专利名称：基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法
技术领域：
本发明涉及的是一种中药制备技术领域的方法，具体是一种基于化学合成法的灵芝酸τ及灵芝酸Me的提纯方法。
背景技术：
灵芝作为一种名贵药材，在中国及东南亚地区有着悠久的药用历史。现代医药 研究表明，灵芝酸是灵芝重要的活性成分之一，具有抗癌，抗HIV病毒，抗炎症反应等药理 功能Acta. Pharmacol. Sin.，25 (11)，1387-1395，2004。近期，国际上有多个一线研究小组 陆续报告单体灵芝酸的抗癌功效及相关的抗癌机制，如灵芝酸D和X等Molecule&Cell Proteomics, 7 (5) ,949-961,2007 ；Life Sciences 77 (3)，pp. 252-265。其他现有技术也 表明，灵芝酸T和Me具有显著的抑制癌细胞生长和转移的功效Life Science,80 (3)， 205-211，2006 ；Process Chemistry, 44 (8), 928-933, 2009 ；CN200510026378. X。这些研究工 作表明了灵芝酸具有成为一种优良的，纯天然的辅助抗癌药物的巨大潜力。然而，现行低产 率的分离技术大大拖延了对其进行系统性药物开发的进程，因此单体灵芝酸制备工艺的开 发将成为今后相关药理研究和药物开发过程中的关键环节之一。目前，单体灵芝酸大规模制备面临主要难题在于灵芝酸为一类结构相似，含量 低的灵芝次生代谢产物。通常，灵芝细胞粗提液中存在几十种结构类似的灵芝酸，且这些 物质的含量相差不大，这就给制备性分离造成了很大的不便。即使某些高含量的灵芝酸， 如7-乙氧基灵芝酸0，已有了初步的大规模分离纯化方案CN200910308432. 8，但由于粗提 液中灵芝酸种类复杂，因此该工艺的放大前景有限。同时在此类灵芝酸分离提纯的废弃洗 脱液中亦存在大量各类结构类似的灵芝酸，这些有价值的废弃物是很难被现行灵芝酸分离 工艺所利用。现在，随着制备液相色谱，高速逆流色谱等现代制备分离仪器的发展和应用， 制备分离所能达到的柱效分离度有了显著地提高，但其依然不能完全解决从中草药提取液 这类复杂体系中分离单个活性有效成分的问题，更何况，这些设备昂贵，不适合工业化大产 生。因此，实现灵芝酸大规模制备的前提是建立一种简化中灵芝酸种类复杂性的高效低耗 的方法。灵芝酸是一类羊毛留醇型高度氧化的四环三萜酸。来源于菌丝体的灵芝酸主要可 分为两类I 类 II类 ^Jyl~~k/R2其母环结构基本类似，主要区别在于
1取代基的位置和种类；2环上是否具有共轭双键。因此利用化学合成法来修饰灵芝酸结 构，从而转化和合并灵芝酸种类，估计是一种提高特定灵芝酸提取分离效率的可行策略。据 报道，酸催化法能有效地使第一类灵芝酸中C7位的含氧取代基脱去，并通过电子转移在 C7，C9，Cll位形成和第二类灵芝酸一致的共轭双键结构，即将第一类的灵芝酸转化成相应 结构的第二类灵芝酸Agric. Boil. Chem. 51 (2)，619-622，1987。此外，菌丝体来源的灵芝酸 的取代基主要为羟基和乙酰基，而灵芝酸母环结构中又缺少可以被乙酰化的位点，因此，现 阶段急需一种通过乙酰化反应来合并灵芝酸的取代基种类，以达到进一步富集特定灵芝酸 如灵芝酸T和灵芝酸Me的方法。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于化学合成法的灵芝酸T及灵 芝酸Me的提纯方法，采用乙酰化和酸催化两步化学修饰，大幅简化了灵芝菌丝体灵芝酸粗 提液或以这类提取液为原料的灵芝酸分离提纯的废弃洗脱液中灵芝酸的种类和结构。同 时，由于多种灵芝酸转化生成为灵芝酸T和灵芝酸Me，这两种灵芝酸的含量得到显著提高。 保证了在低成本的情况下提供成分简单，易分离纯化的富含灵芝酸T和灵芝酸Me的灵芝酸 粗品，满足大规模活性灵芝酸分离制备对预处理工艺的需求。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤步骤一、将灵芝酸粗提液经旋转蒸发处理浓缩至浸膏状的灵芝细胞提取浸膏。所述的灵芝酸粗提液是指灵芝菌丝体灵芝酸提取液或含有灵芝酸的分离提纯废 弃洗脱液。所述的旋转蒸发处理是指采用旋转蒸发仪，设置环境温度为50°C以下进行浓缩蒸发。所述的灵芝菌丝体灵芝酸提取液是指采用氯仿、二氯甲烷，乙酸乙酯或乙醇中的 一种或其组合对灵芝菌丝体进行灵芝酸抽提后得到的提取液。所述的含有灵芝酸的分离提纯废弃洗脱液是指以灵芝菌丝体灵芝酸提取液为原 料，依次经过色谱分离、膜分离和电泳分离得到灵芝酸的过程中废弃的洗脱液。所述的灵芝菌丝体是指两阶段灵芝发酵得到的灵芝细胞经烘干处理后得到干燥 菌丝体；所述的灵芝细胞的获得方式如下67军军直卫生所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为 CGMCCN0. 5. 75 的菌株；上海吴淞中学发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为 CGMCCN0. 5. 110 的菌株；
日本京大发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为 CGMCCN0. 5. 533 的菌株；中国贵州发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为 CGMCCN0. 5. 616 的菌株；中科院微生物研究所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为 CGMCCN0. 5. 644 的菌株；中国农业科学院发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为 CGMCCN0. 5. 653 的菌株。步骤二、将灵芝细胞提取浸膏溶于有机溶剂中并加入乙酰化试剂，在反相液相色 谱监控下进行乙酰化反应。所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿或甲苯，其与灵芝细胞提取浸膏的比 例为 10-300g/L ；所述的乙酰化试剂为乙酸、乙酸酐或乙酰氯。所述的乙酰化反应中加入乙酰化反应催化剂以加快反应速率，其用量控制在反应 体系总容积的20%以内。所述的乙酰化反应催化剂为硼酸、四氟硼酸、浓硫酸、吡啶、4-二甲氨基吡啶 DMAP.4-吡咯吡啶PPY、对甲基苯甲酸、对甲基苯磺酸或1-丁基-3-甲基咪唑中一种或其组 合而成的离子液体体系。所述的在反相液相色谱监控下进行乙酰化反应是指设置反相硅胶C18，粒径 5 μ m，柱长150mm ；洗脱程序为80% -100%的HPLC级的甲醇，分析时间为25分钟，柱温为 400C，流速lmL/min，检测波长为225nm ；使用灵芝细胞提取浸膏质量的1 %至50%的乙酰化 试剂并控制反应温度在10-120°C，反应时间为1-24小时。步骤三、用中和液萃取乙酰化试剂，然后将乙酰化后的灵芝细胞提取液经旋转蒸 发处理浓缩至浸膏状后重新溶于甲醇或甲醇和水的混合体系中，并加入酸催化剂后在反相 液相色谱监控下进行酸催化反应。所述的萃取是指使用体积为反应总体积1至10倍的中和液来分离乙酰化试剂。所述的中和液是指纯水或者是含有与所加入的乙酰化反应催化剂摩尔质量相同 的氢离子或氢氧根离子的水溶液。所述的酸催化剂为盐酸、硫酸、甲酸、乙酸或固体催化剂，其中盐酸或硫酸的浓度 为0. 01-2mol/L ；甲酸或乙酸的浓度为0. 5-10mol/L ；固体催化剂，如强酸性阳离子树脂的 添加量为总容积的30%以内。所述的溶于甲醇或甲醇和水的混合体系是指乙酰化灵芝细胞提取浸膏的浓度为 20-50g/Lo所述的在反相液相色谱监控下进行酸催化反应是指设置反相硅胶C18，粒径 5 μ m，柱长150mm ；洗脱程序为80% -100%的HPLC级的甲醇，分析时间为25分钟，柱温为 40°C，流速lmL/min，检测波长为225nm；使得酸催化反应在10-80°C环境下反应5分钟至2 小时。步骤四、将酸催化反应产物中和后置于旋转蒸发仪中挥干，即得到灵芝酸粗品所述的灵芝酸粗品中灵芝酸T含量超过45%，灵芝酸Me含量超过25%。
所述的中和是指使用氢氧化钠来中和酸催化剂。本发明能通过两步化学修饰乙酰化和酸催化提高灵芝酸T及灵芝酸Me的提取分 离效率。本专利整合两项常规化学反应工艺，大幅简化灵芝菌丝体灵芝酸粗提液或以这类 提取液为原料的灵芝酸分离提纯的废弃洗脱液中灵芝酸的种类和结构。同时，通过使多种 灵芝酸转化生成为灵芝酸T和灵芝酸Me的方法显著提高这两种灵芝酸的含量。保证了在 低成本的情况下提供富含灵芝酸T和灵芝酸Me的灵芝酸粗品。以IOL的反应器为例，如 结合供热设备，日处理量可以达到1-2千克灵芝菌丝体灵芝酸粗提液或使用这类提取液为 原料的灵芝酸分离提纯的废弃洗脱液的浓缩物，若不使用供热设备，日处理量也可达到100 克左右，具有其他现存工艺无法与其相比的规模和价格优势。易于操作，方便推广，可以作 为今后单体灵芝酸T和灵芝酸Me的大规模分离纯化的重要步骤，以便简化分离难度，加强 分离效率。
图1为实施例1中灵芝酸粗提液的高效液相分析色谱图。图2为实施例1中最终产品的高效液相分析色谱图。图3为实施例2中最终产品的高效液相分析色谱图。图4为实施例3中最终产品的高效液相分析色谱图。图5为实施例4中最终产品的高效液相分析色谱图。图6为实施例5中最终产品的高效液相分析色谱图。图7为实施例6中最终产品的高效液相分析色谱图。图8为实施例7中经大孔树脂吸附色谱纯化后灵芝酸粗样的高效液相析色谱图。图9为实施例7中最终产品的高效液相分析色谱图。图10为实施例8中经硅胶色谱纯化后含有7-乙氧基灵芝酸0和灵芝酸T的流份 的高效液相分析色谱图。图11为实施例8中最终产品的高效液相分析色谱图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。实施例11.称取IOOg从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入IL乙酸乙酯，对灵芝干细胞 进行萜类提取，制成灵芝细胞粗提液，并使用旋转蒸发仪将其浓缩至浸膏状，得到浸膏状物 质10.3g。高效液相色谱分析如图1，其中含灵芝酸T 0.52g，灵芝酸Me 0. 3g。2.将灵芝细胞提取浸膏重新溶于IL 二氯甲烷中，并向其中添加50mL乙酸酐，3g DMAP做催化剂，在40°C的水浴环境中进行乙酰化反应8h。反应结束后，用500mL氢离子浓 度为0. 06mol/L的HCl溶液萃取反应体系中的催化剂DMAP及未反应的乙酸酐。经分液后， 含有DMAP的水相用于回收DMAP，含有灵芝酸的有机相经旋转蒸发处理后进行下一步反应。3.将乙酰化后的灵芝细胞提取浸膏重新溶于500mL氢离子浓度为0. lmol/L的HCl甲醇溶液中，置于40°C反应30min。用NaOH中和反应后的溶液，置于旋转蒸发仪中挥 干，即得到灵芝酸粗品3. 5g，其中含灵芝酸T 1.7g，灵芝酸Me 0. 87g。高效液相色谱分析如 图2 此实施例说明乙酰化和酸催化两步化学合成可显著提高灵芝酸T及灵芝酸Me的 提取效率，并大幅降低粗提液中灵芝酸的结构复杂性。实施例21.称取IOOg从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入IL乙酸乙酯，对灵芝干细胞 进行萜类提取，制成灵芝细胞粗提液，并使用旋转蒸发仪将其浓缩至浸膏状，得到浸膏状物 质10.3g。高效液相色谱分析如图1，其中含灵芝酸T 0.52g，灵芝酸Me 0. 3g。2.将灵芝细胞提取浸膏重新溶于IL 二氯甲烷中，并向其中添加50mL乙酸酐，4ml 吡啶做催化剂，在40°C的水浴环境中进行乙酰化反应8h。反应结束后，用500mL氢离子浓 度为0. 06mol/L的HCl溶液萃取反应体系中的催化剂DMAP及未反应的乙酸酐。经分液后， 含有DMAP的水相用于回收DMAP，含有灵芝酸的有机相经旋转蒸发处理后进行下一步反应。3.将乙酰化后的灵芝细胞提取浸膏重新溶于500mL氢离子浓度为0. lmol/L的 HCl甲醇溶液中，置于40°C反应30min。用NaOH中和反应后的溶液，置于旋转蒸发仪中挥 干，即灵芝酸粗品3. 6g，其中含灵芝酸T 1.15g，灵芝酸Me 0. 53g。高效液相色谱分析如图 3。对比实施例1，此实施例说明吡啶作为催化剂时，催化效率不高，不利于各类灵 芝酸的乙酰化反应，及灵芝酸T和Me的积累。实施例31.称取IOOg从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入IL乙酸乙酯，对灵芝干细胞 进行萜类提取，制成灵芝细胞粗提液，并使用旋转蒸发仪将其浓缩至浸膏状，得到浸膏状物 质10.3g。高效液相色谱分析如图1，其中含灵芝酸T 0.52g，灵芝酸Me 0. 3g。2.将灵芝细胞提取浸膏重新溶于IL 二氯甲烷中，并向其中添加50mL乙酸酐，0. 3g DMAP做催化剂，在40°C的水浴环境中进行乙酰化反应8h。反应结束后，用500mL氢离子浓 度为0. 06mol/L的HCl溶液萃取反应体系中的催化剂DMAP及未反应的乙酸酐。经分液后， 含有DMAP的水相用于回收DMAP，含有灵芝酸的有机相经旋转蒸发处理后进行下一步反应。3.将乙酰化后的灵芝细胞提取浸膏重新溶于500mL氢离子浓度为0. lmol/L的 HCl甲醇溶液中，置于40°C反应30min。用NaOH中和反应后的溶液，置于旋转蒸发仪中挥 干，即得到灵芝酸粗品3. 5g，其中含灵芝酸T 1.42g，灵芝酸Me 0. 68g。高效液相色谱分析 如图4对比实施例1，本实施例表明降低DMAP的用量会降低反应的速度，无法使灵芝酸 的乙酰化反应彻底完成。实施例41.称取IOOg从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入IL乙酸乙酯，对灵芝干细胞 进行萜类提取，制成灵芝细胞粗提液，并使用旋转蒸发仪将其浓缩至浸膏状，得到浸膏状物 质10.3g。高效液相色谱分析如图1，其中含灵芝酸T 0.52g，灵芝酸Me 0. 3g。2.将灵芝细胞提取浸膏重新溶于IL 二氯甲烷中，并向其中添加50mL乙酸，3g DMAP做催化剂，在40°C的水浴环境中进行乙酰化反应8h。反应结束后，用500mL氢离子浓度为0. 06mol/L的HCl溶液萃取反应体系中的催化剂DMAP及未反应的乙酸。经分液后，含 有DMAP的水相用于回收DMAP，含有灵芝酸的有机相经旋转蒸发处理后进行下一步反应。3.将乙酰化后的灵芝细胞提取浸膏重新溶于500mL氢离子浓度为0. lmol/L的 HCl甲醇溶液中，置于40°C反应30min。用NaOH中和反应后的溶液，置于旋转蒸发仪中挥 干，即得到灵芝酸粗品3. 6g，其中含灵芝酸T 1. 14g，灵芝酸Me 0. 58g。高效液相色谱分析 如图5对比实施例1，本实施例表明乙酸作为酰化剂，反应速度慢，不彻底。实施例5 1.称取IOOg从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入IL乙酸乙酯，对灵芝干细胞 进行萜类提取，制成灵芝细胞粗提液，并使用旋转蒸发仪将其浓缩至浸膏状，得到浸膏状物 质10.3g。高效液相色谱分析如图1，其中含灵芝酸T 0.52g，灵芝酸Me 0. 3g。2.将灵芝细胞提取浸膏重新溶于IL 二氯甲烷中，并向其中添加50mL乙酸酐，在 40°C的水浴环境中进行乙酰化反应8h。反应结束后，用500mL氢离子浓度为0. 06mol/L的 HCl溶液萃取反应体系中的催化剂DMAP及未反应的乙酸酐。经分液后，含有DMAP的水相用 于回收DMAP，含有灵芝酸的有机相经旋转蒸发处理后进行下一步反应。3.将乙酰化后的灵芝细胞提取浸膏重新溶于500mL氢离子浓度为lmol/L的HCl 甲醇溶液中，置于40°C反应30min。用NaOH中和反应后的溶液，置于旋转蒸发仪中挥干，即 得到灵芝酸粗品3. 5g，其中含灵芝酸T 1.35g，灵芝酸Me 0. 84g。高效液相色谱分析如图6对比实施例1，本实施例表明酸解反应时，高H+浓度会导致副反应的发生，不利 于灵芝酸T的积累。实施例61.称取IOOg从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入IL乙酸乙酯，对灵芝干细胞 进行萜类提取，制成灵芝细胞粗提液，并使用旋转蒸发仪将其浓缩至浸膏状，得到浸膏状物 质10.3g。高效液相色谱分析如图1，其中含灵芝酸T 0.52g，灵芝酸Me 0. 3g。2.将灵芝细胞提取浸膏重新溶于IL 二氯甲烷中，并向其中添加50mL乙酸酐，3g DMAP做催化剂，在40°C的水浴环境中进行乙酰化反应4h。反应结束后，用500mL氢离子浓 度为0. 06mol/L的HCl溶液萃取反应体系中的催化剂DMAP及未反应的乙酸酐。经分液后， 含有DMAP的水相用于回收DMAP，含有灵芝酸的有机相经旋转蒸发处理后进行下一步反应。3.将乙酰化后的灵芝细胞提取浸膏重新溶于500mL氢离子浓度为0. lmol/L的 HCl甲醇溶液中，置于40°C反应30min。用NaOH中和反应后的溶液，置于旋转蒸发仪中挥 干，即得到灵芝酸粗品3. 5g，其中含灵芝酸T 1.24g，灵芝酸Me 0. 63g。高效液相色谱分析 如图7对比实施例1，本实施例表明缩短乙酰化反应的时间，会使灵芝酸的乙酰化反应 不彻底。如需缩短反应时间，可根据反应热动力学的经验公式相应地提高反应温度。实施例71.称取IOOg从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入IL乙酸乙酯，对灵芝干细胞 进行萜类提取，制成灵芝细胞粗提液，并使用旋转蒸发仪将其浓缩至浸膏状，得到浸膏状物 质 10. 3g。2.将上述固体重新溶于1.5L工业酒精中，经NK8大孔树脂吸附色谱纯化，去除大量色素物质，含有灵芝酸的洗脱液蒸干后用于下一步反应。蒸干得固体6. 4g，其中含灵芝酸 T 0. 51g，灵芝酸Me 0. 28g，高效液相色谱分析如图8。3.将上述固体重新溶于IL 二氯甲烷中，并向其中添加50mL乙酸酐，3gDMAP做 催化剂，在40°C的水浴环境中进行乙酰化反应4h。反应结束后，用500mL氢离子浓度为 0. 06mol/L的HCl溶液萃取反应体系中的催化剂DMAP及未反应的乙酸酐。经分液后，含有 DMAP的水相用于回收DMAP，含有灵芝酸的有机相经旋转蒸发处理后进行下一步反应。4.将上述固体重新溶于500mL氢离子浓度为0. lmol/L的HCl甲醇溶液中，置于 40°C反应30min。用NaOH中和反应后的溶液，置于旋转蒸发仪中挥干，即得到灵芝酸粗品 3. 3g，其中含灵芝酸T 1.65g，灵芝酸Me 0. Slgo高效液相色谱分析如图9对比实施例1，本实施例表明NK8大孔树脂吸附色谱去除了一些干扰灵芝酸乙酰 化反应的杂质，因此经此类处理后的灵芝酸溶液更容易被乙酰化，反应进程比在灵芝酸粗 提液中明显加快。 实施例81.称取IOOg从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入IL乙酸乙酯，对灵芝干细胞 进行萜类提取，制成灵芝细胞粗提液，并使用旋转蒸发仪将其浓缩至浸膏状，得到浸膏状物 质 10. 3g。2.将上述固体重新溶于0. 5L乙醚中，按本实验室先前的专利CN200910308432. 8 进行硅胶色谱层析，收集含有7-乙氧基灵芝酸0，灵芝酸T的流份，蒸干后的固体2. lg，其 中含7-乙氧基灵芝酸01. 25g，灵芝酸T 0. 13g，高效液相色谱分析如图103.将上述固体重新溶于IL 二氯甲烷中，并向其中添加50mL乙酸酐，3gDMAP做 催化剂，在40°C的水浴环境中进行乙酰化反应4h。反应结束后，用500mL氢离子浓度为 0. 06mol/L的HCl溶液萃取反应体系中的催化剂DMAP及未反应的乙酸酐。经分液后，含有 DMAP的水相用于回收DMAP，含有灵芝酸的有机相经旋转蒸发处理后进行下一步反应。4.将上述固体重新溶于500mL氢离子浓度为0. lmol/L的HCl甲醇溶液中，置于 40°C反应30min。用NaOH中和反应后的溶液，置于旋转蒸发仪中挥干，即得到1. Sg纯度为 82%的灵芝酸T固体粉末。高效液相色谱分析如图11本实施例表明乙酰化偶联酸解反应的方法可以显著提高灵芝酸T的分离效率和得率。
权利要求
一种基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤步骤一、将灵芝酸粗提液经旋转蒸发处理浓缩至浸膏状的灵芝细胞提取浸膏；步骤二、将灵芝细胞提取浸膏溶于有机溶剂中并加入乙酰化试剂，在反相液相色谱监控下进行乙酰化反应；步骤三、用中和液萃取乙酰化试剂，然后将乙酰化后的灵芝细胞提取液经旋转蒸发处理浓缩至浸膏状后重新溶于甲醇或甲醇和水的混合体系中，并加入酸催化剂后在反相液相色谱监控下进行酸催化反应；步骤四、将酸催化反应产物中和后置于旋转蒸发仪中挥干，即得到灵芝酸粗品。
2.根据权利要求1所述的基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法，其特征 是，所述的灵芝酸粗提液是指灵芝菌丝体灵芝酸提取液或含有灵芝酸的分离提纯废弃洗 脱液，其中所述的灵芝菌丝体灵芝酸提取液是指采用氯仿、二氯甲烷，乙酸乙酯或乙醇 中的一种或其组合对灵芝菌丝体进行灵芝酸抽提后得到的提取液；所述的含有灵芝酸的分离提纯废弃洗脱液是指以灵芝菌丝体灵芝酸提取液为原料， 依次经过色谱分离、膜分离和电泳分离得到灵芝酸的过程中废弃的洗脱液。
3.根据权利要求1所述的基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法，其特征 是，所述的旋转蒸发处理是指采用旋转蒸发仪，设置环境温度为50°C以下进行浓缩蒸发。
4.根据权利要求1所述的基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法，其特征 是，所述的乙酰化反应中加入乙酰化反应催化剂以加快反应速率，其用量控制在反应体系 总容积的20%以内。
5.根据权利要求4所述的基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法，其特征 是，所述的乙酰化反应催化剂为硼酸、四氟硼酸、浓硫酸、吡啶、4- 二甲氨基吡啶DMAP、4-吡 咯吡啶PPY、对甲基苯甲酸、对甲基苯磺酸或1-丁基-3-甲基咪唑中一种或其组合而成的离 子液体体系。
6.根据权利要求1所述的基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法，其特征 是，所述的在反相液相色谱监控下进行乙酰化反应是指设置反相硅胶C18，粒径5 μ m，柱 长150mm ；洗脱程序为80% -100%的HPLC级的甲醇，分析时间为25分钟，柱温为40°C，流 速lmL/min，检测波长为225nm ；使用灵芝细胞提取浸膏质量的至50%的乙酰化试剂并 控制反应温度在10-120°C，反应时间为1-24小时。
7.根据权利要求1所述的基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法，其特征 是，所述的萃取是指使用体积为反应总体积1至10倍的中和液来分离乙酰化试剂。
8.根据权利要求7所述的基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法，其特征 是，所述的中和液是指纯水或者是含有与所加入的乙酰化反应催化剂摩尔质量相同的氢 离子或氢氧根离子的水溶液。
9.根据权利要求1所述的基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法，其特 征是，所述的酸催化剂为盐酸、硫酸、甲酸、乙酸或固体催化剂，其中盐酸或硫酸的浓度为 0. 01-2mol/L 甲酸或乙酸的浓度为0. 5-10mol/L固体催化剂，如强酸性阳离子树脂的添 加量为总容积的30%以内。
10.根据权利要求1所述的基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法，其特征是，所述的在反相液相色谱监控下进行酸催化反应是指设置反相硅胶C18，粒径5 μ m, 柱长150mm ；洗脱程序为80% -100%的HPLC级的甲醇，分析时间为25分钟，柱温为40°C， 流速lmL/min，检测波长为225nm ；使得酸催化反应在10_80°C环境下反应5分钟至2小时 。
全文摘要
一种中药提取技术领域的基于化学合成法的灵芝酸T及灵芝酸Me的提纯方法，通过将灵芝酸粗提液经旋转蒸发处理浓缩至浸膏状的灵芝细胞提取浸膏，然后将灵芝细胞提取浸膏溶于有机溶剂中并加入乙酰化试剂，在反相液相色谱监控下进行乙酰化反应，用中和液萃取乙酰化试剂，然后将乙酰化后的灵芝细胞提取液经旋转蒸发处理浓缩至浸膏状后重新溶于甲醇或甲醇和水的混合体系中，并加入酸催化剂后在反相液相色谱监控下进行酸催化反应，最后将酸催化反应产物中和后置于旋转蒸发仪中挥干，即得到灵芝酸T含量超过45％，灵芝酸Me含量超过25％的灵芝酸粗品。
文档编号C07J9/00GK101845074SQ201010199508
公开日2010年9月29日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者王家乐, 秦汉林, 钟建江 申请人:上海交通大学