针对非洲马疫病毒的疫苗的制作方法

专利名称：针对非洲马疫病毒的疫苗的制作方法
针对非洲马疫病毒的疫苗通过引用并入本申请要求提交于2008年10月M日的美国临时申请No. 61/108，075及提交于 2009年3月26日的美国临时申请No. 61/163，517的权利。将前述申请，及该文或它们的审查期间引用的全部文献(“appln引用的文献”)及 appln引用的文献中全部引用的文献或参考文献，及本文中引用的或参考的全部文献(“本文中引用的文献”)，及本文中引用的文献中引用的或参考的全部文献，伴随本文提及的或本文中通过引用合并的任何文献中的任何产品的任何生产商的使用说明，说明书，产品说明，及产品单通过引用合并到本文中，及可在本发明的实践中采用。
技术领域：
本发明涉及疫苗接种针对非洲马疫病毒(AHSV)的受试者。尤其是，本发明涉及含及在宿主中表达一种或多种非洲马疫病毒的免疫原性蛋白的重组载体的构建及使用。本发明还涉及诱导针对非洲马疫病毒的免疫应答的免疫学组合物或疫苗。本发明还涉及赋予对抗被非洲马疫病毒感染的保护性免疫的组合物或疫苗。本申请中参考多个出版物。这些文献的全部索引见于说明书末，权利要求之前， 和/或文献的引用处。这些文献属于本发明的领域；及，将本申请中引用的或参考的各文献 (“本文中引用的文献”)，及各在本文中引用的文献中引用的或参考的文献均通过引用合并到本文中。
背景技术：
非洲马疫(AiB)是马及骡的严重的，常致死的，节肢动物来源的病毒疾病(非洲马疫，The Merck兽医学手册)。在此疾病的一些形式中死亡率可高达95%。无症状的或弱的感染可在马，以及斑马及驴发生，尤其之前经不同的病毒血清型感染的马。感染的动物或载体可将病毒携带到无AHS区.一些作者描述，气候变化可增加节肢动物来源疾病(例如非洲马疫)的扩展的风险，如最近已在相关的蓝舌病毒中发生的(Wilson A等人，Parasitol. Res. 2008 ；103 :69-77)。拟蚊库蠓(Culicoides imicola)(此疾病的主要载体)，已袭击北非及南欧。潜在的节肢动物载体也贯穿实际上世界的全部地区存在，包括得美国及多数美洲其余地区。非洲马疫由非洲马疫病毒(呼肠病毒科(Reoviridae)中的一个属-环状病毒属) 感染所致。至今，已知9种非洲马疫病毒的血清型。第9血清型非洲马疫病毒广布于各地区，而第1 8血清型主要见于有限的地区。第9血清型造成在非洲之外的地区的大部分非洲马疫蔓延。第4血清型在1987年和1990年之间西班牙及葡萄牙的蔓延一次(Lubroth J.，Equine Pract. 1988 ；10 :26-33)。对非洲马疫病毒的初始研究导致1930年代对非洲马疫病毒的小鼠大脑衰减的修饰的活病毒疫苗的开发。优化这些疫苗及导致I960年代组织培养衰减的修饰的活病毒 (MLV)疫苗的开发。
尽管此疫苗的功效，其具有一些固有限制，包括个体动物中的疫苗反应(包括死亡)，个体动物中改变的免疫应答，用被动母源免疫免疫幼小动物的困难，疫苗病毒的毒力逆转的可能性，及用可能的毒力逆转疫苗接种后的疫苗株重组(du Plessis M. et al. 1998，Onderstepoort Journal of Veterinary Research 65 :321-329)。也有与使用 MLV疫苗的社会经济学牵连。南非有允许其出口马到欧盟及许多其他国家的流程。此流程也使得来自其他国家的马进入南非以在各活动中竞赛或临时作为种畜的可能。流程基于确保马对抗非洲马疫病毒充分疫苗接种。兽医局知道使用MLV疫苗的可能的危险。多数这些问题将通过交替开发非洲马疫病毒疫苗大大降低。非洲马疫病毒基因组由10个双链RNA段组成(0eHermann, R. A. et al.，1970 ； Bremer, C. W. et al.，1976)，其编码至少10种病毒蛋白。基因组段以它们在PAGE种迁移的顺序编号1 10。病毒蛋白中的7种是结构性的，且形成双壳病毒粒子。外部壳体由2 种主要病毒蛋白，VP2及VP5组成，其决定非洲马疫病毒的抗原性存活力，而内部壳体包括 2种大的(VP3及VP7)的及3种小的(VP1，VP4及VP6)病毒蛋白(Lewis SA and Grubman MJ, 1991) ； (Martinez-Torrecuadrada JL 等人，1994) ； (Bremer, Cff, et al. 1990 ；Grubman, M. J.& Lewis, S. Α.，1992)。VP3 及 VP7 在 9 种血清型之中高度保守(Oel Iermann 等人，1970 ； Bremer等人，1990)。已鉴定至少3种非结构蛋白，NS1，NS2及NS3 (Huismans，H. & Els, H. J.，1979 ；vanStaden, V. & Huismans，H.，1991 ；Mizukoshi，N.等人，1992)。已开发源于衰减的病毒的重组金丝雀痘病毒作为异源病毒基因表达的载体。许多这些金丝雀痘病毒构建体已在许多国家(包括南非，欧盟及美国)被许可作为用于马(Minke JM，等人，200 及 b ;Minke JM，等人，2007 ;Siger L，等人 2006)及其他物种 (Poulet H，等人，2003)的疫苗。这些疫苗仅含目的生物的基因的事实使它们遗传上安全(Minke JM，等人， 2004b)。此外，可检测的中和抗体的起始甚至在单剂量的疫苗后也快速(Minke JM等人， 2004b)。所述疫苗的遗传安全性及中和抗体的开发的性质使所述疫苗尤其有吸引力用于动物流行病(Minke JM等人，20(Ma)。之前研究显示，当马用外源地表达的VP2及适当的佐剂接种时发展针对AHS的中和抗体(kanlen M，等人，200 。羊中的研究显示，应答蓝舌病毒的中和抗体可通过将羊用 VP2及VP5共表达的病毒样粒子接种来增强(Pearson LD, Roy P，1993)。共表达编码蓝舌病毒的VP2及VP5外部壳蛋白的基因的重组金丝雀痘病毒疫苗最近显示在羊中诱导高水平的保护(Boone JD，等人，2007)。未显示马当用含及共表达AHSV VP2及VP5的载体疫苗接种时发展针对非洲马疫病毒的中和抗体。因此说明，本发明满足了本领域中的需要，通过提供重组痘病毒(包括由其的组合物及产品)，尤其基于ALVAC的重组体及由其的组合物及产品，尤其表达AHSV VP 2及5的重组体或任何它们的组合及由其的组合物及产品。本申请中的文献的引用或任何的鉴定不代表承认所述文献可作为本发明的现有技术。发明概述本发明的对象可为提供的重组载体或病毒以及制备所述重组载体或病毒的方法， 及提供组合物和/或疫苗以及治疗及预防被非洲马疫病毒的感染的方法的任何之一或全部。本发明提供包括及表达至少一种外源核酸分子的重组载体(例如重组病毒(例如重组痘病毒))，其中所述至少一种外源核酸分子可包括编码来自非洲马疫病毒的免疫原或目的表位(尤其病毒蛋白或非洲马疫病毒的部分)的核酸分子。本发明还提供重组载体，其中所述非洲马疫病毒株是1，2，4，或9。本发明还提供包括所述病毒或所述病毒的表达产物的免疫学(或免疫原性)，或疫苗组合物。本发明还提供诱导对抗非洲马疫病毒的免疫学(或免疫原性)或保护应答的方法，以及的方法预防或治疗非洲马疫病毒或由非洲马疫病毒所致的疾病状态，包括施用病毒或病毒的表达产物，或包括病毒的组合物，或包括病毒的表达产物的组合物。本发明也涵盖来自病毒的表达产物，以及从表达产物或其体内表达产生的抗体， 及所述产物及抗体的使用，例如在诊断性应用中。本发明还提供AHSV VP2及VP5多肽及编码AHSV VP2及VP5多肽的多核苷酸。本发明也提供新AHS株AHSV4-Jane。这些及其他实施方式描述于以下详述，或从以下详述中显而易见，及被以下详述
冷至
口 JnL。

以下详述，通过实施例给出，但不旨在限制本发明仅到描述的特定实施方式，可伴随附图最佳理解，其中图1提供pLHD3460. 4(产生表达合成的AHSV-4-VP2(SEQ ID NO :1)及合成的 AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO 2)蛋白的ALVAC重组体的C3供体质粒)的构建方案。图 2 提供 pLHD3460. 4 (pC3 H6p 合成的 AHSV_4_VP2/42Kp 合成的 AHSV-4-VP5)的 map 及相关 SEQ ID NO。pLHD3460. 4 = SEQ ID NO 6 ；AHSV-4 VP2 DNA (pLHD3460. 4) -SEQ ID NO 4 ；AHSV-4 VP5 DNA(pLHD3460. 4)-SEQ ID NO 5 ；AHSV-4 VP2 PRT(pLHD3460. 4)的预测的氨基酸序列-SEQ ID NO 1 ；AHSV-4 VP5 PRT (pLHD3460. 4)的预测的氨基酸序列=SEQ ID NO :2。图 3 提供 vCP2377 (ALVAC C3 H6p-合成的 AHSV-4_VP2/42Kp-合成的 AHSV-4-VP5) 的体外重组方案。图4提供Vector NTI中创建的基因组DNA的理论限制酶凝胶。图5提供来自VCP2377.6. 1. 1的P3浓储物的基因组DNA提取的0. 8%琼脂糖凝胶电泳结果，然后是用BamHI，HindIII或I^stI消化。图6提供使用AHSV-4-VP2探针的vCP2377. 6. 1. 1的DNA印迹分析。图7提供指示AHSV-4-VP5蛋白的表达的重组vCP2377的分析的蛋白印迹结果。图8提供指示以1 100的稀释使用第9代小鼠抗-AHSV VP5 mAb 10AE12的 VCP2377. 6. 1. 1群的100%同质性的免疫噬斑结果。图9提供用于扩增重组VCP2377. 6. 1. 1序列的C3R-AHSV插入子-C3L片段及SEQ ID索引的引物图谱(SEQ ID N0:17 21)。图 10 显示 pCXL2415. 1 (SEQ ID NO 22)(用于表达 AHSV9-VP2 (SEQ ID NO 20)及AHSV9-VP5 (SEQ ID NO 21)蛋白的ALVAC重组体产生的C3供体质粒)的构建方案。图 11 提供 pCXL2415. l(pALVAC C3 AHSV-9 H6 VP2 42K VP5)的图谱及相关 SEQ ID NO(18-21)。图 12 提供 vCP2383(ALVAC C3 H6_ 合成的 AHSV9 VP2/42K-合成的 AHSV9 VP5)的
体外重组方案。图13提供在Vector NTI中创建的基因组DNA的理论限制酶凝胶。图 14 提供从用 BamH I，HindIII 或 XbaI 消化的 vCP2383. 3. 1. 1. 1 及 VCP2383. 9. 1. 1. 1基因组DNA提取的0. 8%琼脂糖凝胶电泳结果。图15提供使用AHSV-4-VP5探针的vCP2383的DNA印迹分析。图16提供表明AHSV9 VP5蛋白的表达的重组vCP2383的分析的蛋白印迹结果。图17提供指示以1 100的稀释使用第9代小鼠抗-AHSV VP5 mAb 10AE12的 VCP2383. 3. 1. 1. 1群的100%同质性的免疫噬斑结果。图18提供用于扩增重组VCP2383序列的整个C3L-H6 AHSV9 VP2-42K AHSV9 VP5-C3R片段及相关SEQ ID辣7 31)的引物的图谱。图19提供来自感染的CEF细胞的抗-VP2及抗_VP5 IFI的免疫荧光结果。图20 A&B显示使用抗-VP2㈧及抗_VP5 (B)与感染的及转染的CEF的蛋白印迹的结果。图21给出使用cpAHSV-4 (vCP2377)疫苗接种的6匹马的针对AHSV-4的血清病毒中和测试的结果。显示第0，28，及42天的结果。图22显示pJSY2M7. 2 (用于表达AHSV5-VP2及VP5蛋白的ALVAC重组体的产生的C3供体质粒)的构建方案。图 23 提供 pJSY2247· 2 (pALVAC C3 AHSV5 H6 VP2 42K VP5)序列的图谱及相关 SEQ ID NO。图 24 提供 vCP2398 (ALVAC C3 H6-合成的 AHSV5 VP2/42K-合成的 AHSV5 VP5)的
体外重组方案。图25提供在Vector NTI中创建的基因组vCP2398 DNA的理论限制酶凝胶。图洸提供用BamHI,HindIII或PstI消化的来自vCP2398. 2. 1. 1及3. 1. 1的基因组DNA提取的0. 8%琼脂糖凝胶电泳结果。图27提供使用AHSV5 VP2特异性探针的vCP2398的DNA印迹分柝。图28提供表明AHSV5 VP5蛋白的表达的重组vCP2398的分析的蛋白印迹结果。图四提供指示以1 100的稀释使用小鼠抗-AHSV VP5 mAb 10AE12代的 VCP2383. 2. 1. 1群的100%同质性的免疫噬斑结果。图 30 提供用于扩增重组 VCP2398 的整个 C3L-H6 AHSV5 VP2-42K AHSV5 VP5-C3R 片段的引物的图谱。图31提供来自用VCP2377免疫的8匹(部分如SEQ ID NO 17所示)及用EIV-CP 免疫的对照马的AHSV攻击结果的3个亚图。亚图A 编码AHSV NS2及VP7蛋白的基因的qRT_PCR，s的循环阈值(显示的NS2 及VP7特征的平均值)。如果荧光在最大40个循环内超过0. 1的阈值，通过用分类为阳性的样品检测编码AHSV的VP7及NS2蛋白的个体基因的qRT-PCR测定测定马血中有AHSV。
亚图B:体温，IDEM亚图C 用AHSV第4血清型.IDEM的强毒野外株攻击后，用vCP2377免疫接种的8 匹及未免疫接种的对照马的血小板计数。图32提供总结序列表中存在的SEQ ID NO的表。图 33 提供 AHSV-4/5/9VP2 蛋白(SEQ ID NO :1,44,30)的 ClustalW 比对。图 34 提供 AHSV-4/5/9 VP5 蛋白(SEQ ID NO :2,45,31)的 Clustalff 比对。图35提供合成的AHSV-4-VP2蛋白(SEQ ID NO 1)对比野外分离的AHSV4 Jane 株(SEQ ID NO 49)的ClustalW比对。也显示百分率同一性。图36提供合成的AHSV-4-VP5蛋白(SEQ ID NO 2)对比野外分离AHSV4 Jane株 (SEQ ID NO 51)的ClustalW比对。也显示百分率同一性。图37提供合成的AHSV-4-VP2蛋白(SEQ ID NO 1)对比多种沉淀的AHSV-4-VP2 蛋白(SEQ ID N0:59 63)的ClustalW比对。提供百分率同一性表。图38提供合成的AHSV-4-VP5蛋白(SEQ ID NO 2)对比多种沉淀的AHSV-4-VP5 蛋白(SEQ ID N0:52 58)的ClustalW比对。提供百分率同一性表。图39提供密码子优化的AHSV4-VP2(SEQ ID NO :04)对比野外分离AHSV4-VP2 (SEQ ID NO 48)的ClustalW比对。提供百分率同一性。图40提供密码子优化的AHSV4-VP5(SEQ ID NO :05)对比野外分离AHSV4-VP5 (SEQ ID NO 50)的ClustalW比对。提供百分率同一性。发明详述注意，在此公开及尤其在权利要求和/或段落中，术语例如“包括(comprises) ”， “包括(comprised)”，“包括(comprising) ”等可具有美国专利法中规定的含义；例如它们可表示“包括(includes)”，“包括(included) ”，“包括(including) ”等；及术语例如“基本上由构成”及“基本上由构成”具有美国专利法中规定的含义，例如它们允许不隐含叙述的成分，但排除见于现有技术或影响本发明的基本或新特征的成分。除非另有指明，根据常规利用使用技术术语。分子生物学中通常术语的定义可见于 Benjamin Lewin，基因 V.由 Oxford 大学出版社公开，1994(ISBN 0-19-854287-9); Kendrew 等人(eds. ), TheEncyclopedia of Molecular Biology,被 Blackwell Science Ltd.公开，1994 (ISBN 0-632-02182-9)；及 Robert A. Meyers (ed.) ,MolecularBiology and Biotechnology :a Comprehensive Desk Reference，由 VCH 出片反Jf， Inc. , 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。单数术语“a，” "an, ”及“the”包括复数个对象，除非上下文明显表示别的。类似地，词语“或”旨在包括“及”，除非上下文明显表示别的。词语“或”指特定列表中的任一成员及也包括成员列表的任何组合。靶物种或受试者(宿主)包括动物及人。本文所用的动物可选自马科动物(例如马)，犬科动物(例如狗，狼，狐狸，山狗，豺狗)，猫科动物(例如狮，虎，家猫，野生猫，其他大猫，及其他猫科动物包括猎豹及山猫)，羊科动物(例如羊)，牛科动物(例如牛)，猪科动物(例如猪)，禽类(例如鸡，鸭，鹅，火鸡，鹌鹑，雉鸡，鹦鹉，雀，鹰，乌鸦，鸵鸟，鸸鹋及鹤鸵)，灵长类动物(例如狐猴，跗猴，猴，长臂猿，人猿)，及鱼。术语“动物”也包括在发展的全部阶段中的个体动物，包括胚胎及胎儿阶段。
术语“多肽”及“蛋白”在本文中互换使用，指连续氨基酸残基的聚合物。术语“核酸”，“核苷酸”，及“多核苷酸”指RNA或DNA及其衍生物，例如含修饰的主链的那些。需知，本发明提供包括互补于本文所述的那些的序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以不同的方式制备(例如通过化学合成，通过基因克隆等)及可取各形式(例如线性或分支的，单链或双链，或其杂交体，引物，探针等)。术语“基因”广泛地使用，指与生物学功能相关的多核苷酸的任何段。由此，基因或多核苷酸包括内含子及外显子，如在基因组序列中，或仅编码序列如在cDNA中，例如开放阅读框(ORF)，从开始密码子(甲硫氨酸密码子)开始及在终止信号(终止密码子)终止。基因及多核苷酸也可包括调节它们的表达(例如转录起始，翻译及转录终止)的区。 由此，也包括的是启动子及核糖体结合区(一般而言这些调控元件位于编码序列或基因的开始密码子的上游的大致60和250个核苷酸之间；Doree SM等人；Pandher K等人；Chung JY等人)，转录终止子(一般而言终止子位于编码序列或基因的终止密码子下游的约50个核苷酸之内；Ward CK等人)。基因或多核苷酸也指表达mRNA或有功能的RNA，或编码特异性蛋白，及包括调控序列的核酸片段。本文所用的术语“免疫原性多肽”或“免疫原性片段”指包括等位基因特异性基序， 表位或其他序列的多肽或多肽的片段，以至于多肽或片段将结合MHC分子及诱导细胞毒性 T淋巴细胞(“CTL”)应答，和/或B细胞应答(例如，抗体产生)，和/或T辅助细胞淋巴细胞应答，和/或对衍生出免疫原性多肽或免疫原性片段的抗原的延迟的类型超敏反应 (DTH)应答。DTH应答是免疫反应，其中T细胞依赖性巨噬细胞活化及发炎导致组织损伤。 对抗原的皮下注射的DTH反应常用作细胞介导的免疫的测定。通过定义，表位是一旦施用于宿主免疫学活跃的抗原决定簇，其能引发体液(B细胞)和/或细胞类型(T细胞)的免疫应答。这些分子上的有抗原性的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽上的特定抗原性表位。特异性地，表位的非限制性实施例包括多肽中的四 五肽序列，多糖中的三 五个糖苷序列。在动物中，多数抗原将同时存在几种或甚至许多抗原决定簇。所述多肽也可定性为免疫原性多肽及表位可在下文中进一步鉴定。本文所用的术语“纯化的”不要求绝对纯度；旨在表示相对纯度。由此，例如，纯化的多肽制剂是多肽相比多肽在其天然的环境中更富含的多肽制剂。多肽制剂基本上纯化的，以至于多肽代表制剂的总多肽含量的至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少 95%，或至少98%的几个实施方式。多核苷酸也相同。本文中公开的多肽可通过本领域中已知的任何手段纯化。重组多核苷酸是指不是天然存在的或具有通过序列的2种别样分离的段的人工的组合制备的序列的序列的多核苷酸。此人工组合常通过化学合成或，更通常，通过核酸的分离的段的人工操作，例如，通过遗传加工技术实现。在一实施方式中，重组多核苷酸编码融合蛋白。一方面，本发明提供来自非洲马疫病毒的多肽。另一方面，本发明提供具有如SEQ ID NO :1，2，20，21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62 或 63
所示的序列的多肽，及其变体或片段。如本文所用，术语“非洲马疫病毒蛋白或非洲马疫病毒多肽(AHSV VP)”可包括 AHSV VPl, VP2，VP3，VP4，NSl, VP5，VP6，VP7，NS2, NS3，及它们的同源物，片段及变体。
来自非洲马疫病毒的病毒蛋白的同源物旨在在本发明的范围内。如本文所用，术语“同源物”包括直系同原物，类似物及旁系同原物。术语“类似物”指2种多核苷酸或多肽具有相同的或类似功能，但在不相关的生物中独立地进化。术语“直系同原物”指2种多核苷酸或多肽来自不同的物种，但通过物种形成进化自的共同的祖先基因。正常情况下，直系同原物编码具有相同的或类似功能的多肽。术语“旁系同原物”指2种多核苷酸或多肽通过在基因组之内复制而相关。旁系同原物通常具有不同的功能，但这些功能可相关。野生型非洲马疫病毒多肽的类似物，直系同原物，及旁系同原物可在翻译后修饰，在氨基酸序列差异，或在两者上不同于野生型非洲马疫病毒多肽。尤其是，本发明的同源物将通常与全部或部分野生型非洲马疫病毒多肽或多核苷酸序列呈现至少80 85%，85 90%，90 95%，或95%，96%，97%，98%，99%序列同一性，及将呈现类似功能。另一方面，本发明提供与具有如SEQ ID NO 1，2，20，21，30，31，35，36，44，45，49， 51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62或63所示的序列的多肽具有至少70%,至少 75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的 AHSV VP。在另一方面，本发明提供以上鉴定的AHSV VP的片段及变体(SEQ ID NO :1,2,20, 21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，或 63)，其可由本领
于技术人员之一使用熟知的分子生物学技术容易制备。变体是具有与如SEQ ID NO 1，2，20，21，30，31，35，36，44，45，49，50，51，52，53， 54，55，56，57，58，59，60，61，62，或 63 所示的氨基酸序列具有至少 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95%，96%，97%，98%，或99%同一性的氨基酸序列的同源AHSV VP。变体包括等位变体。术语"等位变体"指含导致蛋白的氨基酸序列变化及在天然的群(例如病毒物种或变种)之内存在的多态性的多核苷酸或多肽。所述天然的等位基因变化可一般在多核苷酸或多肽中导致1 5%变异。等位变体可通过在许多不同的物种中测序目的核酸序列来鉴定，其可通过使用在那些物种中鉴定相同的基因遗传座位的杂交探针轻易进行。是天然的等位基因变异及不改变基因的功能活性(如果感兴趣)的结果的任何及全部所述核酸变化及得到的氨基酸多态性或变化旨在在本发明的范围之内。变体是任何来自非洲马疫病毒的多肽，能在用此多肽特异性免疫接种的动物(例如马科动物)中诱导以用非洲马疫病毒刺激之后分泌干扰素Y(IFN-Y)为特征的基于细胞的免疫应答。所述IFN-γ分泌可使用体外方法(i.e.来自的R&D SYSTEMS Inc.的 QUANTIKINE 免疫测定(货号 #CAIF00) ；Djoba Siawaya JF 等人)展示。如本文所用，术语"衍生物"或“变体”指多肽，或编码多肽的核酸，其具有一个或多个保守氨基酸变化或其他小的修饰，以至于(1)相应多肽相比野生型多肽具有基本上相当的功能或( 针对多肽产生的抗体与野生型多肽是免疫反应性的。这些变体或衍生物包括具有非洲马疫病毒的多肽一级氨基酸序列的可产生相比未修饰的多肽具有基本上相当的活性的肽的小的修饰的多肽。所述修饰可为精细的，如通过定点诱变，或可自发。术语 “变体”还涵盖序列的缺失，添加及取代，只要多肽发挥功能而产生本文定义的免疫学应答。非洲马疫病毒多肽的免疫原性片段包括具有如SEQ ID NO =1,2,20,21,30,31,35, 36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，或其变体所示的序列的非洲马疫病毒的多肽的至少8，10，15，或20个连续氨基酸，至少21个氨基酸，至少23个氨基酸，至少25个氨基酸，或至少30个氨基酸。在另一实施方式中，非洲马疫病毒的片段包括见于全长非洲马疫病毒多肽的特异性抗原性表位。测定多肽及表位的片段的方法例如，产生重叠肽库(Hemmer B.等人)， Pepscan (Geysen H. M.等人，1984 ;Geysen H. Μ.等人，1985 ;Van der Zee R.等人；Geysen H. Μ.)及算法(De Groot Α.等人；Hoop Τ.等人；Parker K.等人)可用于本发明的实践， 无需过多的实验。一般而言，抗体特异性地结合特定抗原性表位。特异性地，表位的非限制性实施例在多肽中包括四 五肽序列，在多糖中包括三 五糖苷序列。在动物中，多数抗原将同时存在几个或甚至许多抗原决定簇。优选其中所述表位是更大分子的蛋白片段，其将与总蛋白具有基本上相同的免疫学活性。另一方面，本发明提供编码AHSV VP的多核苷酸，例如编码具有如SEQ ID NO 1, 2，20，21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63 所示的序列的AHSV VP的多核苷酸。另一方面，本发明提供多核苷酸编码与具有如SEQ ID NO =1,2,20, 21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63 所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98% 或99%序列同一性的多肽，或包括这些多肽之一的至少8或至少10个连续氨基酸的保守变体，等位变体，同源物或免疫原性片段，或这些多肽的组合。另一方面，本发明提供具有如SEQ ID NO :3，4，5，6，17，18，19，22，27，28，29，32， 33，34，41，42，43，48，50所示的核苷酸序列的多核苷酸，或其变体。在另一方面，本发明提供与具有如 SEQ ID NO :3,4,5,6,17，18，19，22，27，28，29，32，33，34，41，42，43，48，50 所示的序列的多核苷酸之一具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少 95 %，至少95 %，96 %，97 %，98 %或99 %序列同一性的多核苷酸，或其变体。这些多核苷酸可包括编码AHSV VP的DNA，cDNA,及RNA序列。应知，编码非洲马疫病毒多肽的全部多核苷酸也包括的本文中，只要它们编码具有可识别的活性(例如结合到识别多肽的抗体，针对多肽的免疫应答诱导，或当施用于暴露于非洲马疫病毒或经历非洲马疫的体征或症状的降低的受试者时对非洲马疫的存活的效应)的多肽。本公开的多核苷酸包括作为遗传密码的结果简并的序列，例如对特异性宿主的优化的密码子利用。如本文所用，“优化的”指经遗传加工以增加其在给定物种中表达的多核苷酸。为提供编码非洲马疫多肽的优化的多核苷酸，可将非洲马疫病毒蛋白基因的DNA序列修饰为(1)包括在特定物种中高度表达的基因中优选的密码子；( 包括基本上见于所述物种的核苷酸碱基成分的A+T或G+C含量；C3)形成所述物种的起始序列；或(4)消除导致去稳定，不适当的多聚腺苷酸化，RNA的降解及终止，或形成二级结构发卡或RNA剪接位点的序列。非洲马疫蛋白在所述物种中的增加的表达可通过利用真核生物及原核生物，或特定物种中密码子利用的分布频度实现。术语“优选的密码子利用的频度”指由特异性宿主细胞在指定给定氨基酸的核苷酸密码子的利用中呈现的偏好。有20种天然氨基酸，多数被多于一种密码子指定。因此，全部简并核苷酸序列包括在本公开中，只要由核苷酸序列编码的非洲马疫病毒多肽的氨基酸序列在功能性未变。2个氨基酸序列之间的序列同一性可建立通过NCBI (美国生物技术信息中心)配对blast和blosum62矩阵，使用标准参数(见，例如在〃美国生物技术信息中心〃(NCBI， Bethesda,Md.，美国)服务器上可用的BLAST或BLASTX算法，以及Altschul等人；及由此，此文献说道通过术语“blasts”使用算法或BLAST或BLASTX及BL0SUM62矩阵)。也可使用Myers和Miller的“比对”程序(及在NCBI可用)以及经hternet在其上的网站(例如NCBI网站)可用的相同的或其他程序测定2个核苷酸序列之间的序列同一性(“线性空间中的最佳比对”，CABIOS 4,11 ~ 17，1988)。另外，术语“同一性”，例如，关于核苷酸或氨基酸序列的同一性，可表示2个序列之间的同源性的定量测量。百分比序列同源性可计算为=(Nref^dif)女100/Nref，其中 是比对时2个序列中的非同一残基总数，并且其中是是序列之一的残基的数。因此，DNA 序列AGTCAGTC将与序列AATCAATC具有75%序列同一性(Nref = 8 ；Ndif = 2)。另外，关于序列的“同一性”可指相同的核苷酸或氨基酸除以2个序列的较短者中核苷酸或氨基酸数的位置的数，其中2序列的比对可根据Wilbur及Lipman算法测定(Wilbur及Lipman)，例如，使用20个核苷酸的窗尺寸，4个核苷酸的字长，及4的空位罚分，及计算机辅助分析及序列数据(包括比对)的解释可使用可商购的程序(例如 Intelligenetics Suite, Intelligenetics Inc. CA)方便地进行。当 RNA 序列类似，或与 DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性，DNA序列中的胸苷(T)认为是等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。由此，RNA序列在本发明的范围之内及可源于DNA序列，通过将DNA序列中的胸苷(T)考虑为等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。2个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或2个核苷酸序列之间的序列同一性可使用 Vector NTI 软件套装测定 Gnvitrogen，1600 Faraday Ave.，Carlsbad, CA)。以下文献提供比较序列的相对同一性或同源性的算法，及附加地或替代性地关于前述，这些参考文献中的教导可用于确定百分比同源性或同一性=Needleman SB及^msch CD ；Smith TF R Waterman MS ；Smith TF, Waterman MS^ Sadler JR ；Feng DF^Dolittle RF ；Higgins DG 及 Sharp PM ；Thompson JD, Higgins DG 及 Gibson TJ -,]^, Devereux J, Haeberlie P及Smithies 0.及，无需过多实验，本领域技术人员可借助许多确定百分比同源性的其他程序或参考文献。将非洲马疫病毒多核苷酸可包括合入载体的重组DNA，进入自主复制质粒或病毒， 或进入原核生物或真核生物的基因组DNA，或作为(例如，cDNA)独立于其他序列的独立的分子存在。本文中公开的重组载体可包括编码多肽，其变体或其片段的多核苷酸。重组载体可包括质粒及病毒载体，及可用于体外或体内表达。重组载体还可包括信号肽。信号肽是引导蛋白(胞质溶胶中合成的)翻译后转运到某些细胞器例如细胞核，线粒体基质，内质网， 叶绿体，离质体及过氧化物酶体的短肽链(3 60个氨基酸长)。信号序列可为来自非洲马疫病毒蛋白的天然的序列或来自分泌的蛋白的肽信号，例如来自组织纤溶酶原活化物蛋白 (tPA)的信号肽，尤其是人 tPA (S. Friezner Degen 等人；R. Rickles 等人；D. Berg.等人)， 或来自胰岛素样生长因子1 (IGFl)的信号肽，尤其是马IGFl (K. Otte等人)，狗IGFl (P. Delafontaine 等人)，猫 IGFl (W003/022886)，牛 IGFl (S. Lien 等人)，猪 IGFl (M. Muller 等人)，鸡 IGFl (Y. Kajimoto 等人)，火鸡 IGFl (GenBank 登录号 AF074980)。来自 IGFl 的信号肽可为天然的或优化的，其可通过去除隐含的剪接位点和/或通过适应密码子利用来实现。翻译之后，可在切割位点切割未处理的多肽，以产生成熟的多肽。切割位点可使用Von Heijne的方法(1986)预测。
质粒可包括DNA转录单元，例如允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制原点(原核或真核生物)。质粒也可包括一个或多个可选择的标记物基因及本领域中已知的其他遗传元件。本公开内容中含盖环形及线性形式的质粒。在其他方面，本发明涉及用于在用组合物接种的宿主动物中诱导免疫学或保护应答的疫苗组合物或药物组合物。组合物包括载质或稀释剂或赋形剂和/或佐剂，及重组载体，例如重组病毒。重组病毒可为修饰的重组病毒；例如，灭活的病毒的重组体(例如分裂的或缺失的)病毒编码的遗传功能。修饰的重组病毒可为灭活病毒编码的非必要的遗传功能；例如，从而重组病毒具有衰减的毒力及增强的安全性。本发明的组合物中使用的病毒有利地是痘病毒，例如痘苗病毒或浣熊痘病毒或优选禽痘病毒，例如鸡痘病毒或更优选金丝雀痘病毒；及更有利地，ALVAC病毒。重组载体或重组病毒不在哺乳动物物种中复制而具有表达是有利的。另一方面，本发明涉及包括至少一种编码一种或多种非洲马疫病毒(AHSV) 抗原的核酸分子的重组载体。其还涉及包括对在受试者中引起保护免疫应答来说有效量的包括至少一种编码一种或多种非洲马疫病毒(AHSV)抗原的核酸分子的重组禽痘病毒载体的疫苗或免疫原性组合物。其还涉及针对非洲马疫病毒相应疫苗接种受试者的方法。使用的药学可接受的媒质或赋形剂是常规的。E. W. Martin，Mack Publishing Co. , Easton, PA, 15th Edition 的 Remington'sPharmaceutical Sciences (1975)描述了适宜于本文中公开的多肽，质粒，病毒载体的药学递送的组合物及制剂。一般而言，媒质或赋形剂的性质将取决于采用的特定施用模式。例如，肠胃外制剂通常包括包含药学及生理学可接受的流体(例如水，生理盐水，平衡的盐溶液，含水右旋糖，甘油等)的可注射的流体作为媒质。作为固体组合物(例如，冻干的锭剂，粉末，丸剂，片剂，或胶囊形式)，常规非毒性固体媒质或赋形剂可包括，例如，药学级甘露糖醇，乳糖，淀粉，或硬脂酸镁。除了生物学中性媒质或赋形剂之外，待施用的免疫原性组合物可含少量的非毒性助剂物质，例如润湿剂或乳化剂，防腐剂，及PH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨糖醇酐单月桂酸酯。根据本发明的组合物或疫苗可包括包含如上所述的本发明的编码一种或多种 AHSV VP的一或多种多核苷酸的载体。可在相同的载体中使用不同的插入位点或使用相同的插入位点进行多个插入。当使用相同的插入位点时，可将各多核苷酸插入子(其可为前述本发明的任何多核苷酸)在相同的和/或不同的启动子的控制下插入。插入可尾尾，头头，尾头，或头尾进行。IRES元件(内部Ribosome Entry位点，见EP 0803573)也可用于分离及，以表达可操作连接到相同的和/或不同的启动子的多个插入子。在一实施方式中，本发明涉及包括一或多种前述核苷酸的表达载体。表达载体可为体内表达载体，或体外表达载体。在一实施方式中，重组载体或病毒可包括编码一种或多种非洲马疫病毒(AHSV) 抗原，免疫原的一种或多种异源核酸分子，包括表位或其片段。重组载体或修饰的重组病毒可包括，例如在病毒基因组之内，例如病毒基因组的非必需区之内，编码免疫原性蛋白的异源DNA序列，例如源于非洲马疫病毒蛋白的，例如AHSV VPl, VP2，VP3，VP4，NSl, VP5，VP6， VP7，NS2，NS3或任何它们的组合，优选AHSV VP2及5，(其中所述免疫原性蛋白可为目的表位,例如来自由 AHSV VPl, VP2, VP3, VP4, NSl, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3 的任何一种或多种表达的蛋白的目的表位，例如来自AHSV VP2和/或5的目的表位)。载体或病毒有利地是痘病毒，例如痘苗病毒或优选禽痘病毒，例如鸡痘病毒或更优选金丝雀痘病毒；及更有利地， ALVAC病毒。在另一实施方式中，编码一种或多种非洲马疫病毒(AHSV)抗原，免疫原，包括表位或片段其的异源核酸分子，例如源于非洲马疫病毒蛋白的，例如AHSV VP1，VP2，VP3，VP4， NSl, VP5，VP6，VP7，NS2, NS3或任何它们的组合，优选AHSV VP2及5，(其中所述免疫原性蛋白可为目的表位，例如来自由AHSV VP1，VP2，VP3，VP4，NSl, VP5, VP6，VP7，NS2,或NS3的任何一种或多种表达的蛋白的目的表位，例如来自AHSV VP2和/或5的目的表位)可操作连接到启动子序列及任选连接到增强子。在有利的实施方式中，启动子序列选自H6牛痘病毒启动子，I3L牛痘病毒启动子，4 (痘病毒启动子，7. 牛痘病毒启动子，及π牛痘病毒启动子。更有利地，启动子序列是Η6牛痘病毒启动子或4 (痘病毒启动子。更优选地，VP2 可操作连接到H6牛痘病毒启动子，并且VP5可操作连接到4 痘病毒启动子。在另一实施方式中，将编码一种或多种非洲马疫病毒(AHSV)抗原，免疫原，包括表位或其片段，例如源于非洲马疫病毒蛋白的，例如AHSV VPl，VP2，VP3，VP4，NSl，VP5，VP6， VP7, NS2, NS3，或任何它们的组合，优选AHSV VP2及5，(其中所述免疫原性蛋白可为目的表位，例如来自由 AHSV VPl，VP2，VP3，VP4，NSl，VP5，VP6，VP7，NS2，或 NS3 的任何一种或多种表达的蛋白的目的表位，例如来自AHSV VP2和/或5的目的表位)的异源核酸分子插入包括插入座位的载体，其中所述座位包括C5和/或C6和/或C3，且其中所述C6，C5和/ 或C3插入座位的侧翼序列促进有同源的插入座位的非洲马疫病毒抗原的同源重组。在另一实施方式中，将编码一种或多种非洲马疫病毒(AHSV)抗原，免疫原，包括表位或其片段，例如源于非洲马疫病毒蛋白的，例如AHSV VPl，VP2，VP3，VP4，NSl，VP5，VP6， VP7, NS2, NS3，或任何它们的组合，优选AHSV VP2及5，(其中所述免疫原性蛋白可为目的表位，例如来自由 AHSV VPl，VP2，VP3，VP4，NSl，VP5，VP6，VP7，NS2，或 NS3 的任何一种或多种表达的蛋白的目的表位，例如来自AHSV VP2和/或5的目的表位)的异源核酸分子插入包括插入座位的载体中，其中所述座位包括C5和/或C6和/或C3，并且其中所述C6，C5 和/或C3插入座位的侧翼序列促进有同源插入座位的非洲马疫病毒抗原的同源重组，且其中所述侧翼序列包括禽痘病毒的C3L及C3R开放阅读框。在另一实施方式中，禽痘病毒载体是VCP2377或vCP2383或vCP2398。本发明的实施将采用，除非另有说明，分子生物学，微生物学，细菌学，重组DNA技术，及免疫学的常规技术，它们在本领于技术人员之内。文献中完全解释技术所述(见，例 tU Sambrook, et al. 1989 ；1985 ；M. J. Gait ed. 1984 ；B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984 ； R. K. Freshney ed. 1986 ；IRL press, 1986 ；Perbal,B.，1984 ；及D. M. Weir及C. C. Blackwell eds.，1986)。一方面，本发明提供重组载体，例如病毒，例如其中含来自非洲马疫病毒的DNA序列的，例如在病毒(例如痘病毒)基因组，有利地病毒的非必需区，例如痘病毒基因组的重组痘病毒。痘病毒可为痘苗病毒，例如NYVAC或基于NYVAC的病毒；及痘病毒有利地是禽痘病毒，例如鸡痘病毒，尤其衰减的鸡痘病毒，例如TR0VAC，或金丝雀痘病毒，优选衰减的金丝雀痘病毒，例如ALVAC。但是，本发明中的载体可为任何适宜重组病毒或病毒载体，例如痘病毒(例如痘苗病毒，禽痘病毒，金丝雀痘病毒，鸡痘病毒，浣熊痘病毒，猪痘病毒等)，腺病毒 (例如犬腺病毒)，疱疹病毒，杆状病毒，反转录病毒等(如在通过引用合并到本文中的文献
14中)；或载体可为质粒。重组病毒可为修饰的重组病毒；例如，已灭活(例如分裂的或缺失的)病毒编码的遗传功能的病毒的重组。修饰的重组病毒可灭活了病毒编码的非必需遗传功能；例如， 从而重组病毒具有衰减的毒力及增强的安全性。本发明的组合物中使用的病毒有利地是痘病毒，例如痘苗病毒或优选禽痘病毒，例如鸡痘病毒或更优选金丝雀痘病毒；及更有利地， ALVAC病毒。重组载体或重组病毒无需在哺乳动物物种中复制而具有表达是有利的。在一个特定实施方式中，病毒载体是痘病毒，例如痘苗病毒或衰减的痘苗病毒， (例如，MVA, Ankara疫苗株在鸡胚胎成纤维细胞上多于570代后得到的修饰的Ankara株； 见 Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. ffschr. , 1971,113,1149-1153 ；Sutter et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，1992，89，10847-10851 ；作为 ATCC VR-1508 可用的；或 NYVAC，见U. S.专利No. 5，494，807，例如，讨论NYVAC构建的U. S.专利No. 5，494，807的实施例1 6及et seq,以及有额外的ORF从Copenhagen株痘苗病毒基因组缺失的NYVAC的变化，以及异源编码核酸分子插入此重组位点，而且，使用匹配的启动子；也见W096/40241)， 禽痘病毒或衰减的禽痘病毒(例如金丝雀痘病毒，鸡痘病毒，鸽痘病毒，鸽痘病毒，鹌鹑痘病毒，ALVAC或TROVAC ；见，例如U. S.专利No. 5，505, 941，5，494，807)，猪痘病毒，浣熊痘， 骆驼痘病毒，或多发性黏液瘤病毒病毒。重组痘病毒可在本领域中已知的及类似于创建合成的痘病毒(例如描述于美国专利 No. 4，769，330 ;4，722，848 ;4，603，112 ;5，110，587 ;5，174，993 ;5，494，807 ； 5，942，235，及5，505，941(将它们的公开内容通过引用并入本文)的痘苗病毒及禽痘病毒)的重组体的方法的2步骤中构建。或者，制备和/或施用用于本发明的基因的基因产物的体内或体外表达的载体或重组体或质粒的方法可为任何期望的方法，例如通过或类似于下列中公开于，或公开于下列中引用的文献的方法的方法美国专利
Nc 6,L30, 066,5, 494，807,5, 514，375,5, 744，140,5, 744，141,5，756，103,5762938，5，766，5 9 9 j 5 j990，091,6，004，777,6，130，066,6，497，883,6，464，984,6，451，770，6，391314,6,387，376,6，376，473,6，368，603,6，348，196,6,306，400,6，228，846，6，221362,6,217，883,6，207，166,6,207，165,6,159，477,6，153，199,6,090，393，6，074649,6，045，803,6，033，670,6，485，729,6，103，526,6，224，882,6，312，682，6，312683,6，348，450,4，603，112 ；4,769，330 ；5，174，993 ；5，505，941 ；5，338，683 ；5，494807 ；4,394，448 ；4，722，848 ；4，745，051 ；4，769，331 ；5，591，639 ；5，589，466 ；
4，945，050 ；5，677，178 ；5，591，439 ；5，552，143 ；5，580，859 ；WO 94/16716 ；WO 96/39491 ； W091/11525 ；WO 98/33510 ；WO 90/01543 ；EP 0 370 573 ；EP 265785 ； (Paoletti 1996)； (Moss 1996) ；Richardson(Ed 1995) ； (Smith,Summers et al. 1983) ； (Pennock,Shoemaker et al. 1984) ； (Roizman 1996) ； (Andreansky, He et al. 1996) ； (Robertson, Ooka et al.1996) ； (Frolov,Hoffmanet al. 1996) ； (Kitson,Burke et al. 1991) ； (Ballay,Levrero et al. 1985) ；(Graham 1990) ；(Prevec, Schneider et al. 1989) ；(Feigner, Kumaret al.1994) ； (Ulmer, Donnelly et al. 1993) ； (McClements, Armstronget al. 1996) ； (Ju, Edelstein et al. 1998)；及(Robinson 及 Torres 1997)。 在本发明的载体中有利地存在用于多核苷酸的表达的元件。以最小方式，此包括， 基本上由，或由起始密码子(ATG)，终止密码子及启动子，及任选也多聚腺苷酸化序列(对于某些载体(例如质粒及某些病毒载体(例如不同于痘病毒的病毒载体))构成。当多核苷酸编码蛋白片段，例如有利地，在载体中，ATG放置在阅读框的5'及终止密码子放置在 3'。其他用于控制表达的元件可存在，例如增强子序列，稳定序列及允许蛋白的分泌的信号序列。专利申请WO 90/11092，WO 93/19183，WO 94/21797 及 WO 95/20660 已利用最近开发的多核苷酸疫苗的技术。已知这些疫苗使用能在宿主细胞中表达插入到质粒的抗原的质粒。推荐全部施用途径(腹膜内，静脉内，肌内，经皮，真皮内，粘膜及如)。也可使用疫苗接种的各手段，例如DNA沉积在金粒子的表面及投射穿过动物皮肤(Tang等人，1992) 及使可能转染皮肤，肌肉，脂肪组织以及乳腺组织的液体推注器(Furth等人，199 .(也见 U. S. Pat. Nos. 5，846，946，5，620，896，5，643，578，5，580，589，5，589，466，5，693，622， 及 5，703，055 ；Ulmer, J. B.，等人，1993 ；Robinson 等人，1997 ；Luke 等人 1997 ；Normanet al. 1997 ；Bourne等人，1996 ；及，注意，通常用于疫苗或免疫学组合物的质粒可包括DNA编码抗原可操作连接于调控序列(其控制抗原从宿主细胞(例如哺乳动物细胞)的表达或表达及分泌；例如，从上游到下游，用于启动子的DNA，用于分泌的用于真核前导肽的DNA，用于抗原的DNA，及编码终止子的DNA)。根据另一本发明的实施方式，痘病毒载体是金丝雀痘病毒或鸡痘病毒载体，有利地衰减的金丝雀痘病毒或鸡痘病毒。对此，参照以登录号VR-Ill获自ATCC的金丝雀痘病毒。衰减的金丝雀痘病毒描述于美国专利No. 5，756，103 (ALVAC)及W001/05934。多种鸡痘病毒疫苗接种株也可用，例如由MERIAL销售的DIFTOSEC CT株及由INTERVET销售的NOBILIS VARI0LE疫苗；及，也参照美国专利No. 5，766，599，其涉及衰减的鸡痘病毒株 TROVAC0当表达载体是痘苗病毒，对于待表达的多核苷酸的插入位点可在胸苷激酶(TK) 基因或插入位点，血凝素(HA)基因或插入位点，编码A型包含体(ATI)的区；也见本文中引用的文献，尤其涉及痘苗病毒的那些。金丝雀痘病毒的情况中，插入位点可为ORF C3，C5和 /或C6 ；也见本文中引用的文献，尤其涉及金丝雀痘病毒的那些。鸡痘病毒的情况中，插入位点可为ORF F7和/或F8 ；也见本文中引用的文献，尤其涉及鸡痘病毒的那些。对于MVA 病毒区的插入位点可如在各出版物中，包括Carroll Μ. W. et al.，Vaccine，1997，15 (4)， 387-394 ；Stittelaar K. J. et al. , J. Virol.,2000,74(9),4236-4243；Sutter G. et al.， 1994，Vaccine, 12 (11)，1032-1040 ；及，此情况中，应注意，完全MVA基因组描述于Antoine G.，Virology, 1998, 244, 365 396，其能使本领域技术人员使用其他插入位点或其他启动子。在本发明的另一实施方式中，待表达的多核苷酸在特异性痘病毒启动子的控制下插入，尤其是例如牛痘病毒启动子7. 5kDa(Cochran等人，J. Virology，1985，54，30 35)，牛痘病毒启动子 I3L (Riviere 等人，J. Virology，1992，66，3424-3434)，牛痘病毒启动子 HA(Shida，Virology, 1986,150,451 457)，牛痘启动子 ATI (Funahashi 等人，J. Gen. Virol.，1988，69，；35 47)，牛痘病毒启动子 H6 (Taylor J.等人，疫苗，1988，6，504 508 ；Guo P. et al. J. Virol. , 1989,63,4189-4198 ；Perkus M.等人，J. Virol.，1989，63， 3829-3836)。在另一实施方式中，病毒载体是腺病毒，例如人腺病毒(HAV)或犬腺病毒(CAV)。
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可将基于重组病毒载体的疫苗组合与fMLP(N_甲基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸；美国6，017, 537)和/或卡波姆佐剂(Pharmeuropa Vol)。在另一实施方式中，病毒载体可为，但不限于，人，猪，绵羊，牛，或禽类的腺病毒。对于人腺病毒，尤其是由于缺失病毒基因组的El区，尤其是从约核苷酸459 约核苷酸3510(通过引用以登录号M73260的序列公开于GenBank的hAd5及在参照的出版物 J. Chroboczek et al Virol。1992，186,280 沘5中)而无法复制的第5血清型腺病毒。 缺失的腺病毒在表达 El 的 293 (F. Graham et al J. Gen. Virol. 1977，36，59 72)或 PER 细胞，尤其是PER. C6中繁殖(F. Fallouxet al人基因治疗1998，9，1909-1917)。人腺病毒可在E3区缺失，尤其是从约核苷酸观592 约核苷酸30470。El区的缺失可与E3区中的缺失进行组合(见，例如 J. Shriver et al. Nature, 2002,415, 331-335, F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vol. 7 :Gene Transferand Expression Protocols Edited by E. Murray, The Human Press Inc,1991, ρ 109-128 ；Y. Ilan et al Proc. Natl. Acad. Sci.1997,94,2587-2592 ；US6, 133, 028 ；US6, 692, 956 ；S.Tripathy et al Proc.Natl. Acad.Sci.1994，91，11557-11561 ；B.Tapnell Adv.Drug Deliv.Rev. 1993，12，185-199 ； X. Danthinne et al Gene Therapy 2000,7,1707-1714 ；K.Berkner Bio Techniques 1988, 6,616-629 ；K.Berkneret al Nucl. Acid Res. 1983,11,6003-6020 ；C.Chavier et al J. Virol. 1996，70，4805-4810)。插入位点可为最终El和/或E3区的部分或完全缺失后的 El和/或E3座位(区)。当表达载体是腺病毒时，可将待表达的多核苷酸在真核细胞中有功能的启动子控制下插入，例如强启动子，例如巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV-IE 启动子)，尤其是M. Boshart et al Cell 1985，41，521-530中的从约核苷酸_7；34 约核苷酸+7的增强子/启动子区或来自来自！Iomega Corp的pCI载体的增强子/启动子区。 CMV-IE启动子有利地是鼠或人来源的。也可使用延伸因子Ia的启动子。也可使用肌肉特异性启动子(X.Li et al Nat. Biotechnol. 1999，17，241 M5)。本文中与质粒载体相关也讨论强启动子。在一实施方式中，剪接序列可位于增强子/启动子区的下游。例如，内含子 1 分离自 CMV-IE 基因(R. Stenberg et al J. Virol. 1984，49，190)，内含子分离自兔或人珠蛋白基因，尤其是来自珠蛋白基因的内含子2，内含子分离自免疫球蛋白基因，来自SV40早期基因的剪接序列或分离自来自!Iomega Corp.的pCI载体的嵌合内含子序列，其包括融合到小鼠免疫球蛋白受体序列的人β-珠蛋白基因供体序列(在Genbank 中以登录号CVU47120的从约核苷酸890 约核苷酸1022)。可将聚(A)序列及终止子序列插入待表达的多核苷酸下游，例如牛生长激素释放激素基因，尤其是在Genbank中以登录号B0VGHRH(AF242855)的从约核苷酸2339 约核苷酸2550，兔β -珠蛋白基因或SV40晚期基因多聚腺苷酸化信号。在另一实施方式中，病毒载体是犬腺病毒，尤其是CAV_2(见，例如L.Fischer et al. Vaccine,2002，20，3485—3497 ；U. S. Patent No. 5，529，780 ；U. S. Patent No. 5，688，920 ； PCT申请No. W095/14102)。对于CAV而言，插入位点可在E3区中和/或在位于E4区和右 ITR区之间的区内(见U. S.专利No. 6，090，393 ；U. S.专利No. 6，156，567)。在一实施方式中，插入子在启动子的控制下，例如巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV-IE启动子)或已对于人腺病毒载体描述的启动子。可将聚(A)序列及终止子序列插入待表达的多核苷酸下游，例如牛生长激素基因或兔珠蛋白基因多聚腺苷酸化信号。
在另一特定实施方式中，病毒载体是疱疹病毒，例如马疱疹病毒(EHV1-5)，猪疱疹病毒(PRV)，犬疱疹病毒(CHV)或猫疱疹病毒(FHV)。插入位点可在胸苷激酶基因内，0RF3 内或UL43 ORF内(对于CHV，见U. S.专利No. 6，159，477)。在一实施方式中，待表达的多核苷酸在真核细胞内有功能的启动子控制下插入，有利地CMV-IE启动子(鼠或人)。聚(A) 序列及终止子序列可插入待表达的多核苷酸下游，例如牛生长激素或兔珠蛋白基因多聚腺苷酸化信号。更一般而言，本发明含盖包括含及在宿主中体内表达非洲马疫病毒多肽，其变体或片段的多核苷酸或基因，及必要于其体内表达的元件的任何质粒的体内表达载体 (ΕΡ-Α2-1001025 ；Chaudhuri P.)。根据进一步本发明的实施方式，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，尤其是体内表达载体。特别地，非限制性实施例，可将PVR1020或1012质粒(VICAL Inc. ；Luke C. et al. , Journal ofInfectious Diseases,1997,175,91-97 ；Hartikka J. et al. , Human GeneTherapy，1996，7，1205-1217，see, e. g.，U. S. Patent Nos. 5，846，946 and6, 451，769) 用作插入多核苷酸序列的载体。PVR1020质粒源于pVR1012及含人tPA信号序列。在一实施方式中，人tPA信号包括在Genbank中以登录号HUMTPA14的从氨基酸M(I)到氨基酸S(23)。在另一特殊的，非限制性实施例中，用作用于多核苷酸序列插入的载体的质粒可含在Genbank中以登录号U28070的从氨基酸W24)到氨基酸M48)的马IGFl的信号肽序列。发现了可在实践中商讨或采用的对于DNA质粒的附加信息，例如，在美国专利 No. 6，852，705 ；6，818，628 ；6，586，412 ；6，576，243 ；6，558，674 ；6，464，984 ；6，451，770 ； 6，376，473 及 6，221，362 中。如本文所用，术语“质粒”可包括包括本发明的多核苷酸及必要于其在期望的宿主或靶细胞内体内表达的元件的任何DNA转录单元；及，关于此，注意到，超螺旋的或非超螺旋的，环形质粒，以及线性形式，旨在在本发明的范围之内。质粒也可包括其他转录调节元件例如，内含子类型的稳定序列。在几个实施方式中，质粒可包括CMV-IE (W0 89/01036)的第一内含子，兔β-珠蛋白基因(van Ooyen等人)的内含子II，由组织纤溶酶原活化物编码的蛋白的信号序列(tPA ；Montgomery等人)，和/或多聚腺苷酸化信号(多聚A)，尤其是牛生长激素(bGH)基因(美国5，122，458)的多聚A或兔β -珠蛋白基因的或SV40病毒的多聚Α。各质粒包括或含或基本上由下列构成，除了编码AHSV抗原，表位或免疫原的多核苷酸之外，任选与异源肽序列，变体，类似物或片段融合，可操作连接到启动子或在启动子的控制下或依赖于启动子。一般而言，采用在真核细胞中有功能的强启动子有利。优选的强启动子是人或鼠来源的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，或任选具有另一来源，例如大鼠或豚鼠。CMV-IE启动子可包括实际启动子部分，其可或可不相关于增强子部分。可参考 ΕΡ-Α-260 148，ΕΡ-Α-323 597，U. S.专利 Nos. 5，168，062，5，385，839，及 4，968，615，以及参考 PCT 申请No W087/03905。CMV-IE 启动子有利地是人CMV-IE(Boshart M. et al. ,Cell.， 1985,41,521-530)或鼠CMV-IE。可在本发明的实践中有用地采用的强细胞启动子是细胞骨架基因启动子，例如结蛋白启动子(Kwissa M.等人)，或肌动蛋白启动子(Miyazaki J.等人)。这些启动子的有功能的亚片段，即维持足够的启动子活性的这些启动子的部分， 包括在本发明中，例如根据WO 98/00166或US6，156，567的截短的CMV-IE启动子及可用于本发明的实践。结果，本发明的实践中有用的启动子可包括维持足够的启动子活性及因此发挥启动子的作用的全长启动子的衍生物和/或亚片段，及其可有利地具有基本上类似于衍生出衍生物或亚片段的实际或全长启动子的启动子活性，例如相比全长CMV-IE启动子的活性，类似于美国6，156，567的截短的CMV-IE启动子的活性。由此，本发明的实践中的 CMV-IE启动子可包括全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分，以及其衍生物和/或亚片段，或由或基本上由它们构成。在更通用的术语中，启动子具有病毒或细胞来源。可在本发明的实践中有用地采用的不同于CMV-IE的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可在本发明的实践中有用地采用的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动子(Kwissa M.等人，疫苗，2000，18,2337-2344)，或肌动蛋白启动子 (Miyazaki J.等人，基因，1989，79，269 277)。这些启动子的有功能的亚片段，即维持足够的启动活性的这些启动子的部分，包括在本发明中，例如根据PCT申请No. W098/00166或美国专利No. 6，156，567的截短的 CMV-IE启动子可用于本发明的实践。本发明的实践中的启动子因此包括维持足够的启动活性及因此发挥启动子的作用的全长启动子的衍生物及亚片段(优选基本上类似于衍生出衍生物或亚片段的实际的或全长启动子的启动活性，例如对于全长CMV-IE启动子的活性类似于美国专利No. 6，156，567的截短的CMV-IE启动子的活性。由此，本发明的实践中的 CMV-IE启动子可包括全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分，以及衍生物及亚片段，或由或基本上由其构成。优选地，质粒包括其他表达控制元件或基本上由其构成。其尤其有利于合并稳定序列，例如内含子序列，优选hCMV-IE(PCT申请No.W089/01036)的第一内含子，兔β -珠蛋白基因(van Ooyen 等人，Science，1979，206，337 344)的内含子 II。至于不同于痘病毒的质粒及病毒载体的多聚腺苷酸化信号(多聚A)，可再使用牛生长激素(bGH)基因的聚(A)信号(见U. S.专利No. 5，122，458)，或兔β -珠蛋白基因的聚㈧信号或SV40病毒的聚㈧信号。根据本发明的另一实施方式，表达载体是用于蛋白在适当的细胞系统中的体外表达的表达载体。表达的蛋白可在分泌后或非分泌后在或从培养上清收获(如果无分泌，细胞裂解一般发生或进行)，任选通过浓缩方法(例如超滤)浓缩和/或通过纯化手段纯化， 例如亲和性，离子交换或凝胶过滤型层析方法。重组表达的多肽的分离及纯化可通过常规手段进行，包括制备层析(例如，大小排阻，离子交换，亲和性)，选择性沉淀及超滤。可使用的现有技术中的技术的实施例(但不限于)可见于“蛋白纯化应用”，第二版，由Simon Roe编辑及可在Oxford大学出版社得到。所述重组表达的多肽是部分本公开内容。也含盖如上所述的本发明的任何多肽的产生方法，尤其是使用包括本公开的多核苷酸及宿主细胞的重组表达载体。含本发明的重组病毒载体的疫苗可有利地用稳定剂冻干。冻干可根据熟知的标准冻干过程进行。药学或兽医学可接受的稳定剂可为碳水化合物(例如山梨糖醇，甘露糖醇， 乳糖，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖，海藻糖)，谷氨酸钠(Tsvetkov T等人；Israeli E等人)，蛋白例如胨，白蛋白，乳请蛋白或酪蛋白，含试剂(例如脱脂乳(Mills CK等人;Wolff E等人) 及缓冲液(例如磷酸盐缓冲液，碱性金属磷酸盐缓冲液))的蛋白。佐剂可用于制备可溶性
19冻干的制剂。本发明的任何组合物或疫苗也可有利地含一种或多种佐剂。基于质粒的疫苗可用阳离子脂质，有利地用DMRIE(N-(2_羟基乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十四氧基)-1-丙基铵；W096/34109)，或结合中性脂质，例如DOPE ( 二油酰磷脂酰-乙醇胺；Behr J.P.)配制以形成DMRIE-D0PE。在一实施方式中，混合物即时制备，及在其施用之前，等待约10分钟 约60分钟，例如，约30分钟，对于混合物的适当的络合有利。当使用DOPE时，DMRIE/D0PE的摩尔比可从95/5 5/95及有利地是1/1。重量比质粒 /DMRIE 或 DMRIE-D0PE 佐剂是，例如，50/1 1/10，10/1 1/5 或 1/1 1/2。任选可将细胞因子加入组合物，尤其GM-CSF或诱导Thl的细胞因子(例如IL12)。 可将这些细胞因子加入组合物作为编码细胞因子蛋白的质粒。在一实施方式中，细胞因子来自犬来源，例如犬GM-CSF，其基因序列已保藏在GenBank数据库(登录号S49738)。此序列可用于以类似于WO 00/77210中的制备方式创建所述质粒。“宿主细胞”表示已通过外源多核苷酸(例如重组质粒或载体)的施用遗传改变的，或能遗传改变的原核生物或真核细胞。当说道遗传改变的细胞时，术语指原本改变的细胞及其后代。有利宿主细胞包括，但不限于，幼仓鼠肾(BHK)细胞，结肠癌(Caco-2)细胞， C0S7 细胞，MCF-7 细胞，MCF-10A 细胞，Madin-Darby 犬肾(MDCK)系，水貂肺(MvlLu)细胞， MRC-5细胞，U937细胞及VERO细胞。可将包括期望的序列的多核苷酸插入适宜克隆或表达载体，及载体反过来可导入适宜宿主细胞用于复制及扩增。可将多核苷酸通过本领域中已知的任何手段导入宿主细胞。可将含目的多核苷酸的载体通过许多适当的手段之任何导入宿主细胞，包括直接摄取，胞吞，转染，f"杂交，电穿孔，采用氯化钙转染，氯化铷，磷酸钙，DEAE-葡聚糖，或其他物质；微投射轰击；脂质体转染；及感染(其中载体是感染性的， 例如，反转录病毒载体)。导入载体或多核苷酸的选择将常取决于宿主细胞的特征。多核苷酸疫苗可使用裸DNA及在例如脂质体或阳离子脂质内或用CpG’ s配制的 DNA。由于遗传密码简并不同于天然的非洲马疫病毒核酸的核酸也在本发明的范围之内。例如，许多氨基酸由多于一种三联体指定。指定相同的氨基酸的密码子，或同义密码子 (例如，CAU及CAC是组氨酸的同义密码子)可导致"沉默"不影响蛋白的氨基酸序列的突变。导致由本发明的重组载体编码的受试者非洲马疫病毒蛋白的氨基酸序列变化的DNA序列变化也被本发明含盖。任何及全部所述核苷酸变化及得到的氨基酸变化在本发明的范围之内。也可能修饰由本发明的重组载体编码的受试者非洲马疫病毒多肽的结构，所述目的为增强治疗性或预防功效(例如增加多肽的免疫原性)。当设计为保留天然存在形式的蛋白的至少一种活性时，所述修饰的多肽认为是本文中更详细描述的非洲马疫病毒多肽的有功能的相当体。所述修饰的多肽可，例如，通过氨基酸置换，缺失，或添加产生。例如，可合理地预期，例如，亮氨酸用异亮氨酸或缬氨酸的的分离的取代，天冬氨酸用谷氨酸，苏氨酸用丝氨酸，或用结构上相关的氨基酸的氨基酸的类似取代(即保守突变)将不对得到的分子的生物学活性具有主要效应。保守取代是发生在侧链相关的氨基酸的家族之内的取代。遗传编码的氨基酸可分为4个家族(1)酸性=天冬氨酸，谷氨酸； (2)碱性的=赖氨酸，精氨酸，组氨酸；C3)非极性=丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯
20氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及(4)不带电的极性=甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸，及酪氨酸有时共同分类为芳族氨基酸。 以类似方式，氨基酸库可分组为(1)酸性=天冬氨酸，谷氨酸；( 碱性的=赖氨酸，精氨酸组氨酸，( 脂肪族=甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丝氨酸及苏氨酸任选被独立地分组为脂肪族羟基；(4)芳族=苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸；(5)酰胺 =天冬酰胺，谷氨酰胺；及(6)含硫=半胱氨酸及甲硫氨酸(见，例如，Biochemistry, 2nd ed.，Ed. by L. Stryer,ff. H. Freeman and Co.，1981)。多肽的氨基酸序列是否变化导致有功能的同源物可通过评定变体多肽以类似于野生型蛋白的方式在细胞内产生应答的能力轻易测定。至于目的表位，参考Kendrew，THE ENCYCLOPEDIA 0FM0LECULAR BIOLOGY (Blackwell Science Ltd.，1995)及 Sambrook，et al. 1982。目的表位是免疫原或其免疫学活跃的片段的免疫学相关区，例如来自兽医学或人利益的病原体或毒素的，例如非洲马疫病毒。本领域技术人员可测定肽或多肽的表位或免疫显性的区，及因此，无需过多实验而确定来自肽或多肽的氨基酸及相应DNA序列的知识，以及来自特定氨基酸的性质 (例如尺寸，带电性，等)及密码子表的编码DNA。DNA序列优选编码产生抗体应答或T细胞应答的肽的至少区。测定T及B细胞表位的一种方法涉及表位定位。目的蛋白在短重叠肽(PEPSCAN)中合成。然后测试个体肽的结合由天然的蛋白引起的抗体或诱导T细胞或B细胞活化的能力。Janis Kuby, (1992)。另一确定目的表位的方法旨在选择亲水的蛋白的区。亲水残基常在蛋白的表面及因此常是可接近抗体的蛋白的区。Janis Kuby, (1992)。选择可产生T细胞应答的目的表位的另一方法旨在从蛋白序列鉴定已知可能结合MHC分子的肽序列的潜在HLA锚点结合基序。是推定的目的表位的肽，产生T细胞应答，应在MHC复合物中呈递。肽优选含用于结合MHC分子的适当的锚点基序，及应以足够高的亲和性结合以产生免疫应答。一些确定是否蛋白是将刺激T细胞应答的目的表位的准则，包括肽长度一肽应至少8或9个氨基酸长，以适合I类MHC复合物，及至少13 25个氨基酸长以适合II类 MHC复合物。此长度是肽结合MHC复合物的最小长度。肽长于这些长度是优选的，因为细胞可切割表达的肽。肽应含将致使其以高度足够的特异性结合各I类或II类分子以产生免疫应答的适当的锚基序(见BoCChia，M. et al, ；Englehard, VH, (1994))。此可通过比较目的蛋白的序列与和MHC分子相关的肽的公开结构而无需过多的实验地进行。而且，本领域技术人员可通过比较蛋白序列与列于蛋白数据库的序列来确定目的表位。甚至而且，另一方法是简单产生或表达目的蛋白的部分，产生针对目的蛋白的那些部分的单克隆抗体，及然后确定是否那些抗体抑制衍生蛋白的病原体的体外生长。本领域技术人员可使用其他此公开及本领域中所示的产生或表达目的蛋白的部分的用于分析是否抗体抑制体外生长的准则。在进一步实施方式中，本发明提供包括编码一种或多种非洲马疫病毒蛋白，例如已经从其天然的形式修饰以克服免疫显性的非中和表位的VP2及或VP5的一种或多种核酸的重组载体。免疫显性的非中和表位，例如，通过引导免疫应答离开中和表位而发挥对抗中和表位的诱饵的作用。免疫显性的非中和表位可见于病原体(例如非洲马疫病毒)的免疫原性蛋白。本发明含盖包括编码一种或多种已经从它们的天然的形式修饰(例如通过天然的序列中氨基酸残基的缺失和/或插入和/或置换)的非洲马疫病毒蛋白的核酸的重组载体及修饰的重组病毒。至于“免疫原性组合物”，“免疫学组合物”及“疫苗”，含载体(或其表达产物)的免疫学组合物引起局部或全身性的免疫学应答。应答可，但非必保护性的。含本发明的重组体或载体(或其表达产物)的免疫原性组合物同样引起局部或全身性免疫学应答，其可，但非必是保护性的。疫苗组合物引起局部或全身性保护应答。因此，术语"免疫学组合物" 及"免疫原性组合物"包括"疫苗组合物"(如2之前的术语可为保护性组合物)。本发明涵盖免疫学，免疫原性或疫苗组合物。根据本发明，重组载体，例如病毒例如痘病毒，表达外源非洲马疫病毒基因或核酸分子的基因产物。将非洲马疫病毒的特异性病毒蛋白或编码来自特异性非洲马疫病毒蛋白的表位的特异性核酸分子插入重组载体例如病毒例如痘病毒载体，及得到的载体，例如重组病毒例如痘病毒，用于感染动物或体外表达用于施用给动物的产物。非洲马疫病毒基因产物的动物中的表达导致动物对非洲马疫病毒的免疫应答。由此，重组载体，例如病毒例如本发明的重组痘病毒可用于免疫学组合物或疫苗，以提供诱导免疫应答的手段。重组载体，例如重组病毒例如重组痘病毒-AHSV或其表达产物，以及本发明的组合物例如免疫学或疫苗组合物或治疗性组合物(例如含重组载体或重组病毒例如痘病毒或其表达产物的组合物)的施用方法，可为经肠胃外途径(真皮内，肌内或皮下)。所述施用能使全身性免疫应答，或体液或细胞介导的应答。可将载体或重组病毒-AHSV，例如痘病毒-AHSV，或其表达产物，或含所述表达产物和/或载体或病毒的组合物，施用于任何年龄或性别的马；例如，以引起针对非洲马疫病毒的免疫学应答，例如以由此预防非洲马疫病毒和/或其他与非洲马疫病毒相关的病理学后遗症。有利地，将载体或重组病毒-AHSV，例如痘病毒-AHSV，或其表达产物，或含所述表达产物和/或载体或病毒的组合物，施用于马，包括新生马和/或怀孕的马，以通过母体抗体在孕育和/或被动免疫期间对新生马赋予活跃的免疫。在优选实施方式中，本发明提供用包括来自非洲马疫病毒的免疫原或来自所述免疫原(例如来自AHSV VP2和/或VP5和/ 或由这些VP或VP的组合的任何一种或多种表达的目的表位的免疫原)的目的表位的组合物，和/或用表达所述免疫原或目的表位的载体接种雌性马(例如母马)。可在交配之前; 和/或服务之前；和/或孕育(或怀孕)期间，和/或围产期之前；和/或一生重复多次接种。有利地，服务之前进行至少一次接种。也有利地是在孕育期间然后进行接种，例如在约孕育中期(在约5 6个月的孕育)和/或孕育末(或在孕育的约10 11个月)。由此， 有利方案是服务之前接种及孕育期间加强接种。然后，在各服务之前和/或孕育期间，在约孕育中期(在孕育的约5 6个月)和/或孕育末(或在孕育的约10 11个月)可有再接种。优选地，再接种可仅在孕育期间。在另一优选的实施方式中，驹，例如来自免疫接种的雌性的驹的驹(例如如本文中讨论接种的)，在生命的第一个月内接种，例如在生命的3 和/或4，和/或4和/或5，及5和/或6及6个月接种。甚至更有利，所述驹然后在2 8周后追加(第一接种后)。由此，可给两个后代，以及雌性马(例如母马)施用本发明的组合物和/或可为本发明的方法的表现的受试者。接种可在如本文所述的剂量内。关于痘病毒或病毒组合物的施用及母体免疫，参照美国专利No. 5，338，683。关于剂量，施用途径，制剂，佐剂，及重组病毒及其表达产物的用途，本发明的组合物可用于肠胃外或粘膜施用，优选通过真皮内，皮下或肌内途径。当使用粘膜施用，可使用经口，经眼或经鼻途径。本发明在其他方面涉及本发明的重组体或载体的表达产物，例如病毒，例如，重组痘病毒，及由此的用途，例如以形成免疫学或疫苗组合物用于治疗，预防，诊断或测试；及，来自重组的或发明的病毒，例如痘病毒的DNA，其在构建DNA探针及PCR引物中有用。本发明的重组载体或病毒-AHSV (例如痘病毒-AHSV重组体)免疫学或疫苗组合物或治疗性组合物，可根据药学或兽医学技术人员熟知的标准技术制备。所述组合物可以剂量及通过兽医学领域的技术人员熟知的技术考虑所述因素，如年龄，性别，重量，及施用途径来施用。组合物可单独施用，或可与组合物共施用或依次施用，例如与"其他"免疫学组合物，或衰减的，灭活的，重组疫苗或治疗性组合物，由此提供多价剂或"混合剂"或本发明的组合组合物及采用它们的方法。组合物可含下列的组合非洲马疫病毒成分(例如重组载体(例如表达非洲马疫病毒免疫原或目的表位和/或非洲马疫病毒免疫原或目的表位的质粒或病毒或痘病毒)和一种或多种不相关的马病原体疫苗(例如目的表位，免疫原和/或重组载体或病毒例如重组病毒，例如表达所述表位或免疫原的重组痘病毒)例如来自一种或多种马细菌和/或病毒病原体的一种或多种免疫原或目的表位，例如来自下列之一种或多种的目的表位或免疫原马疱疹病毒(EHV)，马流感病毒(EIV)，马的西尼罗病毒 (WNV)，东方马脑炎(EEE)，西方马脑炎(WEE)，及委内瑞拉马脑炎(VEE)，破伤风，狂犬病，及 Potomac马热+EPM。再次，成分及方式(连续施用的或共施用)，以及剂量可考虑所述因素如年龄，性别，重量，及，施用途径来测定。对此，参照美国专利No. 5，843，456，通过引用合并到本文中，及针对狂犬病组合物及组合组合物及其使用。本发明的组合物的实施例包括用于粘膜施用的液体制剂，例如经口，鼻，眼，等，施用，例如悬浮液及，用于肠胃外，皮下，真皮内，肌内(例如可注射的施用)的制剂，例如无菌悬浮液或乳液。在所述组合物中，重组痘病毒或免疫原可与适宜载质，稀释剂，或赋形剂 (例如无菌水，生理盐水等)混合。也可将组合物冷冻干燥或冷冻。组合物可含助剂物质例如润湿剂或乳化剂，PH缓冲剂，佐剂，防腐剂等，依赖于期望的施用途径及制剂。组合物可含至少一种佐剂化合物，其选自氢氧化铝，可代谢油，包括萜烯烃及聚氧基乙烯-聚氧基丙烯嵌段共聚物，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，苹果酸酐和烯基衍生物的共聚物及包括QUIL A，胆留醇，抗原，和/或磷脂的糖苷的免疫刺激复合物基质(ISCOM)。优选的佐剂化合物是尤其与糖或多元醇的多烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物被知为卡波姆(Pharmeuropa Vol. 8，No. 2，1996年6月)。本领于技术人员也可参考美国专利No. 2，909，462 (通过引用并入本文中)，其描述所述丙烯酸聚合物与具有至少3个羟基，优选不多于8个(至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和的脂肪族基取代)的聚羟基化的化合物交联。优选的基团是含2 4个碳原子的基团，例如乙烯基，烯丙基及其他乙烯型不饱和基团。不饱和的基可本身含其他取代基， 例如甲基。以名称卡波泊尔 销售的产品(BF Goodrich, Ohio，美国)是尤其适当的。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。它们之中，卡波泊尔 974P，934P及971P可被提及。苹果酸酐及烯基衍生物的共聚物之中，优选例如与二乙烯醚交联的线性或交联的共聚物EMA (Monsanto)(其为苹果酸酐和乙烯的共聚物)。可参考J. Fields et al., 1960，通过引用并入本文中。从它们的结构的观点来看，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及共聚物EMA 优选由以下式的碱性单元形成
权利要求
1.药物组合物，其包括(a)表达载体，其中所述载体包括编码选自AHSVVP, AHSV VP的变体或片段及其混合物的一或多种多肽的一或多种多核苷酸；以及(b)药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂。
2.权利要求1的组合物，其中所述表达载体是体内或体外表达载体。
3.权利要求1的组合物，其中所述多核苷酸编码AHSVVP2或VP5。
4.权利要求1的组合物，其中所述载体包括编码AHSVVP2及AHSV VP5的2种多核苷酸。
5.权利要求1的组合物，其中所述多核苷酸编码与具有如SEQIDNO =1,2,20,21,30, 31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62 或 63 所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽。
6.权利要求1的组合物，其中所述多核苷酸与编码具有如SEQIDNO =1,2,20,21,30, 31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62 或 63 所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性。
7.权利要求1的组合物，其中所述多核苷酸与具有如SEQID NO 3,4, 5,6,17,18,19, 22，27，28，29，32，33，34，41，42，43，48或50所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。
8.权利要求1的组合物，其中所述载体选自vCP2377(SEQID NO 17), vCP2383 (SEQ ID NO 27)，vCP2398 (SEQ ID NO :41)，及它们的混合物。
9.权利要求1的组合物，其中所述药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂是卡波泊尔。
10.表达载体，其包括编码选自AHSVVP, AHSV VP的变体或片段及其混合物的一或多种多肽的一或多种多核苷酸。
11.权利要求10的载体，其中所述多核苷酸选自(a)编码与具有如SEQ ID NO :1，2，20，21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55， 56，57，58，59，60，61，62或63所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽的多核苷酸；(b)与编码具有如SEQ ID NO :1，2，20，21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55， 56，57，58，59，60，61，62或63所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；以及(c)与具有如SEQ ID NO :3，4，5，6，17，18，19，22，27，28，29，32，33，34，41，42，43，48 或 50所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；其中所述载体是体内表达载体或体外表达载体。
12.权利要求11的载体，其中所述载体是病毒载体，并且其中所述病毒载体是禽痘病毒，金丝雀痘病毒或鸡痘病毒载体。
13.权利要求12的载体，其中所述载体包括2种多核苷酸，并且其中所述2种多核苷酸编码与选自SEQ ID NO 4,42及18的多肽具有至少80%序列同一性的AHSV VP2，及与选自SEQ ID NO :5，43，及19的多肽具有至少80%序列同一性的AHSV VP5。
14.权利要求13的载体，其中所述多核苷酸可操作连接到选自H6牛痘病毒启动子，I3L 牛痘病毒启动子，4 (痘病毒启动子，7. 牛痘病毒启动子，及π牛痘病毒启动子的启动子。
15.权利要求14的载体，其中所述编码AHSVVP2的多核苷酸可操作连接到Η6牛痘病毒启动子，并且编码AHSV VP5的多核苷酸可操作连接到4 痘病毒启动子。
16.宿主细胞，其经权利要求10的载体转化。
17.在动物中诱导免疫学应答的方法，包括给宿主施用有效量的权利要求1的组合物。
18.疫苗接种易患非洲马疫的动物的方法，包括施用至少一个剂量的权利要求1的组合物。
19.权利要求18的方法，还包括施用至少第二剂量的权利要求1的组合物。
20.分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(a)与具有如SEQID NO :48或50所示的序列的多核苷酸具有至少80%序列同一性的核苷酸序列；(b)编码与具有如SEQID NO :49或51所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽的核苷酸序列；或者(c)与编码具有如SEQID NO :49或51所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性的核苷酸序列。
21.基本上纯化的AHSVVP，其中所述AHSV VP包括(a)与具有如SEQID NO :49或51所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；(b)如SEQID NO 49或51所示的氨基酸序列的保守变体；(c)包括如SEQID NO 49或51所示的氨基酸序列的至少8个连续氨基酸的免疫原性片段，其和与如SEQ ID NO :49或51所示的氨基酸序列特异性结合的抗体特异性结合；或者(d)如SEQID NO 49或51所示的氨基酸序列，并且其中给受试者施用多肽产生针对AHSV的免疫应答。
22.分离的非洲马疫病毒AHSV4-Jane株。
全文摘要
本发明提供含及体内表达编码非洲马疫病毒的VP2及VP5或其在对抗非洲马疫病毒的马中引起免疫应答的表位的基因的载体，包括所述载体的组合物，对抗非洲马疫病毒的疫苗接种的方法，及用于所述方法及组合物的试剂盒。
文档编号C07K14/14GK102245627SQ200980149209
公开日2011年11月16日 申请日期2009年10月22日 优先权日2008年10月24日
发明者A·J·古瑟里, J·M·明克, J·姚, J-C·奥堂奈特, N·J·马科拉克兰 申请人:加利福尼亚大学董事会, 梅里亚有限公司, 比勒陀利亚大学