专利名称：与il-12结合的抗体及其纯化方法
与IL-12结合的抗体及其纯化方法与相关申请的交叉参考
本申请要求于2008年10月20日提交的美国临时申请系列号61/196，752的利益，其在此整体引入作为参考。
背景技术：
人白细胞介素12 (IL-12)已表征为具有独特结构和多效作用的细胞因子。IL-12在与涉及免疫和炎症应答的几种疾病相关的病理学中起关键作用。IL-12、其生物学活性及其在疾病中的作用的综述可以在Gately等人(1998)Ann. Rev. Immunol. 16:495-521中找到。在结构上，IL-12是包括35 kDa亚基(p35)和40 kDa亚基(p40)的异二聚体蛋白质，其通过二硫键连接在一起(被称为“P70亚基”)。异二聚体蛋白质主要由抗原呈递细胞产生，所述抗原呈递细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞。这些细胞类型也分泌相对于 P70亚基过量的p40亚基。p40和p35亚基在遗传上无关，并且也未报道具有生物学活性， 尽管P40同二聚体可以充当IL-12拮抗剂。在功能上，IL-12在调节抗原特异性T辅助细胞型(Thl)和2型(Th2)淋巴细胞之间的平衡中起重要作用。Thl和Th2细胞支配自身免疫病症的起始和进展，并且IL-12在 Thl淋巴细胞分化和成熟的调节中是关键的。由Thl细胞释放的细胞因子是炎性的，并且包括干扰素-Y (IFNy ), IL-2和淋巴毒素(LT)。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和 IL-13，以促进体液免疫、变态反应和免疫抑制。与自身免疫疾病中的Thl应答占优势和IFNy的促炎活性一致，IL-12可能在与许多自身免疫和炎性疾病相关的病理学中起主要作用，例如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)和Crohn氏病。具有MS的人患者已显示IL-12表达中的增加，如由急性MS斑中的p40 mRNA水平证明的。此外，用来自MS患者的CD40L表达性T细胞先体外后体内刺激抗原呈递细胞导致与对照T细胞相比较增加的IL-12生产，与⑶40/⑶40L相互作用是IL-12的有效诱导物的
观察一致。与健康对照相比较，在RA患者的滑液中已检测到升高水平的IL-12 p70。在RA滑液中的细胞因子信使核糖核酸(mRNA)表达概况占优势地鉴定Thl细胞因子。IL-12还看起来在与Crohn氏病(CD)相关的病理学中起关键作用。在具有这种疾病的患者的肠粘膜中已观察到IFNy和IL-12增加的表达。来自⑶患者的固有层的T细胞的细胞因子分泌概况是占优势地Thl应答的特征，包括极大升高的IFNy水平。此外，来自⑶患者的结肠组织切片显示IL-12表达性巨噬细胞和IFNy表达性T细胞的丰度。由于人IL-12在多种人病症中的作用，已设计治疗策略以抑制或抵消IL-12活性。 具体地，已寻求与IL-12结合且中和IL-12的抗体作为抑制IL-12活性的方法。重要的是包括针对IL-12的抗体的治疗方案具有高纯度。本发明解决了这个需要，而无需使用A蛋白柱或等价的基于A蛋白的纯化步骤。发明概述
在特定实施方案中，本发明涉及与IL-12结合的纯化、分离的抗体和抗体片段，以及包括此种抗体和片段的药物组合物。在特定实施方案中，本发明涉及与人IL-12结合的分离的抗体或其抗原结合部分。本发明的分离的抗IL-12抗体可以用于临床情况以及研究和开发中。在特定实施方案中，本发明涉及包括SEQ ID NOs. 1和2中鉴定的重和轻链序列的抗IL-12抗体。本发明的特定实施方案涉及从样品基质中纯化抗IL-12抗体或其抗原结合部分， 以使其基本上不含宿主细胞蛋白质(“HCPs”)的方法。在特定方面，样品基质(或简单地“样品”)包括用于产生本发明的抗IL-12抗体的细胞系。在具体方面，样品包括用于产生人抗 IL-12抗体的细胞系。在本发明的特定实施方案中，对包括推定的抗IL-12抗体或其抗原结合部分的样品基质实施PH调整。在特定方面，将pH调整至约3. 5。低pH尤其促进可能污染样品的pH 敏感病毒的减少和/或灭活。在合适的时间段后，将PH调整至约5. 0，并且对样品实施离子交换层析，以产生洗脱物。在特定方面，收集离子交换洗脱物，并且进一步实施疏水作用层析，以产生洗脱物。随后可以收集疏水作用层析洗脱物用于进一步加工或使用。在特定实施方案中，本发明提供了纯化IL-12抗体的方法，其包括初步回收步骤， 以尤其去除细胞和细胞碎片。在上述方法的特定实施方案中，初步回收步骤包括一个或多个离心或深层过滤(cbpth filtration)步骤。例如并且非限制性地，此种离心步骤可以以约7000 χ g至约11，000 χ g执行。此外，上述方法的特定实施方案将包括深层过滤步骤， 例如去脂(delipid)深层过滤步骤。在上述方法的特定实施方案中，离子交换步骤可以是阳离子或阴离子交换层析或两者的组合。这个步骤可以包括多个离子交换步骤，例如阳离子交换步骤随后为阴离子交换步骤，或反之亦然。在特定方面，离子交换步骤涉及两步骤离子交换过程。此种两步骤过程可以例如且不限于通过第一个阳离子交换步骤随后为第二个阴离子交换步骤来完成。示例性阳离子交换柱是其固定相包括阴离子基团的柱，例如CM Hyper DF 柱。这个离子交换捕获层析步骤促进从初步回收混合物中分离抗IL-12抗体。合适的阴离子交换柱是其固定相包括阳离子基团的柱。此种柱的例子是Q kpharose 柱。一个或多个离子交换步骤通过减少杂质进一步分离抗IL-12抗体，所述杂质如宿主细胞蛋白质和DNA以及在可应用时的亲和基质蛋白质。这个阴离子交换程序是层析的流通(flow through)模式，其中抗IL-12 抗体不与阴离子交换树脂(或固相)相互作用或结合。然而，许多杂质的确与阴离子交换树脂相互作用且结合。在特定实施方案中，在初步回收后执行第一个和第二个离子交换步骤。在特定此种实施方案中，对离子交换样品实施中间过滤步骤，在第一个离子交换步骤前，在2个离子交换步骤之间，或两者。在特定方面，这个过滤步骤包括捕获超滤/渗滤(“UF/DF”)。在其他活性中，此种过滤促进抗IL-12抗体及其抗原结合部分的浓缩和缓冲液更换。本发明的特定实施方案提供了包括一个或多个疏水作用层析(“HIC”)步骤的方法。合适的HIC柱是其固定相包括疏水基团的那种。此种柱的非限制性例子是Wienyl HP kpharose 柱。在特定情况下，抗IL-12抗体在分离/纯化过程期间将形成聚集体。一个或多个HIC步骤的包括促进此种聚集的减少或消除。HIC还帮助去除杂质。在特定实施方案中，HIC步骤采用高盐缓冲液，以促进抗IL-12抗体(或其聚集)与疏水柱的相互作用。抗 IL-12抗体随后可以使用较低浓度的盐进行洗脱。
在特定实施方案中，HIC洗脱物使用病毒去除滤器进行过滤，例如但不限于 Ultipor DV50 滤器(Pall Corporation,East Hills，N. Y.)。可替代滤器例如 Viresolve 滤器(Millipore，Billerica, Mass. ) ；Zeta Plus VR 滤器(CUN0 ；Meriden, Conn.)；和 Planova 滤器(Asahi Kasei Pharma，Planova Division,Buffalo Grove，111.)，也可以在此种实施方案中使用。在特定实施方案中，本发明涉及包括分离的抗IL-12抗体或其抗原结合部分和可接受载体的一种或多种药物组合物。在一个方面，组合物进一步包括除抗IL-12抗体外的一种或多种抗体或其抗原结合部分。在另一个方面，组合物进一步包括一种或多种药物试剂。附图简述
图1.图1公开了抗IL-12抗体(ABT-847)的非限制性例子的重和轻链可变区序列。发明详述
本发明涉及与IL-12结合的抗体。在一个方面，本发明涉及与人IL-12结合的分离的抗体或其抗原结合部分。本发明的分离的抗IL-12抗体可以用于临床情况以及研究和开发中。本发明还涉及用于纯化抗IL-12抗体或其抗原结合部分的方法。可以在本发明的背景中纯化的合适抗IL-12抗体公开于美国专利号6，914，128 (其在此整体引入作为参考)中， 包括但不限于在那个专利中鉴定为J695的抗IL-12抗体，并且其随后已鉴定为ABT-874。 ABT-874的重和轻链可变区的序列在图1以及SEQ ID NOs. 1和2中显示。本发明还涉及包括本文描述的抗IL-12抗体或其抗原结合部分的药物组合物。为了清楚起见且非限制性地，这个详述分成下述亚部分
1.定义；
2.抗体生成；
3.抗体生产；
4.抗体纯化；
5.测定样品纯度的方法；
6.进一步修饰；
7.药物组合物；和
8.抗体用途。1.定义
为了本发明可以更容易理解，首先定义了特定术语。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键互连的4条多肽链一一 2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包括重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包括3个结构域一一 CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域一一 CL。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区(CDRs)的高变区，由称为构架区(FR)的更保守区域点缀。 每个VH和VL由3个⑶Rs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述次序排列FR1、 CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)包括抗体的片段，其保留与抗原(例如，hIL-12)特异性结合的能力。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执
8行。在术语抗体的“抗原结合部分”内包含的结合片段例子包括(i) Fab片段，包括VL、VH、 CL和CHl结构域的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，包括在铰链区通过二硫键连接的2个Fab 片段的二价片段；(iii )包括VH和CHl结构域的Fd片段；(iv)包括抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，(ν)包括VH结构域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544 546, 其完整教导引入本文作为参考);和(vi)分离的互补性决定区(⑶R)。此外，尽管Fv片段的 2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链 Fv (scFv);参见例如，Bird 等人(1988)Science 242 423-426 ；和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 855879-5883，其完整教导引入本文作为参考)。此种单链抗体也意欲包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包含其他形式的单链抗体，例如双抗体。 双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生2个抗原结合部位(参见例如，Holliger，P.，等人(1993)ftx)C. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ;Poljak，R. J.，等人(1994)Mructure 2:1121-1123，其完整教导引入本文作为参考)。再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大免疫粘附分子的部分。此种免疫粘附分子的例子包括使用链霉抗生物素蛋白核心区，以制备四聚scFv分子(Kipriyanov， S. Μ.，等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101，其完整教导引入本文作为参考)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酸标签，以制备二价和生物素化的 scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.，等人(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058，其完整教导引入本文作为参考)。抗体部分例如Fab和F (ab’)2片段可以使用常规技术由完整抗体制备， 例如完整抗体分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得，如本文描述的。在一个方面，抗原结合部分是完整结构域或完整结构域对。如本文使用的，短语“人白细胞介素12”(本文缩写为hIL-12或IL-12)包括主要由巨噬细胞和树突细胞分泌的人细胞因子。该术语包括包含35 kD亚基(p35)和40 kD 亚基(P40)的异二聚体蛋白质，其通过二硫键连接在一起。异二聚体蛋白质被称为“p70 亚基”。人IL-12的结构在例如下述中进一步描述Kobayashi，等人(1989) J. Exp Med. 170:827-845 ;Seder，等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90 10188-10192 ;Ling，等人(1995) J. Exp Med. 154:116-127 ;Podlaski，等人(1992) Arch. Biochem. Biophys. 四4:230-237，其完整教导引入本文作为参考。编码IL-12的核酸可作为GenBank登记号 NM_000882获得，并且多肽序列可作为GenBank登记号NP_000873. 2获得。术语人IL-12意欲包括重组人IL-12 (rh IL-12)，这可以通过标准重组表达方法进行制备。术语“Kabat编号”、“ Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语指编号氨基酸残基的系统，所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即高变XKabat等人(1971 )Arm. NY Acad, Sci. 190:382-391 禾口 Kabat，Ε· A.，等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U. S. Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242, 其完整教导引入本文作为参考)。对于重链可变区，高变区范围为关于CDRl的氨基酸位置31 - 35、关于⑶R2的氨基酸位置50 - 65、和关于⑶R3的氨基酸位置95 - 102。对于轻链可变区，高变区范围为关于⑶Rl的氨基酸位置M - 34、关于⑶R2的氨基酸位置50 -56、和关于⑶R3的氨基酸位置89 - 97。术语“人抗体”包括具有与人种系免疫球蛋白序列对应的可变和恒定区的抗体，如 ^ Kabat ^AffiiiW Kabat, ^A (1991 )Sequences of proteins of Immunological Interest,第 5 版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH
发明者佩里利帕尔默 B., 黄 Q., K. 希克曼 R. 申请人:雅培制药有限公司