专利名称：疾病治疗用组合物的制作方法
疾病治疗用组合物本发明涉及风湿性疾病的治疗。本发明涉及一种高度有效的药物组合物，所述药物组合物包含诸如人源化单克隆抗体等能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和药物甲氨蝶呤。本发明的组合物和试剂盒对于治疗类风湿性关节炎特别有效。本发明涉及包含上述试剂和甲氨蝶呤的药物组合物或试剂盒，以及使用上述组合物和试剂盒的应用和治疗方法。风湿性疾病是一类影响结缔组织、特别是关节和相关结构的疾病，其特征在于炎症、变性或代谢紊乱。风湿性疾病的实例是类风湿性关节炎、银屑病关节炎、幼年型类风湿性关节炎和强直性脊柱炎。类风湿性关节炎是引起关节和周围组织的慢性炎症的自体免疫疾病，还能够影响其它组织或身体器官。当正常时对自体组织具有耐受性的T细胞识别“自身”分子(即，由宿主细胞产生的分子)并与其反应时，发生该疾病。通过由抗原呈递细胞(APC)加工的自体抗原的呈递而使“自体反应性”T细胞激活，所述激活引起T细胞的克隆性扩增并迁移到特定组织，在所述特定组织中所述T细胞诱导炎症和组织破环。目前可获得大量用于类风湿性关节炎的治疗，包括划分为非甾体抗炎药(NSAID) 的用于控制疼痛和炎症的一线药物，例如阿司匹林、布洛芬、萘普生等。关节炎的次级治疗包括皮质类固醇(例如泼尼松和地塞米松)，其是身体皮质酮激素的合成形式，缓慢地起抗风湿药(SAARD)或疾病调节性抗风湿药(disease-modifying anti-rheumaticdrug, DMARD)的作用，所述抗风湿药(SAARD)或疾病调节性抗风湿药(DMARD)例如羟基氯喹、柳氮磺吡啶、甲氨蝶呤、青霉胺、环磷酰胺、金盐、硫唑嘌呤、来氟米特等。许多新诊断有RA的患者开始使用诸如甲氨蝶呤(MTX)等DMARD。MTX (4_氨基-NlO-甲基蝶酰基谷氨酸)是叶酸的类似物，已知MTX阻碍一种叶酸形式的产生，该叶酸形式对于活跃生长中的细胞例如见于皮肤、血液、胃肠组织中的细胞和参与免疫系统的细胞等较重要。尚未完全清楚MTX如何降低RA的严重性，但是，据认为其在抗炎作用中起作用，并且对于其作用已经提出许多药理学机制，包括抑制嘌呤合成、促进腺苷释放、抑制促炎症细胞因子的产生和调节炎症(Swierkot等，2006)。还已知MTX抑制例如称为二氢叶酸还原酶(DHFR)的酶的活性，并且干预几种其它酶。用于治疗RA的另一组药物称为生物响应调节剂(BRM)，其包括单克隆抗体。其实例是肿瘤坏死因子-α (TNF- α )的拮抗剂，例如阿达木单抗、英利昔单抗和依那西普，其通过与TNF-α受体结合而起作用或通过直接与TNF-α蛋白自身结合而起作用。FDA已经批准几种TNF-α抑制剂用于治疗类风湿性关节炎，包括阿达木单抗(Humim )、英利昔单抗 (Remicade )和依那西普(Enbrel )。TNF-a代表类风湿性关节炎中的关键介导物，并且主要由RA患者滑膜内的激活的巨噬细胞产生。TNFa充当促炎症细胞因子，大量地存在于RA患者的滑膜组织中。其诱导趋化因子的产生和释放，所述趋化因子将白细胞从血液吸引到炎症组织中(Tracey等，2008)。除了介导滑膜炎症之外，TNF α参与关节破环和软骨降解。另外，其能够抑制⑶4+⑶25+调节性T细胞的抑制活性(Andersson等，2008)。在某些情况下用以上讨论的药物的组合治疗RA患者。特别地，DMARD经常用作第一治疗药物。但是，可能期望在未实现疾病控制的患者中将其与最近批准的治疗药物组合 (如TNF-α拮抗剂等生物试剂)使用。据报道与单独的MTX治疗相比，MTX与某些单克隆抗体(依那西普、英利昔单抗、阿达木单抗和anakirina)的组合产生更好的疗效(Swierkot 等，2006)。但是，MTX发挥多种药理学作用，并且其临床效果可能归因于多种靶标(Wessels 等，2008)。因此，不易于预测MTX如何影响作为单独试剂有效的药物的治疗活性以及由此影响效力。虽然目前存在各种可利用药物，但不是所有患者都对以上治疗响应良好，存在许多不利的副作用。例如，TNF-α治疗下调免疫系统，使得受治疗患者更易受感染和疾病影响。因此，仍然存在对于开发备选治疗的需要。通常认同的是，⑶4+T细胞在启动和维持自体免疫上起主要作用。因此，已经提出使用针对CD4+T细胞表面分子的mAb、特别是抗-CD4mAb，作为在治疗诸如类风湿性关节炎等疾病中的免疫抑制剂。进一步研究的一个实例是抗-⑶4 B-F5抗体(小鼠IgGl抗人⑶4)，已经在不同的自体免疫疾病中对其进行了测试。类风湿性关节炎患者中，在使用B-F5每日给药的安慰剂对照的试验中观察到的结果未表现出显著的改善(Wendling等，J Rheumatol ；25(8) 1457-61,1998) ο但是，在WO 2004/083247中，开发出与亲本小鼠B-F5具有相似CD4结合性质的人源化B-F5 (下文中称为hB-F5或BT061)抗体。对于小鼠B-F5抗体的人源化形式对还接受非留体抗炎药双氯芬酸的患者的作用的初步评价为有效的免疫抑制指示出有效的免疫抑制，该有效的免疫抑制由使用10天治疗时所述患者中的阳性临床效果所反映。该研究还由Wi jdenes等在2005年6月的EULAR会议上提出的摘要和海报中描述。 它们描述了每隔一天进行5次5mg hB-F5静脉内输注并伴随以150mg双氯酚酸对11名罹患类风湿性关节炎的患者进行治疗(Wijdenes等，摘要和海报，EULAR会议，2005年6月)。在WO 2004/083247中，注意到所述抗体能够激活⑶4+T细胞的特定亚类，即 ⑶4+⑶25+调节性T细胞(Tregs)。这些细胞占外周⑶4+T细胞的5 %-10 %，并且一旦经刺激，能够竞争性抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的响应，以及抑制B-细胞激活和克隆扩增。 因此这些细胞代表免疫系统中控制的重要水平。特别是，⑶4+⑶25+Treg细胞参与维持外周中的免疫稳态，和调节自体免疫性和病原性免疫响应。经由激活CD4+CD25+调节性T细胞的机制对类风湿性关节炎进行治疗代表了研究的重要途径，并且在国际专利申请第PCT/EP2009/05^09号、第PCT/EP2009/052811号和第PCT/EP2009/052810号中讨论了对罹患类风湿性关节炎的患者在II期临床试验中使用 hB-F5试剂。但是，不易于预测任一新型治疗是否能够成功地与当前的治疗组合从而给出有益的疗效。如上所述，特别对于MTX情况正是如此。几个研究已经报道了表明MTX对调节性T细胞具有负面效应的发现，因此可能防止将MTX用于与依赖于激活⑶4+⑶25+调节性T细胞作为其治疗机制的试剂一起进行组合治疗。Wascher等(1994)和Herman等0005)报道了表明MTX可以减少可利用的T淋巴细胞的数量的发现。Wascher等报道施用高剂量的MTX(静脉内给药12周)显著地减少了总的外周血淋巴细胞(P <0.01)，并且引起淋巴细胞亚类的明显重新分布，对B淋巴细胞(P < 0. 005)和T淋巴细胞(P < 0. 05)具有优先的减少效果。Herman等，2005报道了在反映
8对RA患者的低剂量治疗(7.5mg)的浓度时，MTX在体外对T淋巴细胞的凋亡诱导效应。另外，由Porter等，2006等进行的体外研究报道了 MTX对调节性T细胞的活力的影响。在50nM的体外浓度(分析的最高浓度)时，Treg细胞的抑制活性显著减少94% 88% (ρ < 0. 05)。这表明MTX的存在可以抑制Treg的抑制作用。另外，Yamaguchi等，2007报道了天然Treg细胞组成型地表达大量的叶酸盐受体 4(FR4)。由于MTX是叶酸盐类似物，这表明MTX也可以被Tregs细胞吸收。所述吸收可能导致干扰该细胞群中的代谢。此外，已知许多抗体的治疗活性受位于Fc受体表达细胞上的Fc受体影响。某些受体甚至需要与位于Fc受体表达细胞上的Fc受体结合以具有活性。但是，已知MTX治疗在体内引起单核细胞上Fc YRl表达的降低(Wijngaarden等，2004/2005)。还已经在用MTX 和治疗性抗-TNF-α抗体英利昔单抗进行治疗的患者中证明了 MTX对位于单核细胞上的Fc 受体表达的减少效果(Wijngaarden等，2008)。结果，通常认为MTX对Fc受体结合抗体的活性具有负面效应。因此，预期MTX会对抗体激活Tregs的能力具有负面效应。综上所述，预期MTX会对诸如hB_F5等经由⑶4+⑶25+调节性T细胞的激活而起作用的试剂的治疗能力具有负面影响。由此，可以看出不能预测组合治疗途径的结果。考虑上述现有技术，本发明的目的在于开发用于治疗类风湿性关节炎的其他的、 经改善的药物组合物。因此，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含能够激活⑶4+⑶25+ 调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤。本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒分开地包含能够激活⑶4+⑶25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤。本发明人出人意料地发现，能够激活⑶4+⑶25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤的组合具有治疗效应，并且在减少抗体相关的副作用方面具有令人惊奇的优点。该组合在实现高水平的治疗效果的速度方面也具有令人惊奇的优点。因此，本发明还提供一种治疗患者中风湿性疾病的方法，所述方法包括步骤(a) 施用能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和步骤(b)施用甲氨蝶呤，其中所述步骤(a) 和步骤(b)能够同时进行、分开进行或依次且以任何顺序进行。另外，本发明提供一种治疗正在经受甲氨蝶呤治疗的患者中的风湿性疾病的方法，所述方法包括施用能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂的步骤。作为另一种选择， 本发明提供一种治疗正在经受使用能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂的治疗的患者中的风湿性疾病的方法，所述方法包括施用甲氨蝶呤的步骤。此外，本发明提供一种治疗对于使用疾病调节性抗风湿药(DMARD)进行治疗无响应的患者中的类风湿性关节炎的方法，所述方法包括步骤(a)施用能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和步骤(b)施用甲氨蝶呤，其中所述步骤(a)和步骤(b)能够同时进行、 分开进行或依次且以任何顺序进行。另外，本发明提供用于在医药中同时、分开或依次使用的作为组合制剂的能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤。一方面，本发明提供在治疗风湿性疾病中同时、分开或依次使用的作为组合制剂的能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤。在另一方面，本发明提供了用于治疗患者中的风湿性疾病的能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂，其中所述患者正在经受甲氨蝶呤治疗。在再一方面，本发明提供一种用于治疗患者中的风湿性疾病的包含甲氨蝶呤的组合物，其中所述患者正在经受使用能够激活⑶4+⑶25+调节性T细胞的试剂的治疗。在又一方面，本发明提供了在治疗对于使用疾病调节性抗风湿药(DMARD)进行治疗无响应的患者中的风湿性疾病中同时、分开或依次使用的作为组合制剂的能够激活 ⑶4+⑶25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤。参照以下附图，仅借助于实例对本发明进行说明，其中
图1显示了实施例1中使用取自两个供体(实验1和实验2)的⑶4+⑶25+调节性T细胞进行的体外增殖测试的结果。图2A和图2B显示了与Keystone等Q004)和Q009)公布的III期试验中报道的最有效剂量组中的患者相比，在实施例2所述的临床试验过程中实现至少ACR 20分数的患者的百分比的图。图2B中的图是经安慰剂校正的。图3A和图;3B显示了与Keystone等Q004)和Q009)公布的III期试验中报道的最有效剂量组中的患者相比，在实施例2所述的临床试验过程中实现至少ACR 50分数的患者的百分比的图。图3B中的图是经安慰剂校正的。图4A和图4B显示了与Keystone等Q004)和Q009)公布的III期试验中报道的最有效剂量组中的患者相比，在实施例2所述的临床试验过程中实现至少ACR 70分数的患者的百分比的图。图4B中的图是经安慰剂校正的。图5显示了编码人源化B-F5的Vh区的质粒的片段的核苷酸序列(SEQ ID No 3)。 编码V区的序列以下划线示出，并且相应的多肽序列(SEQ ID No 15)在核苷酸序列之下标
出ο图6显示了编码人源化B-F5的Vk区的质粒的片段的核苷酸序列(SEQ ID No 4)。 编码V区的序列下划线示出，并且相应的多肽序列(SEQ ID No 2)在核苷酸序列之下标出。图7显示了在设计B-F5的人源化形式(即BT061)时，对小鼠B_F5VK(SEQ IDNo 6)、FK-001 (SEQ ID No :7、8、9 禾口 10)、L4L(SEQ ID No :16)禾口 L4M(SEQ ID No 2)的多肽序列进行的比对。图8显示了在设计B-F5的人源化形式时，对小鼠B-F5 Vh (SEQ ID No :5),M26(SEQ ID No :11、12、13 和 14)、H37L(SEQ ID No 1)和 H37V(SEQ ID No :15)的多肽序列进行的比对。如上所述，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含能够激活 CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤。本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒分开地包含能够激活⑶4+⑶25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤。所述能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤可以为单一制剂形式或分开的制剂的形式。所述制剂可以由所述试剂和/或甲氨蝶呤组成。作为另一种选择，所述制剂可以包含所述试剂和/或甲氨蝶呤，并且还包含药物可接受成分，例如载剂或赋性剂。在本发明的一方面，所述试剂和/或甲氨蝶呤适合于胃肠外施用，优选肌肉内、静脉内或皮下施用。最优选的是，所述试剂和/或甲氨蝶呤适于皮下施用。在本发明该方面的一个实施方式中，所述试剂和/或甲氨蝶呤适合于静脉内施用，并且以0. 5ml 500ml的剂量体积(dosage volume)提供或以用于稀释到0. 5ml 500ml的剂量体积的形式提供。在另一个实施方式中，所述组合物适于皮下或肌肉内施用，并且以0. Iml 3ml的剂量体积提供。作为另一种选择，所述试剂和/或甲氨蝶呤适于提供0. 5ml 1. 5ml或者15ml 25ml的剂量体积。在另一方面，甲氨蝶呤适合于口服施用，并且可以为片剂形式。在本发明的其他方面，所述组合物或试剂盒可以适于作为单剂量使用，或适于作为多次剂量的一部分使用，特别是当每周一次、每两周一次、每四周一次、每六周一次或每八周一次施用所述剂量时。在该方面的一个实施方式中，本发明的试剂盒包含多个单独剂量的试剂和甲氨蝶呤。在另一方面，提供一种剂量包(dosage pack)，所述剂量包包含多个单独的经包装剂量的所述药物组合物。在一个具体实施方式
中，所述试剂(可选地和甲氨蝶呤)适于皮下施用并且以易施用形式(ready for administration form)提供，所述易施用形式不需要稀释，因此它们可以容易地由非医务人员施用。适于在本发明中使用的试剂是能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂。所述试剂可以是多肽、蛋白质或抗体。当所述试剂是抗体时，其可以是单克隆抗体。优选的是，所述抗体是单克隆抗-CD4抗体。所述抗体还可以优选IgGl抗体，并且可以是未经修饰的IgGl 抗体。最适于在本发明中使用的抗体是能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的人源化抗-CD4抗体、或者其片段或衍生物。能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的抗体的实例在 Becker 等，(European Journal of ImmunologH2007)，第 37 卷第 1217-1223 页)中讨论， 并描述于WO 2004/083247中。通常本发明中使用的抗体包含一个或多个能够与CD4结合的可变域。所述抗体可以包含人类恒定区(Fe)。该恒定区可以从来自任一类免疫球蛋白(包括IgM、IgG、IgD、IgA 和IgE)和任一同种型(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)的恒定域中选择。优选的恒定区选自IgG的恒定域，特别是IgGl的恒定域。本发明还包括所述抗体的任何片段。所述片段优选包含所述抗体的抗原结合区或 V区，并且具体而言是Fab、Fab'、F(ab)' 2、Fv和scFv片段。在本发明的特别优选的方面，所述抗体是源自小鼠单克隆抗-CD4抗体B-F5的人源化抗-CD4抗体或者其片段或衍生物。所述抗体可以是包含含有小鼠单克隆抗体B-F5的互补决定区(CDR)的序列的人源化抗-CD4抗体，所述序列中可选地具有不显著影响抗体特异性和/或其亲和性的变异。抗体的实例在WO 2004/083247中提供，在WO 2004/083247中公开了小鼠B-F5抗体的几个人源化形式的制备。特别地，WO 2004/083247公开了制备具有V结构域的人源化抗体BT061 (hB-F5)，所述V结构域由以下多肽序列限定-H链V结构域EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKSENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSAS YYRYDVGAffFAYffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 1)-L链V结构域DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQ
KPGQPPKLLIYLASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFG QGTKVEIK(SEQ ID NO 2).该抗体的衍生物也适于在本发明中使用。衍生物包括具有由与SEQ ID NO :1或 SEQ ID NO :2具有至少80%、优选至少90%、最优选至少95%序列同一性的多肽序列所限定的V结构域的衍生物。特别优选的抗体是包含小鼠B-F5 mAb的互补决定区(OTR)并且保持hB_F5激活 ⑶4+⑶25+调节性T细胞的能力的抗体。在Vh和Vk结构域内⑶R的位置示于图7和图8。 所述抗体在CDR序列中可以可选地具有不显著影响结合特异性和/或结合亲和性的变异。通常而言，本发明中使用的抗体还包含人类恒定区(Fe)。该恒定区可以选自上述恒定域。本发明还包括hB_F5抗体的包含其V区的任何片段或其衍生物。所述片段特别包含 Fab、Fab'、F(ab)' 2、Fv 和 scFv 片段。为了制备所述hB_F5抗体，可以将编码BT061抗体的H链或L链的V结构域的多核苷酸与编码人类H链或L链的恒定区的多核苷酸融合。出于表达以此方式获得的完整H 链和L链的目的，还可以添加对允许分泌所述蛋白的信号肽进行编码的序列。在表达载体内将上述多核苷酸与合适的控制序列连接，所述控制序列允许在所选宿主细胞中调节该多核苷酸的转录和翻译。可以通过公知的重组DNA和遗传工程技术获得这些重组DNA构建体，并将其引入宿主细胞。有用的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。合适的真核细胞中，举例而言，可以举出植物细胞、诸如酵母菌等酵母细胞、诸如果蝇或夜蛾(Spodoptera)等昆虫细胞和诸如 HeLa, CH0、3T3、C127、BHK、COS 等哺乳动物细胞。本发明中利用的BT061(hB_ra)抗体可以通过以下方式获得在适于所述抗体表达的条件下，培养含有包含编码所述抗体的核酸序列的表达载体的宿主细胞，和从所述宿主细胞培养物回收所述抗体。本发明的另一方面是如下方法，所述方法包括制备包含所述试剂和甲氨蝶呤的试剂盒或药物组合物。如上所述，本发明还提供治疗罹患风湿性疾病或易受风湿性疾病影响的患者的医学用途和方法。特别地，在一个方面，本发明提供了一种治疗患者中风湿性疾病的方法，所述方法包括步骤(a)施用能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和步骤(b)施用甲氨蝶呤，其中所述步骤(a)和步骤(b)可以同时进行、分开进行或依次且以任何顺序进行。在该方面的一个实施方式中，步骤(a)和步骤(b)在同一天进行。在该方面的另一实施方式中， 步骤(a)和步骤(b)在同一周内进行。在另一个方面，本发明提供了治疗正在经受甲氨蝶呤治疗的患者中的风湿性疾病的方法，所述方法包括施用能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂的步骤，并且本发明提供了治疗正在经受使用能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂的治疗的患者中的风湿性疾病的方法，所述方法包括施用甲氨蝶呤的步骤。风湿性疾病被定义为影响结缔组织、特别是关节和相关结构的疾病，特别是其特征在于炎症、变性或代谢紊乱。在本发明的优选方面，所述风湿性疾病是类风湿性关节炎、 银屑病关节炎、幼年型类风湿性关节炎或强直性脊柱炎。
优选对类风湿性关节炎的治疗。关于类风湿性关节炎可以使用ACR评分评估治疗的临床功效。ACR评分是由美国风湿病学院(ACR)提供的对受治疗患者所表现出的类风湿性关节炎进行评估的方法，并且通过对核心的参数组进行测定而完成Orison等，Arthritis& Rheumatism, 1995，38 (6)，727-735)。该系统将值ACR 20定义为触痛关节和肿胀关节计数方面的至少20%改善，以及5个其余ACR核心组量度中的3个方面的至少20%的改善患者和医师全面评估、疼痛、残疾和诸如C-反应性蛋白(CRP)或红细胞沉降速率(ESR)等急性期反应物。类似地，ACR 50和ACR 70分数分别定义了至少50%和至少70%的改善。在本发明另一方面，可以对对于使用疾病调节性抗风湿药(DMARD)进行治疗无响应的患者施用所述治疗。无响应者是对于使用DMARD的治疗显示不足的响应的患者。 特别地，如果他/她具有持续的临床活性类风湿性关节炎，例如如果药物在患者中未实现 ACR20、或未实现对关节的结构损伤的进展进行抑制、或如果在治疗期间对药物的起始响应随着时间的流逝而丧失，则所述患者显示出不足的响应。DMARD的实例例如为羟基氯喹、柳氮磺吡啶，甲氨蝶呤、青霉胺、环磷酰胺、金盐、硫唑嘌呤、来氟米特等。如上所述，可以以任何合适的方式对患者施用所述试剂和甲氨蝶呤。特别地，可以将其在胃肠外施用，例如通过静脉内、肌肉内或皮下注射施用。对于所述试剂的施用，特别优选静脉内或皮下施用。另外，可以口服施用甲氨蝶呤。所述试剂和/或甲氨蝶呤的剂量体积可以根据施用方法而变化。当通过静脉内输注施用所述剂量时，剂量体积可以是0. Iml或0. 5ml 至多500ml，优选是15ml 25ml，通常是约20ml。当通过皮下或肌肉内注射施用所述剂量时，剂量体积可以是0. Iml 3ml，优选是0. 5ml 1. 5ml，通常是约Iml。施用频率不受特别限制，条件是不影响治疗的效力。治疗可以包括单剂量或多次剂量。优选的是至少在以下基础上施用多次剂量每周、每2周、每4周、每6周、每12周、 每M周、每日历月、每6个日历月或每年。因此，所述多次剂量可以被至少1周、至少2周、 至少1个月、至少3个月、至少6个月或被至少1年分隔开(意味着每周、每2周、或每月或每6个月或每年进行给药)。特别优选的是至少每2周 3周施用所述剂量。治疗长度不受特别限制，并且如通常在治疗自体免疫疾病中那样，治疗无限期地进行，或直到症状减少至对于患者而言可管理的水平。通常对受试对象施用所述治疗至少 1个月。应该理解，所述试剂和甲氨蝶呤以治疗有效量、即以对于缓解、预防或治疗风湿性疾病有效的量施用。特别地，当所述疾病是类风湿性关节炎时，优选的是以可有效提供ACR50响应、更优选ACR70响应的量施用所述试剂和甲氨蝶呤。在本发明的一个方面，以0. 2mg IOmg的剂量、更优选以0. 2mg 6. 25mg的剂量、 最优选以0. 2mg 3mg的剂量对受试对象施用所述试剂。当静脉内施用所述剂量时，这些剂量特别优选。当所述试剂是人源化抗体BT061时，如下表1中所示，发明人令人惊奇地发现静脉内输注结束后3小时健康志愿者血浆中循环的抗体的有效Cmax值比预期低得多。这认为是反映了更快的经靶标介导的清除。
权利要求
1.一种药物组合物，所述药物组合物包含能够激活⑶4+⑶25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤。
2.一种试剂盒，所述试剂盒分开地包含能够激活⑶4+⑶25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤。
3.如权利要求1或权利要求2所述的药物组合物或试剂盒，其中所述试剂适于胃肠外施用。
4.如权利要求3所述的药物组合物或试剂盒，其中所述试剂适于肌肉内、静脉内或皮下施用。
5.如任一项前述权利要求所述的药物组合物或试剂盒，其中所述甲氨蝶呤适于口服、 肌肉内、静脉内或皮下施用。
6.如任一项前述权利要求所述的药物组合物或试剂盒，其中所述能够激活CD4+CD25+ 调节性T细胞的试剂是抗体或者其片段或衍生物。
7.如权利要求6所述的药物组合物或试剂盒，其中所述抗体是人源化单克隆抗体。
8.如权利要求6或权利要求7所述的药物组合物或试剂盒，其中所述试剂是抗-CD4抗体或者其片段或衍生物。
9.如权利要求8所述的药物组合物或试剂盒，其中所述试剂是人源化抗-CD4抗体，所述人源化抗-CD4抗体包含含有小鼠单克隆抗体B-F5的互补决定区(CDR)的序列，所述序列中可选地具有不显著影响抗体特异性和/或其亲和性的变异。
10.如权利要求8所述的药物组合物或试剂盒，其中所述试剂是具有V结构域的人源化抗-CD4抗体，所述V结构域由以下多肽序列限定-H链V结构域EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKSEN YGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFA YffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 1) -L链V结构域DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLASILE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFGQGTKVEIK(SEQ IDNO 2). 或V结构域包含与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2具有至少80%序列同一性的多肽序列。
11.如任一项前述权利要求所述的药物组合物或试剂盒，其中以0.2mg IOmg的剂量对受试对象施用所述能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂。
12.如权利要求11所述的药物组合物或试剂盒，其中以0.2mg 5mg的剂量对受试对象施用所述能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂。
13.如权利要求12所述的药物组合物或试剂盒，其中以0.5mg 3mg的剂量对受试对象施用所述能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂。
14.如任一项前述权利要求所述的药物组合物，其中将所述组合物或试剂用于静脉内施用，并且以0. 5ml 500ml的剂量体积提供或以用于稀释至0. 5ml 500ml的剂量体积的形式提供。
15.如权利要求1 13中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物或试剂适于提供.0. 5ml 1. 5ml的剂量体积或以0. 5ml 1. 5ml的剂量体积提供。
16.如权利要求1 13中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物或试剂适于提供 15ml 25ml的剂量体积或以15ml 25ml的剂量体积提供。
17.如权利要求1 13中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物适于皮下或肌肉内施用，并且以0. Iml 3ml的剂量体积提供。
18.如任一项前述权利要求所述的药物组合物，其中所述组合物或试剂适于作为单剂量使用。
19.如权利要求1 17中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物或试剂适于作为多次剂量的一部分使用。
20.如权利要求20所述的药物组合物，其中每周施用所述多次剂量中的每一剂量。
21.一种治疗患者中的风湿性疾病的方法，所述方法包括步骤(a)施用能够激活 CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和步骤(b)施用甲氨蝶呤，其中所述步骤(a)和步骤(b)能够同时进行、分开进行或依次且以任何顺序进行。
22.—种治疗患者中的风湿性疾病的方法，所述患者正在经受甲氨蝶呤治疗，所述方法包括施用能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂的步骤。
23.一种治疗患者中的风湿性疾病的方法，所述患者正在经受使用能够激活 CD4+CD25+调节性T细胞的试剂的治疗，所述方法包括施用甲氨蝶呤的步骤。
24.如权利要求21 23中任一项所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中所述风湿性疾病选自类风湿性关节炎、银屑病关节炎、幼年型类风湿性关节炎和强直性脊柱炎。
25.如权利要求M所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中所述风湿性疾病是类风湿性关节炎。
26.一种治疗患者中的类风湿性关节炎的方法，所述患者对于使用疾病调节性抗风湿药(DMARD)进行治疗无响应，所述方法包括步骤(a)施用能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和步骤(b)施用甲氨蝶呤，其中所述步骤(a)和步骤(b)能够同时进行、分开进行或依次且以任何顺序进行。
27.如权利要求沈所述的治疗患者中的类风湿性关节炎的方法，其中所述DMARD是甲氨蝶呤。
28.如权利要求21 27中任一项所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中在胃肠外施用所述试剂。
29.如权利要求观所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中在肌肉内、静脉内或皮下施用所述试剂。
30.如权利要求21 四中任一项所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中以口服、肌肉内、静脉内或皮下施用所述试剂。
31.如权利要求21 30中任一项所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中以 0. 2mg IOmg的量对所述患者施用所述试剂。
32.如权利要求31所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中以0.2mg 5mg的量对所述患者施用所述试剂。
33.如权利要求32所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中以0.5mg 3mg的量对所述患者施用所述试剂。
34.如权利要求31所述的治疗方法，其中在静脉内施用所述试剂，并且施用结束后3小时患者血浆中所述试剂的最大浓度小于2. 5 μ g/ml。
35.如权利要求32所述的治疗方法，其中在静脉内施用所述试剂，并且施用结束后3小时患者血浆中所述试剂的最大浓度小于0. 3 μ g/ml。
36.如权利要求33所述的治疗方法，其中在静脉内施用所述试剂，并且施用结束后3小时患者血浆中所述试剂的最大浓度小于0. 1 μ g/ml。
37.如权利要求31所述的治疗方法，其中每周一次在静脉内施用所述试剂，并且第二次施用结束后3小时患者血浆中所述试剂的最大浓度小于2. 5 μ g/ml。
38.如权利要求32所述的治疗方法，其中每周一次在静脉内施用所述试剂，并且第二次施用结束后3小时患者血浆中所述试剂的最大浓度小于0. 3 μ g/ml。
39.如权利要求33所述的治疗方法，其中每周一次在静脉内施用所述试剂，并且第二次施用结束后3小时患者血浆中所述试剂的最大浓度小于0. 1 μ g/ml。
40.如权利要求31所述的治疗方法，其中每周一次在静脉内施用所述试剂，并且任一次施用结束后3小时患者血浆中所述试剂的最大浓度小于2. 5 μ g/ml。
41.如权利要求32所述的治疗方法，其中每周一次在静脉内施用所述试剂，并且任一次施用结束后3小时患者血浆中所述试剂的最大浓度小于0. 3 μ g/ml。
42.如权利要求33所述的治疗方法，其中每周一次在静脉内施用所述试剂，并且任一次施用结束后3小时患者血浆中所述试剂的最大浓度小于0. 1 μ g/ml。
43.如权利要求21 30中任一项所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中以 2 μ g/kg 150 μ g/kg的量对所述患者施用所述试剂。
44.如权利要求43所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中以2μ g/kg 75 μ g/ kg的量对所述患者施用所述试剂。
45.如权利要求44所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中以5μ g/kg 45 μ g/ kg的量对所述患者施用所述试剂。
46.如权利要求21 30中任一项所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中以 0. lmg/m2患者体表面积 5mg/m2患者体表面积的量对所述患者施用所述试剂。
47.如权利要求46所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中以0.lmg/m2患者体表面积 2. 5mg/m2患者体表面积的量对所述患者施用所述试剂。
48.如权利要求47所述的治疗患者中的风湿性疾病的方法，其中以0.25mg/m2患者体表面积 1. 5mg/m2患者体表面积的量对所述患者施用所述试剂。
49.如权利要求21 48中任一项所述的治疗风湿性疾病的方法，其中对患者施用单剂量的所述试剂。
50.如权利要求21 48中任一项所述的治疗风湿性疾病的方法，其中对患者施用多次剂量的所述试剂。
51.如权利要求50所述的治疗风湿性疾病的方法，其中至多每周施用所述试剂和/或甲氨蝶呤。
52.如权利要求51所述的治疗风湿性疾病的方法，其中每两周、每三周或每四周施用所述试剂和/或甲氨蝶呤。
53.如权利要求21 52中任一项所述的治疗风湿性疾病的方法，所述方法包括施用适于治疗所述疾病的额外治疗剂的另一步骤，所述额外治疗剂选自非留体抗炎药、抗炎性甾体、金化合物、抗疟疾药、叶酸、环孢霉素、来氟米特、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、d-青霉胺、环磷酰胺、麦考酚酯、二甲胺四环素和苯丁酸氮芥。
54.如权利要求21 53中任一项所述的治疗风湿性疾病的方法，其中所述风湿性疾病是类风湿性关节炎，并且根据美国风湿病学院(ACR)评分系统所述治疗提供对所述患者中的疾病的至少ACR50的改善。
55.如权利要求M所述的治疗风湿性疾病的方法，其中根据美国风湿病学院(ACR)评分系统所述治疗提供对所述患者中的疾病的至少ACR70的改善。
56.如权利要求55所述的治疗风湿性疾病的方法，其中在开始治疗后6 8周之间所述治疗为所述患者提供至少ACR70的响应。
57.用于在医药中同时、分开或依次使用的作为组合制剂的能够激活⑶4+⑶25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤。
58.如权利要求57所述的用于同时、分开或依次使用的作为组合制剂的能够激活 CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤，其用于治疗风湿性疾病。
59.能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤在制备用于在治疗患者中的风湿性疾病中同时、分开或依次使用的组合制剂中的应用。
60.一种能够激活⑶4+⑶25+调节性T细胞的试剂，所述试剂用于治疗患者中的风湿性疾病，其中所述患者正在经受甲氨蝶呤治疗。
61.一种包含甲氨蝶呤的组合物，所述组合物用于治疗患者中的风湿性疾病，其中所述患者正在经受使用能够激活⑶4+⑶25+调节性T细胞的试剂的治疗。
62.如权利要求58 61中任一项所述的应用，其中所述风湿性疾病选自类风湿性关节炎、银屑病关节炎、幼年型类风湿性关节炎和强直性脊柱炎。
63.如权利要求62所述的应用，其中所述风湿性疾病是类风湿性关节炎。
64.如权利要求57所述的用于同时、分开或依次使用的作为组合制剂的能够激活 CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤，其用于治疗对于使用疾病调节性抗风湿药 (DMARD)进行的治疗无响应的患者中的风湿性疾病。
65.如权利要求65所用的试剂，其中所述DMARD是甲氨蝶呤。
66.如权利要求57 65中任一项所述的应用，其中所述试剂适于胃肠外施用。
67.如权利要求66所述的应用，其中所述试剂适于肌肉内、静脉内或皮下施用。
68.如权利要求57 67中任一项所述的应用，其中所述试剂适于口服、肌肉内、静脉内或皮下施用。
69.如权利要求57 68中任一项所述的应用，其中以0.2mg IOmg的量对所述患者施用所述试剂。
70.如权利要求69中所述的应用，其中所述试剂适于静脉内施用，并且其在施用后3小时于患者血浆中建立的最大浓度小于2. 5 μ g/ml。
71.如权利要求57 68中任一项所述的应用，其中以2μ g/kg 150 μ g/kg的量对所述患者施用所述试剂。
72.如权利要求57 68中任一项所述的应用，其中以0.lmg/m2患者体表面积 5mg/ m2患者体表面积的量对所述患者施用所述试剂。
73.如权利要求57 72中任一项所述的应用，其中所述试剂适于作为单剂量施用。
74.如权利要求57 72中任一项所述的应用，其中所述试剂适于作为多次剂量的一部分施用。
75.如权利要求74所述的应用，其中所述试剂适于至多每周一次施用。
76.如权利要求57 72中任一项所述的应用，其中所述组合制剂还包括适于治疗所述疾病的额外治疗剂，所述额外治疗剂选自非留体抗炎药、抗炎性留体、金化合物、抗疟疾药、 叶酸、环孢霉素、来氟米特、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、d-青霉胺、环磷酰胺、麦考酚酯、二甲胺四环素和苯丁酸氮芥。
77.如权利要求58 76中任一项所述的应用，其中所述风湿性疾病是类风湿性关节炎，并且根据美国风湿病学院(ACR)评分系统所述组合制剂能够提供对所述患者中的疾病的至少ACR50的改善。
78.如权利要求21 77中任一项所述的方法或应用，其中所述能够激活⑶4+⑶25+调节性T细胞的试剂是抗体或者其片段或衍生物。
79.如权利要求78所述的方法或应用，其中所述抗体是人源化单克隆抗体。
80.如权利要求78或79所述的方法或应用，其中所述试剂是抗-CD4抗体或者其片段或衍生物。
81.如权利要求80所述的方法或应用，其中所述试剂是人源化抗-CD4抗体，所述人源化抗-CD4抗体包含含有小鼠单克隆抗体B-F5的互补决定区(CDR)的序列，所述序列可选地具有不显著影响抗体特异性和/或其亲和性的变异。
82.如权利要求80所述的方法或应用，其中所述试剂是具有V结构域的人源化抗-CD4 抗体，所述V结构域由以下多肽序列限定-H链V结构域EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKSENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFAYffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 1)-L链V结构域DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFGQGTKVEIK(SEQ IDNO 2).或V结构域包含与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2具有至少80%序列同一性的多肽序列。
83.一种方法，所述方法包括制备如权利要求1 20中任一项所述的、包含所述试剂和甲氨蝶呤的药物组合物或试剂盒。
全文摘要
本发明提供包含能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂和甲氨蝶呤的药物组合物和试剂盒，以及利用所述药物组合物和试剂盒的治疗方法和医学用途。
文档编号C07K16/46GK102215867SQ200980143326
公开日2011年10月12日 申请日期2009年8月31日 优先权日2008年9月29日
发明者克里斯托夫·尤尔克, 克里斯托夫·布鲁切尔, 安德里亚·瓦滕贝格-德曼特, 尚塔尔·祖伯, 尼古拉斯·蔡洛特, 弗兰克·奥斯特罗斯, 本杰明·德尔肯, 格雷戈尔·舒尔茨, 西尔克·艾格纳, 迈克尔·索尔丹, 阿纳托利·鲁德涅夫 申请人:生物测试股份公司