-1R的肿瘤细胞中的减少的功效)，根据本发明的针对EGFR和针对IGF-IR的双特异性抗体具有针对癌细胞的提高的抗增殖性质。本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。本发明的另一个方面是根据本发明所述的抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。本发明的另一个方面是通过向需要所述治疗的患者施用根据本发明所述的抗体治疗遭受癌症的患者的方法。用于本文时，“药物载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗试剂和吸附延缓试剂等。优选地，所述载体适合用于静脉内、肌内、 皮下、肠胃外、脊或表皮施用(例如通过注射或输注)。本发明的组合物可以通过多种本领域已知的方法施用。如技术人员清楚地，施用的路径和/或方式将根据需要的结果变化。为了通过某些施用路径施用本发明的化合物， 可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物与防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在适合的载体中施用于受试者，所述载体例如是脂质体或稀释剂。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质是本领域已知的。术语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”用于本文时意为除了肠和局部施用之外的施用方式，通常通过注射施用，并且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊内、硬膜外和胸骨内注射和输注。术语癌症用于本文时指增生性疾病，如淋巴瘤(lymphomas)，淋巴细胞性白血病 (lymphocytic leukemias),月市癌(lung cancer),非小细胞肺(NSCL)癌(non small cell lung (NSCL) cancer),支气管月市泡细胞月市癌(bronchio loalvio Iar cell lung cancer),骨癌(bone cancer),姨腺癌(pancreatic cancer),皮肤癌(skin cancer),头或颈癌(cancer of the head or neck)，夫 $ 目艮内 11 ;) (cutaneous or intraocular melanoma)，〒宫癌(uterine cancer),卵巢癌(ovarian cancer),直肠癌(rectal cancer),月工区癌(cancer of the anal region)，胃· (stomach cancer), (gastric cancer),(coloncancer),乳腺癌(breast cancer),子宫癌(uterine cancer),输卵管癌(carcinoma of the fallopian tubes),子宫内膜癌(carcinoma of the endometrium),子宫颈癌 (carcinoma of the cervix)，阴道癌(carcinoma of the vagina),夕卜阴癌(carcinoma ofthe vulva)，霍奇金病(Hodgkin' s Disease)，食管癌(cancer of the esophagus), 小肠癌(cancer of the small intestine),内分泌系统癌(cancer of the endocrine system)，甲状腺癌(cancer of the thyroid gland)，甲状旁腺癌(cancer of the parathyroid gland)，l^f Jl—(cancer of the adrenal gland), ^kM^Rf^j^ (sarcoma of soft tissue),尿道癌(cancer of the urethra)，阴莲癌(cancer of the penis),前列腺癌(prostate cancer),膀胱癌(cancer of thebladder),肾癌或输尿管癌(cancer of the kidney or ureter),肾细胞癌(renal cell carcinoma),肾盂癌(carcinoma of the renal pelvis),间皮瘤(mesothelioma),肝细胞癌(hepatocellular cancer),胆管癌(biliary cancer),中枢神经系统(CNS)月中瘤(neoplasms of the central nervous system(CNS)), 脊椎轴肿瘤(spinal axis tumors)，脑干胶质瘤(brain stem glioma)，多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme),星形细胞瘤(astrocytomas),神经鞘瘤(schwanomas), 室管膜瘤(印endymonas)，成髓细胞瘤(medulloblastomas)，脑膜瘤(meningiomas)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas),垂体腺瘤(pituitary adenoma),禾口埃文斯肉瘤 (Ewing' s sarcoma)，包括上述癌症任一的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。这些组合物还可以包含佐剂如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止微生物的存在可以通过灭菌方法，见上文和通过包含各种抗细菌和抗真菌药剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。可能需要在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延缓吸附的试剂如单硬脂酸铝和明胶来导致可注射药物形式的延长的吸附。不管所选择的施用路径为何，可以以适合的水合形式使用的本发明的化合物，和/ 或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方式配制到药用剂型中。在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化从而获得这样的活性成分的量，其对于特定的患者、组合物和施用方式有效获得需要的治疗反应，而不会对于患者具有毒性。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素包括所用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的延续时间、 与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗病史，以及医疗领域已知的类似因素。所述组合物必需是无菌和可流动的，到所述组合物可通过注射器递送的程度。除了水之外，所述载体优选地是等渗缓冲的盐水溶液。适当的流动性可以例如通过使用涂层如磷脂酰胆碱，在分散体的情形中通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持。在许多情形中，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇，和氯化钠。用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。在意指不同名称时，通过上下文其将是清楚的。术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将无难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham，F. L.和van der Eb. A.J·，Virology (病毒学)52(1973)456-467所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其他将DNA引入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是利用氯化钙的钙处理，如Cohen， S. N，等，PNAS (美国科学院院报)· 69 (1972) 2110-2114所述。用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽共同称为基因产物。 如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。“载体”是核酸分子，特别是自体复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。“表达载体”是多核苷酸，其在引入到合适的宿主细胞中时能够被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体可以起作用产生所需的表达产物。氨基酸序列描述SEQIDNO1 1■链 CDR3，人源化的 <EGFR>ICR62
SEQIDNO2 1■链 CDR2，人源化的 <EGFR>ICR62
SEQIDNO3 1■链 CDRl，人源化的 <EGFR>ICR62
SEQIDNO4轻链CDR3，人源化的<EGFR>ICR62
SEQIDNO5轻链CDR2，人源化的<EGFR>ICR62
SEQIDNO6轻链CDRl，人源化的<EGFR>ICR62
SEQIDNO7 1■链可变结构域，人源化的<EGFR>ICR62-I-HHB
SEQIDNO8 1■链可变结构域，人源化的<EGFR>ICR62-I-HHD
SEQIDNO9轻链可变结构域，人源化的<EGFR>ICR62-I-KA
SEQIDNO10轻链可变结构域，人源化的<EGFR>ICR62--I-KC
SEQIDNO:11重链CDR3，<IGF-1R>HUMAB-克隆18
SEQIDNO12重链CDR2，<IGF-1R>HUMAB-克隆18
SEQIDNO13重链CDRl，<IGF-1R>HUMAB-克隆18
SEQIDNO14轻链CDR3，<IGF-1R>HUMAB-克隆18
SEQIDNO15轻链CDR2，<IGF-1R>HUMAB-克隆18
SEQIDNO16轻链CDRl，<IGF-1R>HUMAB-克隆18
SEQIDNO17重链CDR3，<IGF-1R>HUMAB-克隆22
SEQIDNO18重链CDR2，<IGF-1R>HUMAB-克隆22
SEQIDNO19重链CDRl，<IGF-1R>HUMAB-克隆22
SEQIDNO20轻链CDR3，<IGF-1R>HUMAB-克隆22
SEQIDNO:21轻链CDR2，<IGF-1R>HUMAB-克隆22
SEQ ID NO 22 轻链 CDRl，<IGF_1R>HUMAB-克隆 22SEQ ID NO 23 重链可变结构域，<IGF_1R>HUMAB-克隆 18SEQ ID NO 24 重链可变结构域，<IGF_1R>HUMAB-克隆 22SEQ ID NO 25 轻链可变结构域，<IGF_1R>HUMAB-克隆 18SEQ ID NO 26 轻链可变结构域，<IGF_1R>HUMAB-克隆 22SEQ ID NO :27来自IgGl的人重链恒定区SEQ ID NO :28来自IgG4的人重链恒定区SEQ ID NO ^kappa 轻链恒定区
ID NO 30双特异 /VL)的重链1 ID NO 31双特异 /VL)的重链2 ID NO 32双特异 /VL)的轻链1 ID NO 33双特异 /VL)的轻链2 ID NO 34双特异 /CL)的重链1 ID NO 35双特异 /CL)的重链2 ID NO 36双特异 /CL)的轻链1 ID NO 37双特异 /CL)的轻链2SEQ
Cross-Mab(VHSEQ Cross-Mab(VHSEQ Cross-Mab(VHSEQ Cross-Mab(VHSEQ Cross-Mab(CHSEQ Cross-Mab(CHSEQ Cross-Mab(CHSEQ Cross-Mab(CHSEQ ID NO 38 双特异性的重链1SEQ ID NO 39 双特异性
的重链2SEQ ID NO 40 双特异 N-scFabSS-盐桥-s3的重链1SEQ ID NO :41 双特异 N-scFabSS-盐桥-s3的重链2SEQ ID NO 42 双特异 N-scFabSS-盐桥-w3C的重链1SEQ ID NO 43 双特异 N-scFabSS-盐桥-w3C的重链2SEQ ID NO 44 双特异 KiH-C-scFab-Ι 的重链 1SEQ ID NO 45 双特异
性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子
性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子
性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子
性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子
性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子
性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子
性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子
性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子
、二价 scFab-Fc 融合 <EGFR_IGF1R> 抗体分子scFab_Fc
、二价 scFab-Fc 融合 <EGFR_IGF1R> 抗体分子scFab_Fc
性、二价scFab-Fc融合〈EGFR-IGF 1R>抗体分子
性、二价scFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子
性、二价scFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子
性、二价scFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子
性、三价scFab-IgG融合<EGFR-IGF1R>抗体分子
性、三价scFab-IgG融合<EGFR-IGF1R>抗体分子KiH-C-scFab-Ι 的重链 2SEQ ID NO 46 双特异性、三价 scFab-IgG 融合 <EGFR_IGF1R> 抗体分子 KiH-C-scFab-Ι 的轻链SEQ ID NO 47 双特异性、三价 scFab-IgG 融合 <EGFR_IGF1R> 抗体分子 KiH-C-scFab-2 的重链 1SEQ ID NO 48 双特异性、三价 scFab-IgG 融合 <EGFR_IGF1R> 抗体分子 KiH-C-scFab-2 的重链 2SEQ ID NO 49 双特异性、三价 scFab-IgG 融合 <EGFR_IGF1R> 抗体分子 KiH-C-scFab-2 的轻链提供以下实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中给出。要理解在不偏离本发明精神的条件下可以对所述程序作出改动。附图简述图1.结合EGFR和IGF-1R的根据本发明所述的双特异性抗体的一个四价实施方案的示意性结构，其中抗原A或B之一是EGFR，而另一个是IGF-1R。所述结构基于结合抗原A的全长抗体，结合抗原B的两个(任选地二硫化物稳定的)单链Fv’ s通过肽-接头连接于所述全长抗体。图2.结合EGFR和IGF-1R的根据本发明所述的双特异性抗体的四个可能的四价实施方案A-D的示意性结构，其中抗原A或B之一是EGFR，而另一个是IGF-1R。所述结构基于结合抗原A的全长抗体，结合抗原B的两个(任选地二硫化物稳定的)单链Fv’ s通过位于下列位置的肽-接头连接于所述全长抗体A 全长抗体重链的C端B 全长抗体重链的N端C:全长抗体轻链的C端D 全长抗体轻链的C端图3. 3a 纯化的双特异性抗体XGFR1-2421的SDS-PAGE3b 纯化的双特异性抗体XGFR1-M21 (3mg, /ml)的HP-大小排阻层析法(SEC)分析3c 纯化的双特异性抗体XGFR1-M21 (lmg, /ml)的HP-大小排阻层析(SEC)分析图4. 4a 双特异性抗体XGFR1-2320 (无二硫化物稳定)的HP-大小排阻层析(SEC) 纯化(8. 7%团聚体)4b 双特异性抗体XGFR1-2321 ( 二硫化物稳定的)的HP-大小排阻层析(SEC)纯化(0%团聚体)图5.在用固定的XGFR1-2320进行的Biacore测定法中双特异性抗-EGFR/ 抗-IGF-IR抗体(XGFR1-2320)与EGFR和IGFlR的同时结合图6.由双特异性抗体下调在A549 NSCLC肿瘤细胞系中的IGFR(6a)和EGFR(6b)图7.双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体分子(XGFR)在H322M NSCLC肿瘤细胞系中抑制IGF-IR磷酸化(7a)和EGFR磷酸化(7b)7a 在用各种双特异性抗体XGFR分子和它们的母体抗体在H322MNSCLC肿瘤细胞中抑制后的Phospho-EGF-R-ELISA，抗体浓度与温育有关，在用IGF1/EGF抗体刺激的情形中，浓度被稀释到起始浓度的一半7b 在用各种双特异性抗体XGFR分子和它们的母体抗体在H322MNSCLC肿瘤细胞中抑制后的Phospho-EGF-R-ELISA，抗体浓度与温育有关，在用IGF1/EGF抗体刺激的情形中，抗体浓度被稀释到起始浓度的一半图8.双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体分子(XGFR)和它们的母体抗体对表达 EGFR-和IGF-IR的H322M NSCLC肿瘤细胞的抗肿瘤生长抑制图9.双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体分子(XGFR)的体外ADCC活性图10.特异性结合EGFR或IGFl-R的无CH4结构域的全长抗体的示意性结构，其具有两对重链和轻链，以典型的顺序包含可变结构域和恒定结构域。图11.特异性结合例如EGFR或IGFl-R的四个可能的单链Fab片段的示意性结构图12.根据本发明所述的四价、双特异性抗体的示意性结构，其包含特异性结合两种抗原EGFR或IGFl-R之一的全长抗体和特异性结合两种抗原EGFR或IGFl-R的另一个的两个单链Fabs (scFab-XGFR分子)图13.包含特异性结合IGF-IR的全长抗体和特异性结合EGFR的两个相同的单链 Fabs的根据本发明所述的双特异性抗体-ScFab-XGFRl分子A，B，C，和D以及在纯化后的表达水平A 与重链的C端融合的scFab (VH-CH1-接头-VL-CL)B 与重链的C端融合的scFab (VH-CHl-接头-VL-CL，融合另外的VH44-VL100 二硫化物桥)C 与轻链的C端融合的scFab (VH-CHl-接头-VL-CL)D 与轻链的C端融合的scFab (VH-CH1-接头-VL-CL，融合另外的VH44-VL100 二硫化物桥)图14.包含特异性结合EGFR的全长抗体和特异性结合IGF-1R的两个相同的单链 Fabs的根据本发明所述的双特异性抗体-ScFab-XGFR2分子A，B, C，和DA 与重链的C端融合的scFab (VH-CH1-接头-VL-CL)B 与重链的C端融合的scFab (VH-CH1-接头-VL-CL，融合另外的VH44-VL100 二硫化物桥)C 与轻链的C端融合的scFab (VH-CHl-接头-VL-CL)D 与轻链的C端融合的scFab (VH-CH1-接头-VL-CL，融合另外的VH44-VL100 二硫化物桥)图15.包含单链Fab的双特异性抗体衍生物scFab_XGFRl的SDS-PAGE分析1 :scFab-XGFRl_4720 (未还原)2 scFab_XGFRl_4721 (未还原)
3 scFab-XGFRl_4720 (还原)4 scFab-XGFRl_4721 (还原)图16.包含scFab的双特异性抗体衍生物scFab-XGFRl的HP-SEC分析图 16a :scFab-XGFRl_4720 ；7. 7%，团聚体(用盒标记)图 16b :scFab-XGFRl-4721 ；3. 5%，团聚体(用盒标记)图 17. scFab-XGFRl 和 scFab_XGFR2 与 EGFR 和 IGFlR 的结合
图 17a =Biacore 图-scFab_XGFR_12720 与 EGFR 的结合，KD = 2nM图 17b =Biacore 图-scFab_XGFRl_2720 与 IGF-1R 的结合，KD = 2nM图 17c =Biacore 图-scFab_XGFR2_2720 与 EGFR 的结合，KD = 0. 5nM图 17d =Biacore 图-scFab_XGFR2_2720 与 IGF-IR 的结合，KD = IlnM图18.示意图-用FACS竞争测定法分析的scFab-XGFR与细胞的结合，使用下列一般方法-平行加入用Alexa647(lyg/mL)标记的<IGFlR>Mab+未标记的 scFab-XGFR(100 μ g/mL-0, 001 μ g/mL)-在冰上温育45分钟，洗涤并去除未结合的抗体-用1% HCHO固定，接着进行FACS图19.通过FACS竞争测定法分析的scFab_XGFR_2721和母体<IGF1R>克隆18与细胞的结合图 19a 比较 <IGF-1R> 克隆 18(0，18 μ g/ml)和 scFab_XGFR_2721 (0，15μ g/ml)的 IC50 值图19b :<IGF_1R>克隆18的结合曲线(转折点0，11 μ g/ml)-y-轴=RLU ;χ-轴抗体浓度μ g/ml)图19c :scFab-XGFR_2721 的结合曲线(转折点 0，10 μ g/ml)-y-轴=RLU ；χ-轴抗体浓度(μ g/ml)图20.用不同的双特异性抗-EGFR 育M小时后在H322M细胞上下调IGFl-R图21.用不同的双特异性抗-EGFR 育M小时后在H322M细胞上下调EGFR图22.用不同的双特异性抗-EGFR 制H322M-细胞的增殖实验程序
实施例设计双特异性<EGFR-IGF_1R>抗体根据本发明所述的结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体包含结合于EGFR的第一抗原结合位点和结合于IGF-IR的第二抗原结合位点。可以使用SEQ ID NO :7或SEQ ID NO: 8的重链可变结构域，和SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 10的轻链可变结构域作为结合EGFR的第一抗原结合位点，所述重链可变结构域和轻链可变结构域都来自人源化的大鼠抗-EGFR 抗体ICR62，其在WO 2006/082515中详细描述。可以使用SEQ ID NO 23或SEQ ID NO :24的重链可变结构域，和SEQ ID NO 25 或SEQ ID NO :26的轻链可变结构域作为结合IGF-IR的第二抗原结合位点，所述重链可变结构域和轻链可变结构域都来自人抗-16 -11 抗体<16 -11 >而獻8克隆18(0311 ACC 2587) 或 <IGF-1R>HUMAB 克隆 22 (DSMACC 2594)，其详细描述在 WO 2005/005635 中。在下面所有的实施例1-20中，双特异性<EGFR-IGF_1R>抗体基于作为结合EGFR 的第一抗原结合位点的SEQ ID NO :8的重链可变结构域，和SEQ ID NO 10的轻链可变结
/ 抗-IGF-IR 抗体分子(scFab-XGFR ； IOOnM)温 / 抗-IGF-IR 抗体分子(scFab-XGFR ； IOOnM)温 / 抗-IGF-IR 抗体分子(scFab-XGFR ； IOOnM)抑构域(来自人源化的<EGFR>ICR62)，并且基于作为结合IGF-IR的第二抗原结合位点的SEQ ID NO 23的重链可变结构域，和SEQ ID NO 25的轻链可变结构域(来自人抗-IGF-IR抗体 <IGF-1R>HUMAB 克隆 18 (DSMACC 2587))。A)设计具有 scFv 连接物(attachment)的双特异性 <EGFR-IGF_1R> 抗体(XGFR1 和XGFR2命名法，指scFv-XGFR分子)为了产生组合两种抗体特征的试剂，构建各种新的四价双特异性抗体来源的蛋白实体。在这些分子中，一种抗体的重组单链结合分子通过重组蛋白融合技术连接于另一种抗体，其保留全长IgGl的形式。该第二抗体具有需要的第二结合特异性。基于人抗-IGF-IR抗体 <IGF_1R>HUMAB 克隆 18 (DSM ACC 2587)和衍生自 SEQ ID NO 8的重链可变结构域(VH)和SEQ ID NO 10的轻链可变结构域(VL)的结合EGFR的单链Fv(SCFV)的设计的形式的总结显示在图1中，并且在表1和2中列举。通过基因合成和重组分子生物学技术，将SEQ ID NO :8的重链可变结构域 (VH)和SEQ ID NO=IO的轻链可变结构域(VL)通过甘氨酸丝氨酸(G4S)n单链接头连接从而提供结合EGFR的单链Fv (scFv)，其连接于抗-IGF-1R抗体<IGF_1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)轻链或重链的N端或C端的可变位置。此外，将半胱氨酸残基引入结合EGFR的scFv的VH结构域(包括Kabat位置44)和VL结构域(包括Kabat 位置100)的不同位置，如前所述(例如，WO 94/029350 ；Reiter, Y.，等，自然生物技术(Nature biotechnology) 14 (1996) 1239-1245 ；Young, N. , Μ.,等，FEBSLetters 卷 377(1995) 135-139 ；或 Rajagopal，V.，等，蛋白工程(Protein Engineering)卷 10 1453-59(1997)。随后，评估蛋白表达，稳定性和生物学活性。此外，在<IGF1R>抗体的重链或轻链的C端和结合EGFR的scFv之间的包含(甘氨酸4-丝氨酸)n的肽接头长度是变化的。此外，作为结合EGFR的单链Fv组件的完整部分的甘氨酸4-丝氨酸(G4S)单链接头的长度是变化的。所有这些分子重组产生，纯化并表征。在表1和2中提供了用于产生四价双特异性<EGFR-IGF1R>抗体的所有双特异性抗体设计的总结。对于该研究，我们使用术语 ‘XGFR，来描述同时识别EGFR以及IGFlR并包含特异性结合EGFR或IGFlR之一的全长抗体以及特异性结合EGFR或IGFlR的另一个的两个scFv片段的各种蛋白实体。表1-具有N端和C端scFv连接物的不同双特异性<EGFR_IGF1R>抗体形式，和相应的XGFRl-命名法和XGFR2-命名法。XGFRl 形式基于 a)人抗-IGF-1R 抗体 <IGF_1R>HUMAB 克隆 18 (DSM ACC 2587)和 b)来自SEQ ID NO 8的重链可变结构域(VH)和SEQID NO 10的轻链可变结构域(VL)的两条结合EGFR的单链Fv (scFv)，其连接于抗-IGF-IR抗体<IGF_1R>HUMAB克隆18的重链 (HC)或轻链(LC)的相同端(C端或N端)。XGFR2形式基于a)人源化的大鼠抗-EGFR抗体ICR62的可变区VH (SEQ ID NO 8) 和 VL (SEQ ID NO 10)和 b)结合抗-IGF-1R 抗体 <IGF_1R>HUMAB 克隆 18 的人抗-IGF-IR 抗体 <IGF-1R>HUMAB 克隆 18(DSM ACC 2587) VH(SEQ ID NO :23)禾口 VL(SEQ ID NO :25)的两条单链Fv (scFv)。表中的“_ “表示“不存在”
分子名称 XGFR-命名法scFv与全长抗体的连接位置单链接头 (G4S)n η=肽-接头 (G4S)n η=在二硫化物稳定的scFv中的Cys-位置抗-IGF-IR 抗体 <IGF-1 R> HUMAB克隆 18----人源化的大鼠抗-EGFR抗体 ICR62，具有 SEQ ID NO: 8 的VH，和 SEQ ID NO: 10 的 VL----XGFRl-2320C-端 HC32-XGFRl-3320N-端 HC32-XGFRl-4320C-端 LC32-XGFRl-5320N-端 LC32-XGFRl-2321C-端 HC32VH44/VL100XGFRl-3321N-端 HC32VH44/VL100XGFRl-4321C-端 LC32VH44/VL100XGFRl-5321N-端 LC32VH44/VL100XGFR2-2420C-端 HC42-XGFR2-2421C-端 HC42VH44/VL100XGFR2-3421N-端 HC42VH44/VL100XGFR2-4421C-端 LC42VH44/VL100
权利要求
1.结合EGFR和IGF-IR的双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一抗原结合位点和结合 IGF-IR的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQID NO 1的⑶R3区域，SEQ ID NO 2的⑶R2区域，和SEQ ID NO 3的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 4 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 区域；禾口iii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQID NO 11的⑶R3区域，SEQ ID NO 12的⑶R2区域，和SEQ ID NO 13的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 14 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 15 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 16 的 CDRl 区域；或所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO: 17的⑶R3区域，SEQ ID NO 18的⑶R2区域，和SEQ IDNO 19的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 20 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 21 的 CDR2 区域，禾口 SEQ ID NO 22 的 CDRl 区域。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于i)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQID NO 1的⑶R3区域，SEQ ID NO 2的⑶R2区域，和SEQ ID NO 3的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 4 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 区域；禾口ii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQID NO 11的⑶R3区域，SEQ ID NO 12的⑶R2区域，和SEQ ID NO 13的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 14 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 15 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 16 的 CDRl 区域。
3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于i)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQID NO 1的⑶R3区域，SEQ ID NO 2的⑶R2区域，和SEQ ID NO 3的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 4 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 区域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 区域；禾口ii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQID NO 17的⑶R3区域，SEQ ID NO 18的⑶R2区域，和SEQ ID NO 19的⑶Rl区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO 20 的 CDR3 区域，SEQ ID NO 21 的 CDR2 区域，禾口 SEQ ID NO 22 的 CDRl 区域。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于i)所述第一抗原结合位点包含SEQID NO :7或SEQ ID NO :8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 10作为轻链可变结构域，ii)所述第二抗原结合位点包含SEQID N0:23或SEQ ID NO : 作为重链可变结构域， 和包含SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26作为轻链可变结构域。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于i)所述第一抗原结合位点包含SEQID NO :8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO: 10作为轻链可变结构域，ii)所述第二抗原结合位点包含SEQID NO :23作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 25作为轻链可变结构域。
6.根据权利要求1-5中任一项的双特异性抗体，其特征在于所述抗体是二价的、三价的或四价的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于所述抗体是通过在Asn297具有糖链而被糖基化的，其中在所述糖链中的岩藻糖的量是65%以下。
8.药物组合物，其包含根据权利要求1-7所述的双特异性抗体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，用于治疗癌症。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗癌症。
11.根据权利要求1-7所述的双特异性抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。
12.治疗患有癌症的患者的方法，所述方法通过向需要所述治疗的患者施用根据权利要求1-7的双特异性抗体进行。
全文摘要
针对EGFR和针对IGF-1R的双特异性抗体，制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物及其应用。
文档编号C07K16/46GK102164960SQ200980137723
公开日2011年8月24日 申请日期2009年9月21日 优先权日2008年9月26日
发明者丽贝卡·克罗斯代尔, 乌尔里希·布林克曼, 克劳斯-彼得·金克勒, 克里斯蒂安·克莱因, 克里斯蒂安·吉尔德斯, 埃克·霍夫曼, 巴勃罗·乌马纳, 扬·奥拉夫·斯特拉克, 沃尔夫冈·谢弗, 维尔马·劳 申请人:罗氏格黎卡特股份公司