专利名称：调节禽类性别的方法
技术领域：
本发明涉及用于调节禽类性别的核酸和方法。具体而言，本发明涉及dsRNA分子、 特别是siRNA的卵内(in ovo)输送，以增加雌性鸟类的产生。
背景技术：
从开始驯养动物时起，人们已经通过经许多世代选择种畜(seed stock)而对家畜的表型特征进行修饰。这已经导致定量生产参数如机体大小和肌肉量的改善。近来的用于修饰家禽生产性状和/或提高对病原体抗性的革新集中于转基因的方法，然而，许多消费者对经遗传修饰的生物体会有担心。鸡生产者已在探寻有效且经济的方法以确定初生(day old)小鸡的性别。许多生产者已经使用肛门辨性(vent sexing)和羽毛辨性(feather sexing)，但是发现这些方法由于在分开雄性与雌性小鸡时需要大量的时间及人工成本因而在经济学有实质性的不利之处。探针的使用(US 5，508，165)也是昂贵的方法且在经济上不实用。小鸡肛门区域的光测知(light sensing) (US 4，417，663)是确定小鸡性别的另一方式，但是其也是昂贵且耗时的，因为必须对每只小鸡进行处理和操作。已经用到可以对小鸡进行羽毛辨性的专家， 但是这些专家成本很高且羽毛辨别也很耗时。需要用于修饰禽类性别而不导致鸟类基因组转化、但却可以进行高通量处理的核酸和方法。发明概述本发明人已经鉴别了核酸分子、特别是dsRNA分子，其可用于在卵内修饰禽类的性别。因此，在一方面，本发明提供了包含双链区的分离的和/或外源核酸分子，其在施用于禽卵时降低至少一种RNA分子和/或蛋白的水平，其中如果卵的胚胎是雄性，则其性别在施用所述分离的和/或外源核酸分子之后被改变为雌性，并且其中所述分离的和/或外源核酸分子不包含选自如下的序列CCAGUU⑶CAAGAAGAGCA(SEQ ID NO :254)GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQ ID NO :369)CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQ ID NO :474)GCCACUGA⑶CUUCCUCAA(SEQ ID NO :530)CCAGCAACAUACAU⑶CAA(SEQ ID NO :605)CCUGC⑶CACACAGAUACU(SEQ ID NO :747)GGAGUA⑶UGUACAGGUUG(SEQ ID NO :3432)GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQ ID NO :3433)AUGGCG⑶UCUCCAUCCCU(SEQ ID NO :3434)或其中任意一个的变体。在另一方面，本发明提供了分离的和/或外源核酸分子，其包含SEQ ID NO 11-3431所提供的一或多个核苷酸序列或者其中任意的一个或多个的变体，其中所述分离的和/或外源核酸分子不包含选自如下的序列
CCAGUU⑶CAAGAAGAGCA(SEQ ID NO :254)GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQ ID NO :369)CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQ ID NO :474)GCCACUGA⑶CUUCCUCAA(SEQ ID NO :530)CCAGCAACAUACAU⑶CAA(SEQ ID NO :605)CCUGC⑶CACACAGAUACU(SEQ ID NO :747)GGAGUA⑶UGUACAGGUUG(SEQ ID NO :3432)GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQ ID NO :3433)AUGGCG⑶UCUCCAUCCCU(SEQ ID NO :3434)或其中任意一个的变体。在优选的实施方案中，所述核酸分子是dsRNA。更优选地，所述dsRNA是siRNA或者 shRNA。在优选的实施方案中，所述核酸分子降低禽卵中DMRTl基因、ASW基因或者 r-spondin基因所编码的蛋白的水平。在上述两方面的优选实施方案中，所述核酸不包含所述RNA分子或者编码其的 cDNA的全长开放读框。在相关的实施方案中，优选所述核酸不包含SEQ ID NO :2、4或6所提供的核苷酸序列、或者SEQ ID NO :2、4或6所提供的核苷酸序列其中每个T (胸腺嘧啶) 均被U (尿嘧啶)替换。正如技术人员的读者会意识到的，因为所述核酸是双链的，因此其也将包含本文提供的相关核苷酸序列的相应反向互补体。还提供了编码本发明的核酸分子或者其单链的载体。这种载体可用于宿主细胞或者无细胞表达系统中，以产生可用于本发明方法的核酸分子。在另一方面，本发明提供了包含本发明的外源核酸分子或者其单链、和/或本发明载体的宿主细胞。在另一方面，本发明提供了包含本发明的核酸分子或者其单链、本发明的载体、和 /或本发明的宿主细胞的组合物。再一方面，本发明提供了修饰禽类性别的方法，所述方法包括向禽卵施用至少一种本发明的核酸分子。优选地，所述核酸被施用于所述卵的非细胞部位。更优选地，所述非细胞部位是气囊、卵黄囊、羊膜腔或者绒膜尿囊液。在另外的优选实施方案中，所述卵不是电穿孔的。优选地，所述核酸不是通过施用编码该核酸分子的载体而输送的。优选地，所施用的核酸分子是dsRNA。优选地，所述核酸分子是通过注射施用的。所述核酸可方便地在本发明的组合物中施用。在优选的实施方案中，所述方法将所述卵的胚胎的性别从雄性修饰为雌性。所述禽类可以是鸟纲(Aves)的任何种。实例包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、矮脚鸡(bamtam)和鹌鹑。在特别优选的实施方案中，所述禽类是鸡。再一方面，本发明提供了用本发明方法所产生的禽类。另一方面，本发明提供了用本发明方法所产生的鸡。
再一方面，本发明提供了包含本发明的核酸分子或其单链、本发明的载体、和/或本发明宿主细胞的禽类卵。另一方面，本发明提供了试剂盒，其包含本发明的核酸分子或其单链、本发明的载体、本发明的宿主细胞、和/或本发明的组合物。显然，本发明一个方面的优选特征和特性可用于本发明的许多其它方面。在整个说明书中，词语“包含”或其变体如“含有”或“包括”应理解为是指包含所述的元件(整体或步骤)、或者元件组(整体或步骤)，但是不排除任何其它元件(整体或步骤)、或者元件组(整体或步骤)。本发明在后文通过如下非限制性实施例及参考附图来进行描述。附图简述
图1-选择的shRNA用于EGFP-Dmrtl基因融合表达的敲低(knockdown)。每个转染条件的平均荧光强度相对于PEGFP-Dmrtl而表示。误差棒表示对一式三份进行的每个单独实验所计算的标准误差。图2-在沉默后对DMRTl基因表达的qPCR分析。序列表解读SEQIDNO ；:1-部分鸡DMRTl蛋白质序列(Genbank AF123456)
SEQIDNO ；:2-编码鸡DMRTl (Genbank AF123456)的部分核苷酸序列。
SEQIDNO ；:3-鸡 WPKCI(ASff)(Genbank AF148455)。
SEQIDNO ；:4-编码鸡 WPKCI (ASW) (Genbank AF148455)的核苷酸序列。
SEQIDNO ；:5-鸡 r-spondin(Genbank XM_417760)。
SEQIDNO ；:6-编码鸡 r-spondin (Genbank XM_417760)的核酸序列。
SEQIDNO ；:7-鸡TO-I启动子的核苷酉I序列。
SEQIDNO ；:8-鸡TO-3启动子的核苷酉I序列。
SEQIDNO ；:9-鸡TO-4启动子的核苷酉I序列。
SEQIDNO ；:10-鸡7SK启动子的核苷酉I序列。
SEQIDNO11-3430-表1-3中所提供的RNA序列，用于使得鸡DMRTl
r-spondin基因沉默。SEQ ID NO :3431-3434-适用于使鸡DMRTl基因沉默的RNA序列。SEQ ID NO :3435-3485-鸡 DMRTl 的靴区域。SEQ ID NO :；3486-3499_寡核苷酸引物和探针。发明详述一般技术和定义除非另外特别定义，则本文所用的所有技术和科学术语均应被理解为具有本领域 (例如在细胞培养、分子遗传学、禽类生物学、RNA干扰、以及生物化学领域中)技术人员通常所理解的相同含义。除非另外指出，则本发明中所使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术均是标准过程，为本领域技术人员所熟知。此类技术的解释和说明遍及于文献中，如下列来源的文献 J. Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984) ； J.Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，ColdSpring Harbour Laboratory Press (1989) ；Τ.Α.Brown (editor)，Essential Molecular Biology :A Practical Approach，Volumes 1 and 2，IRL Press(1991) ；D. Μ. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning :A Practical Approach，Volumes 1-4,IRL Press(1995 禾口 1996)；以及 F. Μ. Ausubel et al. (editors)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988，包括直至目前的所有更新)，Ed Harlow and David Lane (editors)。如本文所用，术语“禽类”是指分类学的鸟纲中的任何种、亚种或品种(race)的生物体，此类生物体例如但不限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、鸦以及平胸类鸟包括鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵(cassowary)。该术语包括各种已知品系的feillus gallus(鸡)，例如白色来航鸡(White Leghorn)、棕色来航鸡(Brown Leghorn)、芦花岩鸡(Barred-Rock)、 苏塞克斯鸡(Sussex)、新罕布什尔鸡(New Hampshire)、罗得岛鸡(Iihode Island)、澳洲黑鸡(Australorp)、康沃尔鸡(Cornish)、米诺卡鸡(Minorca)、Amrox、加利福尼亚灰鸡 (California Gray)、意大利鹧鸪斑鸡(Italian Partidge-coloured)，以及火鸡、野鸡、鹌鹑、鸭、鸵鸟及通常产业化规模饲养的其它家禽的品系。如本文所用，术语“卵，，是指已由鸟类生所产出的受精卵。通常，禽类卵由硬的椭圆形外层卵壳、“卵白”或者白蛋白、卵黄、及不同的薄膜所组成。此外，“in ovo”是指在卵内。如本文所用，术语“非细胞部位”是指所述卵除了胚胎之外的部分。如本文所用，术语“降低”或其变体是指，当与未施用本文所述核酸的相同种的禽类的卵相比、优选与相同品系或品种禽类的卵相比、以及更优选与同一只鸟类的卵相比时， 所述卵中的靶RNA和/或靶蛋白的量可测量的降低。该术语还指靶蛋白质活性可测量的降低。优选地，靶RNA和/或靶蛋白水平降低至少约10%。更优选地，所述降低为至少约 20%、30%、40%、50%、60%、80%、90%，及更优选约 100%。如本文所用，短语“核酸分子导致降低”或其变体是指在卵中所述核酸分子的存在诱导所述卵中同源RNA降解，这是通过本领域已知的方法如“RNA干扰”或者“基因沉默”来实现的。此外，所述核酸分子直接导致所述降低，而不是在卵内转录以产生希望的作用。所述“至少一种RNA分子”可以是存在于禽类卵中或者由其产生的任何类型的 RNA。实例包括但不限于 mRNA、snRNA、microRNA 和 tRNA。本发明核酸分子的“变体”包括这样的分子，其由于和/或具有一或多个不同核苷酸而有不同的大小、但仍可用于使靶序列沉默。例如，变体可包含额外的核苷酸(如1、2、3、 4或更多个)、或更少的核苷酸。此外，少量核苷酸可以被取代而不影响该核酸使靶基因沉默的能力。在实施方案中，所述变体包括额外的5’和/或3’核苷酸，其与相应的靶RNA分子同源、和/或其增强该核酸分子的稳定性。在另一实施方案中，所述核酸分子与本文提供的序列相比具有不超过4个、优选不超过3个、更优选不超过2个以及更优选不超过1个核苷酸的差异。在另外的实施方案中，所述核酸分子与本文提供的序列相比具有不超过2个、 更优选不超过1个在内部添加的和/或缺失的核苷酸。在实施方案中，本发明的核酸在5’ 和/或3’端具有1个、优选2个添加的非靶核苷酸，例如在3’端的额外的UU。这种添加可增加所述分子在卵内的半衰期。“分离的核酸分子”是指与其天然状态中关联的或连接的核酸分子至少部分分离的核酸分子。优选所述分离的核酸分子至少60%、优选至少75%、最优选至少90%没有其天然所关联的其它成分。此外，术语“多核苷酸”与“核酸”在本文可互换使用。以核酸分子为背景的术语“外源”是指，当存在于细胞或者无细胞表达系统中时核酸分子以改变的量存在。优选地，所述细胞是天然不包含所述核酸分子的细胞。然而，所述细胞可以是包含外源核酸分子导致该核酸分子的量增加的细胞。本发明的外源核酸分子包括与其所存在的重组细胞或无细胞表达系统的其它成分未分离的核酸分子，以及在这种细胞或者无细胞系统中所产生的并随后从至少一些其它成分中纯化的核酸分子。件别确定本发明涉及在卵内调节禽类的性别。可被靶向以调节禽类性别的基因的例子包括但不限于DMRTl基因、ASW (WPKCI)基因、R-spondin基因、R)x9基因和β-联蛋白基因。在优选的实施方案中，所述核酸分子降低由DMRTl基因所编码的蛋白的水平。 DMRTl是涉及性别确定的第一种在生物门(phyla)之间显示出序列保守性的分子。DMRTl 的禽类同系物在鸡的Z (性)染色体上发现，并且在雄性和雌性胚胎的生殖嵴上差异表达 (Raymond et al. ,1999 ；Smith et al.，1999)。DMRTl是迄今为止参与哺乳动物性别确定且具有严格的性腺表达模式的几个基因之一(Raymond et al.，1999)。可用于降低鸡DMRTl蛋白及编码其的mRNA水平的核酸分子的例子包括但不限于， 包含表1所提供的一或多个核苷酸序列(SEQ ID NO :11-1644)或者其中任意的一个或多个的变体的核酸，除了所述核酸分子不包含选自如下的序列CCAGUU⑶CAAGAAGAGCA(SEQ ID NO :254)GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQ ID NO :369)CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQ ID NO :474)GCCACUGA⑶CUUCCUCAA(SEQ ID NO :530)CCAGCAACAUACAU⑶CAA(SEQ ID NO :605)CCUGC⑶CACACAGAUACU(SEQ ID NO :747)GGAGUA⑶UGUACAGGUUG(SEQ ID NO :3432) (SEQ ID NO :493 的反向互补体)GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQ ID NO :3433) (SEQ ID NO :612 的反向互补体)AUGGCG⑶UCUCCAUCCCU(SEQ ID NO :3434) (SEQ ID NO :1520 的反向互补体)，或其中任意一个的变体。在特别优选的实施方案中，可用于降低鸡DMRTl蛋白水平的核酸分子包含选自如下的序列GAGCCAGUU ⑶ CAAGAAGA(SEQ ID NO :251)、GACUGCCAGUGCAAGAA ⑶(SEQ ID NO: 116)、CUGUAUCCUUACUAUAACA(SEQ ID NO :476)及 CUCCCAGCAACAUACAUGU(SEQ ID NO :602)、 或其中任意一个的变体。更优选地，可用于降低鸡DMRTl蛋白水平的核酸分子包含序列 GAGCCAGUU⑶CAAGAAGA(SEQ ID NO :251)或者其变体如 GAGCCAGUU⑶CAAGAAGAUU(SEQ ID NO 3431)。可被靶向以修饰性别的基因另外的例子是WPKCI基因。禽类基因WPKCI已被显示出在广泛的禽类W染色体上保守，并且在性腺分化开始前于雌性鸡胚胎中活跃表达。据推测WPKCI可通过干扰H(CI功能或者通过在核中展现其独特功能从而在雌性性腺分化中起作用(Hori et al.，2000)。此基因也被鉴别为ASW(禽类性别特异性W-关联)(0' Neill et al. ，2000)。
可用于降低鸡ASW (WPKCI)蛋白及编码其的mRNA的水平的核酸分子的例子包括但不限于，包含表2所提供的一或多个核苷酸序列(SEQ ID NO =1645-2209)或者其中任意一个或多个的变体的核酸。可被靶向以修饰性别的基因的另一实例是r-spondin基因。可用于降低鸡 r-spondin蛋白及编码其的mRNA水平的核酸分子的例子包括但不限于，包含表3所提供的一或多个序列(SEQ ID NO =2210-3430)或者其中任意一个或多个的变体的核酸。基因沉默术语“RNA干扰”、“RNAi”或者“基因沉默”通常是指其中双链RNA分子降低核酸序列表达的过程，所述核酸序列与所述双链RNA分子具有实质的或者完全的同源性。然而，最近已经显示基因沉默可以通过使用非RNA双链分子来实现(见例如US 20070004667)。RNA干扰(RNAi)对于特异性抑制特定RNA和/或蛋白质的产生特别有用。尽管并非希望理论来作限制，但是Waterhouse et al. (1998)提供了 dsRNA(双链RNA)可用于降低蛋白质产生的机制模型。这种技术依赖于dsRNA分子的存在，其含有与感兴趣的基因的mRNA或其部分基本相同的序列，在这种情况中为编码感兴趣的多肽的mRNA。所述dsRNA 可方便地在重组载体或者宿主细胞中由单一的启动子所产生，其中有义和反义序列侧面有不相关的序列使得所述有义和反义序列杂交以形成dsRNA分子(具有形成环结构的不相关的序列)。适用于本发明的dsRNA分子的设计和产生在本领域技术人员的能力范围内，具体参见 Waterhouse et al. (1998)、Smith et al. (2000), WO 99/32619, WO 99/53050、WO 99/49029 和 WO 01/34815。本发明包括核酸分子，其包含和/或编码双链区用于基因沉默。所述核酸分子通常是RNA，但是也可包含DNA、化学修饰的核苷酸和非核苷酸。表1 靶向编码鸡DMRTl的mRNA的dsRNA分子
权利要求
1 一种包含双链区的分离的和/或外源的核酸分子，当施用于禽类卵时其降低至少-种RNA分子和/或蛋白的水平，其中如果所述卵的胚胎是雄性的，则在施用所述分离的和/或外源的核酸分子之后其性别被转变为雌性，并且其中所述分离的和/或外源的核酸分子不包含选自如下的序列CCAGUU⑶CAAGAAGAGCA(SEQIDNO:254)GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQIDNO:369)CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQIDNO:474)GCCACUGA⑶CUUCCUCAA(SEQIDNO:530)CCAGCAACAUACAU⑶CAA(SEQIDNO:605)CCUGC⑶CACACAGAUACU(SEQIDNO:747)GGAGUA⑶UGUACAGGUUG(SEQIDNO:3432)GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQIDNO:3433)AUGGCG⑶UCUCCAUCCCU(SEQIDNO:3434)或其中任一的变体。
2. 一种分离的和/或外源的核酸分子，其包含SEQ ID NO :11-3431所提供的一或多个核苷酸序列或者其中任意一个或多个序列的变体，其中所述分离的和/或外源的核酸分子不包含选自如下的序列CCAGUU⑶CAAGAAGAGCA(SEQIDNO:254)GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQIDNO:369)CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQIDNO:474)GCCACUGA⑶CUUCCUCAA(SEQIDNO:530)CCAGCAACAUACAU⑶CAA(SEQIDNO:605)CCUGC⑶CACACAGAUACU(SEQIDNO:747)GGAGUA⑶UGUACAGGUUG (SEQIDNO:3432)GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQIDNO:3433)AUGGCG⑶UCUCCAUCCCU(SEQIDNO:3434)或其中任一的变体。
3.权利要求1或2的核酸分子，其是dsRNA分子。
4.权利要求3的核酸分子，其中所述dsRNA是siRNA或shRNA。
5.权利要求1-4任一项的核酸分子，其降低禽类卵中由DMRTl基因、ASW基因或者 R-spondin基因所编码的蛋白质的水平。
6.编码权利要求1-5任一项的核酸分子或者其单链的载体。
7.包含权利要求1-5任一项的外源核酸分子或者其单链、和/或权利要求6的载体的宿主细胞。
8.包含权利要求1-5任一项的核酸分子或者其单链、权利要求6的载体、和/或权利要求7的宿主细胞的组合物。
9.一种修饰禽类性别的方法，所述方法包括向禽类卵施用权利要求1-5任一项的至少一种核酸分子。
10.权利要求9的方法，其中所述核酸被施用至所述卵的非细胞部位。
11.权利要求10的方法，其中所述非细胞部位是气囊、卵黄囊、羊膜腔或者绒膜尿囊液。
12.权利要求9-11任一项的方法，其中所述卵未被电穿孔。
13.权利要求9-12任一项的方法，其中所述核酸不是通过施用编码所述核酸分子的载体而输送的。
14.权利要求9-13任一项的方法，其中施用的核酸分子是dsRNA。
15.权利要求9-14任一项的方法，其中所述核酸分子通过注射施用。
16.权利要求9-16任一项的方法，其中所述禽类选自鸡、鸭、火鸡、鹅、矮脚鸡和鹌鹑。
17.用权利要求9-16任一项的方法所产生的禽类。
18.用权利要求9-16任一项的方法所产生的鸡。
19.包含权利要求1-5任一项的核酸分子或者其单链、权利要求6的载体、和/或权利要求7的宿主细胞的禽类卵。
20.包含权利要求1-5任一项的核酸分子或者其单链、权利要求6的载体、权利要求7 的宿主细胞、和/或权利要求8的组合物的试剂盒。
全文摘要
本发明涉及调节禽类性别的核酸及方法。具体而言，本发明涉及dsRNA分子、特别是siRNA的卵内(in ovo)输送，以增加雌性鸟类的产生。
文档编号C07H21/02GK102356158SQ200980154743
公开日2012年2月15日 申请日期2009年12月16日 优先权日2008年12月17日
发明者A·H·辛克莱尔, C·史密斯, J·W·洛温塔尔, R·J·莫尔, T·J·多兰 申请人:澳大利亚家禽合作研究中心私人有限公司, 联邦科学技术研究组织