专利名称：高通量抗血清析出及纯化制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医药抗体的析出及纯化制备方法，特别是涉及一种高通量兔血抗血清析出及抗体纯化制备方法。
背景技术：
在目前的抗血清制备和纯化生产领域，主要沿用实验室条件下的操作方法在血清制备阶段，首先将血液置于离心管中，待血液凝固后(37°C静置2h，或4°C 放置过夜)，通过离心机离心获得血清。此类方法存在诸多问题，例如，当需要处理的血清比较多时，离心管需要量也要相应增多；离心管的标记、离心前的平衡、离心机对放入的离心管数目的限制、离心机每次20分钟的运行时间、离心后血清的转移及新的器皿的标记、含有血块的离心管的清洗和处理等。这些操作会造成血清处理费时费力，并且很容易混淆出
T曰ο在血清亲和纯化阶段，传统方法使得血清穿过亲和柱，PBS溶液洗两次，最后用 tris-glycine(PH 2. 5或PH 3.0)的溶液将结合在亲和柱上的抗体洗脱下来，利用透析袋在无氨基和羧基的某种缓冲液(如PBQ中过夜透析后，加入甘油后保存。然而，传统 tris-glycine洗脱液对抗体活性损伤很大，不同抗体表现的不一致，经常会造成洗脱后的抗体发生变性沉淀，或效价相比于纯化前的血清急剧下降的情况。当抗体生产量大时，透析和添加保护剂等步骤也非常费时和费力。
发明内容
为解决上述传统方法在抗血清制备和纯化过程中存在的问题，本发明的目的是提出一种新的抗血清提取和纯化技术，采用三种特制的溶液，可不借助离心机，快速、高通量地获得用于亲和纯化的抗血清，并且可摆脱透析和添加保护剂的步骤，使纯化的抗体效价提尚。本发明解决上述技术问题采取的技术方案是一种高通量抗血清析出及纯化制备方法，依次包括以下步骤一、在任何器皿中预先加入5ml溶液I，再把整只兔子的血液注入其中；二、室温放置30分钟，血清便自动析出，分成两层，上层为血清，下层为血块，将上层血清分离，即得抗血清，血清产量比传统的离心法高出近20% ；其下层的血块与传统方法产生的血块不同，可轻松甩出器皿，之后用自来水稍加冲洗就可清洗干净；三、将步骤二得到的上层抗血清倒入流穿亲和纯化柱，用PBS溶液洗两次，然后依次用等体积的溶液II和溶液III洗脱抗体，最后用同一个收集管收集该两个组分，即得纯化的抗体。溶液I含有羧基或羟基的一种到几种物质和某种无机盐，其中的一种物质为多糖，这些物质与血液发生作用，使得血清快速析出，溶液中的盐离子又能保证血细胞不破裂，血液较长时间不变质。
溶液II和溶液III不含羧基、氨基、醛基物质，但含有三种酸根和含羟基的物质， 这些物质可以防止抗体在纯化过程中变性，也可以很好地解离蛋白之间的相互作用，还不影响抗体氨基、羧基的标记。步骤二得到的两层结构，如果不想立即进行血清纯化，可在4°C条件下保存14天， 不影响抗体质量，也不会出现溶血和腐败现象，而传统法会出现溶血，变质现象。步骤三得到的抗体溶液可直接冷冻保存，无需PH中和，无须透析，也不需要额外添加甘油进行保护，且抗体活性很高。本发明的有益效果是通过使用溶液I、II和III这三种溶液，可高通量并且高质量的完成抗血清的析出和纯化，并且极大的降低了生产成本。与现有的传统方法相比，本发明无需使用离心机离心及其他专用器皿即可获得血清，血清产量比传统的离心法高出近 20% ；分离出的血块与传统方法产生的血块不同，可轻松甩出器皿，之后用自来水稍加冲洗就可清洗干净，省工省力；如果不想立即进行血清纯化，可在4°C条件下保存14天，不影响抗体质量，也不会出现溶血和腐败现象，而传统法会出现溶血，变质现象；抗体溶液可直接冷冻保存，无需PH中和，无须透析，也不需要额外添加甘油进行保护，且抗体活性很高，是传统方法抗体效价的3到10倍，有些抗体达到100倍。为进一步说明本发明区别传统方法的显著的优点，现结合具体实验效果和数据进行对比参见附图1、2，图1是本发明血清制备的效果图，将兔血放入含有溶液I的管子中， 室温放置30分钟的效果。从图中可见上层血清量明显多于用传统方法得到的血清量，一般相比离心法可提高20%。图2是本发明抗体洗脱的数据对比图，总共测试了 8种抗血清(标记为I-VIII，见图中表A)，每种血清平均分成两份，序号1，3，5，7，9，11，13，15为传统方法洗脱结果，序号2，4，6，8，10，12，14，16为使用溶液II和溶液III进行纯化的结果，表A反映118的纯化物的抗体含量(OD28tl值正比于抗体浓度)，可见使用本发明的方法，抗体含量明显高于传统方法；图中图B表示这16种抗体的效价比较，使用本发明提供的溶液II和溶液III进行抗体纯化，可有效的防止抗体蛋白在纯化过程中的变性，平均抗体效价提高3 10倍，少数可提高100倍。又例如，若一个人按传统离心法每天要获得40个兔子的血清，假设使用50ml离心管，需要120根管子离血清，60根管子盛放离心好的血清。一般离心机每次可容纳6只管子，由于离心时需要平衡管，所以每次只能离3根血。除离心15分钟外，再加上减速用时间， 平衡，标记管子，倾倒等时间，差不多120根血要用了 20个小时。由于离心管成本很高，需要反复使用，而离心后的血块紧紧结合在离心管底，清洗较困难。120根管子清洗，及每根管子标记的清除，额外又需要4个小时。用了本发明的溶液1，40个兔子只需要40个干净的矿泉水瓶(或类似的便宜器皿)来收集兔血。室温静置30分钟后，血清自动析出，可立即倒出血清纯化，也可不必倒出血清在4°C长期保存以待需要时再使用。对于矿泉水瓶底的剩余的血细胞沉淀可不必清洗， 直接连瓶扔掉，如果需要清洗，只需甩掉沉淀，自来水冲洗三遍即可。可见，使用溶液I后， 不仅采血方便，而且取消了整个血清制备的中间过程，直接进入到将上层血清倒入纯化柱的纯化阶段，整个制备流程大大简化。按照传统的方法纯化40个抗血清，4% -10%纯化产品会出现沉淀或溶液不是十分透明(抗体已变性)，在透析袋加入和取出样品，标记样品都很费力，费时，也很容易造成抗体量或质的损失，加入甘油后要充分混勻才可进行冰冻保存，即使这样，传统方法纯化的有些抗体在冷冻保存时，抗体效价会随时间快速下降，造成很多抗体在最后的纯化一步中功亏一篑。而使用本专利提供的溶液II和溶液III进行抗体纯化，可有效的防止抗体蛋白在纯化过程中的变性，平均抗体效价提高3-10倍，少数提高100倍。另外，溶液I在将来很可能可以用于临床样品的血清快速检测(如常规手段，或蛋白芯片等新手段)，溶液II和溶液III不仅适合抗体纯化，也适合利用抗体柱进行抗原亲和纯化，对于科研和生产企业都有一定的价值。
图1是本发明血清制备的效果图。图2是本发明抗体洗脱的数据对比图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
，对本发明作进一步说明。一种高通量抗血清析出及纯化方法，可依次按照以下步骤制备一、在例如干净的矿泉水瓶或任何器皿中，预先加入5ml溶液I，再把一整只兔子的血液注入其中；二、室温放置30分钟，血清便自动析出，分成两层，上层为血清，下层为血块，将上层血清分离，即得抗血清；其下层的血块与传统方法产生的血块不同，可轻松甩出器皿，之后用自来水稍加冲洗就可清洗干净；如果不想立即进行血清纯化，可在4°C条件下保存14 天，不影响抗体质量，也不会出现溶血和腐败现象；三、将步骤二得到的上层抗血清倒入流穿亲和纯化柱，用PBS溶液洗两次，然后依次用等体积的溶液Π和溶液III洗脱抗体，最后用同一个收集管收集该两个组分，即得纯化的抗体；抗体溶液可直接冷冻保存，无需PH中和，无须透析，也不需要额外添加甘油进行保护。本方法使用的溶液I含有羧基或羟基的一种到几种物质和某种无机盐，其中的一种物质为多糖，这些物质与血液发生作用，使得血清快速析出，溶液中的盐离子又能保证血细胞不破裂，血液较长时间不变质。溶液II和溶液III不含羧基、氨基、醛基物质，但含有三种酸根和含羟基的物质，这些物质可以防止抗体在纯化过程中变性，也可以很好地解离蛋白之间的相互作用，还不影响抗体氨基、羧基的标记。
权利要求
1.一种高通量抗血清析出及纯化制备方法，其特征是依次包括以下步骤一、在任何器皿中预先加入5ml溶液I，再把整只兔子的血液注入其中；二、室温放置30分钟，血清便自动析出，分成两层，上层为血清，下层为血块，将上层血清分离，即得抗血清；三、将步骤二得到的上层抗血清倒入流穿亲和纯化柱，用PBS溶液洗两次，然后依次用等体积的溶液II和溶液III洗脱抗体，最后用同一个收集管收集该两个组分，即得纯化的抗体。
2.根据权利要求1所述的高通量抗血清析出及纯化制备方法，其特征是溶液I含有羧基或羟基的一种到几种物质和某种无机盐，其中的一种物质为多糖。
3.根据权利要求1所述的高通量抗血清析出及纯化制备方法，其特征是溶液II和溶液 III不含羧基、氨基、醛基物质，但含有三种酸根和含羟基的物质。
4.根据权利要求1所述的高通量抗血清析出及纯化制备方法，其特征是步骤二得到的两层结构的保存方法是在4°C、最长放置14天。
5.根据权利要求1所述的高通量抗血清析出及纯化制备方法，其特征是步骤三得到的抗体溶液可直接冷冻保存。
全文摘要
本发明公开了一种高通量抗血清析出及纯化制备方法，将整只兔子的血液注入5ml含有多糖的羧基或羟基的一种到几种物质和某种无机盐的溶液I的器皿中室温放置30分钟，得上层抗血清；然后倒入流穿亲和纯化柱，用PBS溶液洗两次，再依次用等体积的含有三种酸根和含羟基物质的溶液II和溶液III洗脱抗体，最后用同一个收集管收集该两个组分，即得纯化的抗体。可不借助离心机，省去透析和添加保护剂，血清得率、抗体活性高，适宜保存，且极大地降低了生产成本。
文档编号C07K16/06GK102212130SQ201010141048
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月7日 优先权日2010年4月7日
发明者李华 申请人:上海文渊阁生物科技有限公司