专利名称：一种多肽及其衍生物与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽及其衍生物与应用，特别是涉及有关抗病毒多肽疫苗的设计 方式及应用，具体为抗鸭肝炎病毒多肽疫苗的设计、制备与应用。
背景技术：
鸭病毒性肝炎一年四季均可发生，其发病急、传播迅速和死亡率高。自然爆发时仅 发生于雏鸭，发病率可高达100%，主要为3周龄以内的雏鸭，以4-8日龄最为易感；雏鸭的 死亡率则差别很大，从20%到100%，随着雏鸭日龄的增长与机体免疫水平的提高，死亡率 逐渐降低。4周龄以后的雏鸭发病率和死亡率均很低。成年鸭呈隐性感染，无临床症状且不 影响产蛋率，但能排毒。该病可通过消化道和呼吸道感染，主要的传播途径是与病鸭的直接 接触感染，也可通过病鸭的粪便、食具、饮水等间接传播。目前，对鸭病毒性肝炎病还缺少特 效药物，因此重在预防。同时，在国内市场上还没有获得批准的针对鸭病毒性肝炎的有效疫 苗(包含活疫苗和灭活疫苗)，因此开发预防鸭肝炎病毒的疫苗无论从安全性和实用性均 更切合需求。传统疫苗包括能诱发免疫力却不致病的灭活疫苗和减毒疫苗，但由于在制备该类 疫苗时，需要足够多的活病毒做灭活或减毒处理，在这一过程中如果操作不当将存在严重 的安全隐患。多肽疫苗是根据病毒蛋白或从病毒基因组编码的蛋白中选取具有抗原表位特性 的多肽片段，通过采用化学合成技术制备出抗病毒多肽疫苗。由于多肽疫苗完全是人工合 成，不存在毒力回升或灭活不全的问题，在制备和使用的过程中不存在传播的危险，因此消 除了以往灭活疫苗或减毒疫苗存在的安全隐患。
发明内容
本发明提供了一种多肽疫苗的设计方式及其衍生物的应用，其目的是提供一种对 病毒性疾病的预防所采取的一项措施。采用病毒蛋白中具有抗原表位特性的多肽片段制备 抗病毒多肽疫苗以抵抗病毒对机体的侵害，具体到采用此设计方式制备抗鸭肝炎病毒多肽 疫苗为实例，阐述多肽疫苗的设计与应用。法氏囊是鸟类动物所特有的免疫器官，是B淋巴细胞最早发生的场所，对B细胞 的发育、成熟和迁移具有重要作用。1986年人们首次从鸡法氏囊抽提液中纯化出一种三肽 物质，赖氨酸-组氨酸-甘氨酰胺(Lys-His-Gly-Amide，或KHG-NH2)并被命名为囊素。囊 素主要是由法氏囊滤泡的上皮细胞合成和分泌。囊素不仅存在于鸟类动物的法氏囊中、胸 腺Hassall小体中、腔上囊中，而且还广泛存在于哺乳类动物(包括人)的骨髓和肝胆上皮 细胞中，它对鸟类动物及哺乳动物的体液免疫和细胞免疫具有重要的促进作用，具有促进B 淋巴前体的分化、增殖、提高巨噬细胞的吞噬能力，显著提高B淋巴细胞应答和免疫功能的 作用(江倩等“囊素的研究进展”，中国畜牧兽医文摘2007年，第3期36页)。根据获得的鸭肝炎病毒基因组信息，根据其编码的蛋白从中选取具有抗原表位特性的多肽片段。本发明采用将多拷贝病毒多肽抗原片段通过具有双活性氨基的赖氨酸与生 物活性分子囊素相连接，使合成产物不仅克服了单一拷贝病毒多肽抗原片段分子量低，抗 原性差的缺点，同时通过囊素提升机体免疫功能，使囊素与多肽抗原产生协同作用，提高机 体对多拷贝多肽抗原的免疫应答反应。氨基酸的特点是具有一个氨基和一个羧基，比如甘氨酸(Gly，或G)的氨基与赖氨 酸(Lys，或K)的羧基经活化后进行缩合反应，使Lys与Gly形成肽键相连接形成Lys-Gly 合成产物。多肽固相合成的原理是将所要合成的目的多肽的羧基末端氨基酸的羧基与固 相树脂共价连接，使该氨基酸的氨基被活化后再与所需要连接的氨基酸的活化羧基进行缩 合反应(连接上羧基末端的第二个氨基酸)，如此反复多次地进行下去。因此固相肽合成 的顺序是从多肽的羧基端向氨基端逐个氨基酸地连接延伸肽链，待合成结束后将合成多肽 从固相树脂上裂解下来，经过高效液相色谱分离纯化后可得到高纯度的多肽合成产物。由 于多肽固相合成技术目前已经非常成熟并有多肽自动化合成仪辅助，有关合成步骤和方
"Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis :A PracticalApproach"； W.C. Chan(Editor), Peter D. White(Editor) ；Publisher :0xfordUniversity Press, New York, USA5IEdition (March 2, 2000) 0由于多肽合成工艺稳定，因此不仅能够高纯度、大批 量地制备抗病毒多肽疫苗，而且由于疫苗的整个制备过程中杜绝了与活病毒的接触，有效 避免了病毒的污染和扩散，使疫苗制备和应用过程中安全性得到了有效保障。本发明所阐述的是采用具有双活化氨基的赖氨酸(> Lys-或> K-)作为多肽合 成底物，由于> Lys-具有两个活化氨基，因此可以同时连接上两个氨基酸，并往下继续连 接氨基酸延长肽链，形成分支状多肽结构，使得在生物活性片段KHG-NH2的氨基端继续往下 延伸，将8个拷贝的病毒多肽抗原片段与囊素寡肽片段有机地连接起来，形成本发明所揭 示的多肽疫苗分子骨架，氨基酸序列与结构式如下；(AAn)8( > Lys)4( > Lys) 2 > Lys-His-Gly，所述 AAn 为病毒多肽抗原片段，> Lys-(或> K-)代表具有双活性氨基的赖氨酸本发明所提供的多肽疫苗分子骨架经在其羧基端酰胺化后得到衍生物结构如 下；(AAn) 8( > Lys) 4( > Lys) 2 > Lys-His-Gly-NH2 ；实例中AAn为鸭肝炎病毒蛋白多肽抗原片段Lys-Glu-Ile-Ala-Lys-Leu-Lys-His-Trp-Lys-Ser-Tyr-Ala-Pro-Thr(15 月太)或将氨基酸序列表达为KEIAKLKHWKSYAPT。序列表达式为(KEIAKLKHWKSYAPT)8(> Lys)4( > Lys)2 > Lys-His-Gly-NH2 ；结构式如下
权利要求
1.一种多肽疫苗的氨基酸分子骨架结构式为(AAn)8( > Lys)4( > Lys)2 > Lys-His-Gly ；所述AAn为病毒蛋白多肽抗原片段，> Lys-代表具有双活性氨基的赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的多肽疫苗分子骨架所产生的衍生物，其结构特征如下(AAn) 8( > Lys) 4( > Lys) 2 > Lys-His-Gly-NH2 ；
3.根据权利要求1或2所述制备的多肽疫苗，其特征结构式如下(AAn) 8( > Lys) 4( > Lys) 2 > Lys-His-Gly-NH2 ；所述AAn为鸭肝炎病毒蛋白多肽抗原片段，序列为KEIAKLKHWKSYAPT氨基酸序列和结构表达式为(KEIAKLKHWKSYAPT) 8 ( > Lys) 4( > Lys) 2 > Lys-His-Gly-NH2 ；
4.一种多肽疫苗的衍生物，是在权利要求1至3所述的多肽氨基酸侧链基团上、多肽 片段的氨基端或羧基端进行氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸 化、酯化或糖基化所得到的衍生物。
5.一种多肽衍生物，是权利要求1中所述多肽的Lys-His-Gly片段两端所连接额外 的1个或多个任意氨基酸所形成的衍生物，或权利要求1所述多肽中含有的双活性氨基> Lys-之间或其两端额外连接的1个或多个任意氨基酸所形成的衍生物。
6.一种多肽疫苗衍生物，是权利要求1至3中所述多肽产物与酸或碱所形成的盐类化 合物。
7.一种多肽疫苗，其特征在于该疫苗的活性物质为权利要求1-6任一项所述的多肽或 多肽衍生物。
8.根据权利要求1-7所述的多肽或多肽衍生物在制备鸭病毒性肝炎疫苗中的应用。
9.一种多肽疫苗，其特征是权利要求1-7任一项所述多肽疫苗中的鸭肝炎病毒蛋白多 肽片段可被其它病毒蛋白多肽抗原片段替换而制备成具有针对性的抗病毒多肽疫苗。
10.权利要求1-9所述的多肽及多肽衍生物在制备抗病毒疫苗或药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种多肽及其衍生物与应用。本发明公开了一种多肽疫苗的设计方式及应用。所述多肽疫苗的氨基酸分子骨架结构式为(AAN)8(＞Lys)4(＞Lys)x＞Lys-His-Gly；所述AAN为病毒蛋白多肽抗原片段。本发明阐述的多肽疫苗在制备和应用过程中消除了病毒污染传播的危险隐患，使疫苗的制备和使用更加快捷、便利、安全。
文档编号C07K14/00GK102120759SQ20101000017
公开日2011年7月13日 申请日期2010年1月7日 优先权日2010年1月7日
发明者张庆霞, 张志刚, 张瑜, 郑杰, 韩苏 申请人:北京中天康泰生物科技有限公司, 北京信得威特科技有限公司