专利名称：一种人甲状旁腺激素(1-34)的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及人甲状旁腺激素(1-34)的纯化方法。
背景技术：
人甲状旁腺激素(1-34)，也称为pTH(l-34)，是人甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone, human)氨基端的1_34个氨基酸组成的多肽。重组人甲状旁腺激素(1_34) [rh pTH(l-34)]又称特立帕肽(teriparatide)，由美国Eli Lilly公司研发，属于基因重组药 物，2002年被美国FDA批准上市。它是第1个被批准用于治疗严重骨质疏松症的骨形成促 进剂，有较广泛的市场应用前景。
发明内容
本发明提出了一种纯化pTH(l-34)的方法，纯度高且收率好，达到产业化要求。为实现上述目的，本发明提供的技术方案包括以下步骤步骤1)以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以质量浓度为0. 05% -0. 2%的三氟 乙酸水溶液为A相，乙腈为B相，梯度B% :20% 40%，将粗肽溶液进行梯度洗脱；所述“粗肽”是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未经过精制处理的人甲 状旁腺激素(1-34)粗肽或者纯度不能满足药用的人甲状旁腺激素(1-34)。“粗肽溶液”是 指粗肽溶于乙腈水溶液所得到的溶液，所使用的水为纯净水，并符合注射用水标准，优选超 纯水，具体的配置过程详见样品处理。本发明的“乙腈”的纯度级别优选色谱纯。A相和B 相的比例大于20 80，小于95 5，A相和B相在上述比例内可以达到对粗肽进行快速分 离的目的。步骤1)下文也表述为“纯化”。步骤2)采用反相高效液相色谱法将人甲状旁腺激素(1-34)的三氟乙酸盐转成醋 酸盐。步骤2)下文也表述为“转盐”。所述“反相高效液相色谱”的固定相为八烷基硅烷键合硅胶，转盐的方法优选 为用含3% —8%乙腈的醋酸溶液冲洗15-30min，然后用乙腈洗脱，收集人甲状旁腺激素 (1-34)溶液；醋酸溶液的浓度为0. 05% -0. 2%，优选为0. 1%。洗脱步骤所采用的乙腈浓 度为30-60%，优选50%。本发明提供的纯化pTH(l-34)方法操作简单可行、纯度高、收率高，达到产业化要 求。采用本发明的纯化方法产品纯度可达到98%以上，收率25%。纯化规模包括以下规格色谱柱(柱子直径X长度)5cmX25cm、15cmX25cm、 30cmX 25cm。
具体实施例方式实施例一1.样品处理将粗肽加入到超纯水，加入20%乙腈，超声使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。2.纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长 度为5cmX25cm。流动相A相0. 05%三氟乙酸水溶液；B相乙腈，流速50-80ml/min，梯 度:B% 20%~ 40%，检测波长:280歷。进样量为1. 5_3g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1. 5_3g。 线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的人甲状旁腺激素(1-34)溶液于水温不超过 35°C的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/mL后备用。3.转盐色谱柱以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为 5cmX25cm。将色谱柱用50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量1.5_3g，用含 3%乙腈的0. 05%的醋酸溶液冲洗15-30min，然后用50%乙腈洗脱，收集目的峰，将收集的 人甲状旁腺激素(1-34)溶液于水温不超过35°C条件下减压旋蒸浓缩至约150-200mg/mL后 转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98%的pTH(l-34)。实施例二1.样品处理将粗肽加入到超纯水，加入20%乙腈，超声使样品完全溶解后用滤 膜过滤，收集滤液备用。2.纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长 度为15cmX25cm。流动相A相0. 三氟乙酸水溶液；B相乙腈，流速:400_450ml/min， 梯度B% :20% 40%，检测波长280nm。进样量为10_20g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为10_20g。 线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的人甲状旁腺激素(1-34)溶液于水温不超过 350C的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/mL后备用。3.转盐色谱柱以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为 15cmX25cm。将色谱柱用50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量10_20g，用含 5 %乙腈的0. 1 %的醋酸溶液冲洗15-30min，然后用50%乙腈洗脱，收集目的峰，将收集的 人甲状旁腺激素(1-34)溶液于水温不超过35°C条件下减压旋蒸浓缩至约150-200mg/mL后 转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98%的pTH(l-34)。实施例三1.样品处理将粗肽加入到超纯水，加入20%乙腈，超声使样品完全溶解后用滤 膜过滤，收集滤液备用。2.纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长 度为:30cmX25cm。流动相A相0. 2%三氟乙酸水溶液；B相乙腈，流速:1800_2000ml/ min，梯度:B% :20% 40%，检测波长:280nm。进样量为55_75g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为55_75g。 线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的人甲状旁腺激素(1-34)溶液于水温不超过 35°C的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/mL后备用。3.转盐色谱柱以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为30cmX25cm。将色谱柱用50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量50_80g，用含8 %乙腈的0. 2 %的醋酸溶液冲洗15-30min，然后用50 %乙腈洗脱，收集目的峰，将收集的 人甲状旁腺激素(1-34)溶液于水温不超过35°C条件下减压旋蒸浓缩至约150-200mg/mL后 转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98%的pTH(l-34)。
权利要求
一种人甲状旁腺激素(1-34)的纯化方法，包括以下步骤步骤1)以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.05％-0.2％的三氟乙酸水溶液为A相，乙腈为B相，梯度B％20％～40％，将粗肽溶液进行梯度洗脱；步骤2)采用反相高效液相色谱法将人甲状旁腺激素(1-34)的三氟乙酸盐转成醋酸盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中A相和B相的比例大于20 80， 小于95 5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中A相的三氟乙酸水溶液的浓度 为 0. 1%。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)中A相的三氟乙酸水溶液的浓度 为 0. 1%。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的方法，其特征在于步骤2)所述的反相高效液 相色谱的固定相为八烷基硅烷键合硅胶。
6.根据权利要求1至4任意一项所述的方法，其特征在于步骤2)采用反相高效 液相色谱法将人甲状旁腺激素(1-34)的三氟乙酸盐转成醋酸盐所采取的方法是用含 3% 一8%乙腈的醋酸溶液冲洗15-30min，然后用30% —60%的乙腈洗脱，收集人甲状旁腺 激素(1-34)溶液；其中醋酸溶液的浓度为0. 05% -0. 2%。
7.根据权利要求6任意一项所述的方法，其特征在于步骤2)采用反相高效液相色谱 法将人甲状旁腺激素(1-34)的三氟乙酸盐转成醋酸盐所采取的方法是用含3%—8%乙 腈的醋酸溶液冲洗15-30min，然后用30%-60%的乙腈洗脱，收集人甲状旁腺激素(1_34) 溶液；其中醋酸溶液的浓度为0. 05% -0. 2%。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于醋酸溶液的浓度为0.1%。
全文摘要
本发明提出了一条适于产业化纯化人甲状旁腺激素(1-34)的方法，包括以下步骤步骤1)以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.05％-0.2％的三氟乙酸水溶液为A相，乙腈为B相，梯度B％20％～40％，将粗肽溶液进行梯度洗脱；步骤2)采用反相高效液相色谱法将人甲状旁腺激素(1-34)的三氟乙酸盐转成醋酸盐。本发明提供的纯化人甲状旁腺激素(1-34)方法操作简单可行、纯度高、收率高，达到产业化要求。
文档编号C07K14/635GK101798334SQ20101013898
公开日2010年8月11日 申请日期2010年3月30日 优先权日2010年3月30日
发明者戴柱, 袁建成, 覃亮政, 马亚平 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司