专利名称：Hiv-1 o组(或亚组)逆转录病毒抗原的核苷酸序列的制作方法
HIV-1 0组(或亚组)逆转录病毒抗原的核苷酸序列本发明涉及通过表达核苷酸序列或通过化学合成(例如采用AppliedBiosystems 牌合成仪)获得的存在于HIV-I 0组(或亚组)变体中的抗原，更具体地说是相应于可以 从病毒颗粒分离的抗原的那些抗原。本发明也涉及由这些抗原诱导的单克隆或多克隆抗体。本发明也涉及具有类似于或互补于以上提及的病毒基因组RNA之序列的克隆DNA 序列。本发明也涉及制备这些克隆DNA序列的方法。本发明还涉及包含由所述克隆DNA序 列编码的氨基酸序列的多肽。此外，本发明涉及以上提到的抗原在某种形式的艾滋病高危个体中体外检测上的 应用，这些抗原中的某些在产生针对这种逆转录病毒的致免疫组合物和免疫接种组合物上 的应用。类似地，本发明涉及以上提到的抗体在相同目的上的应用，这些抗体中的某些在产 生用于抗这一人类艾滋病之医药产品的活性物质上的应用。本发明也涉及克隆DNA序列和从这些序列获得的多肽在诊断试剂盒中作为探针 和基因扩增引物上的应用。本发明也涉及抗原组合物，该组合物可以由化学合成或重组细胞宿主表达获得， 其使得可以诊断由HIV-I或HIV-2亚型不依赖性HIV型人逆转录病毒引起的感染。这种组 合物包含至少一种选自与HIV-I、HIV-2、HIV-1(duk)和HIV-I (VAU)病毒相同的抗原肽或者具有 类似致免疫特征的所述抗原肽的变体。本发明也涉及这样一种组合物，其使得可以特异性地诊断由HIV-I型(更具体地 说是HIV-IM组)、HIV-2或HIV-I 0组(或亚组)逆转录病毒引起的感染，它包含至少一种 对HIV-I病毒特异性的抗原肽、对HIV-2病毒特异性的抗原肽和对HIV-I 0组(或亚组) 病毒特异性的抗原肽或者具有类似致免疫特征的这些抗原肽的变体。更具体地说，所述的 抗原肽来源于HIV-I M组和HIV-2和HIV-I 0组(或亚组)病毒的包膜蛋白。此外，本发明涉及这样一种肽，基于(特别是基于)发现新HIV-I毒株HIV-I DUR,这种肽使得可以检测抗-HIV抗体，现有技术的肽总是不使检测所述的肽成为可能。针 对它的抗血清与现今使用的共有HIV肽总是不具有反应性。术语“共有HIV”指分离物之间 保守的区，其阐明对设计诊断试剂或疫苗是必需的，并且其突变赋予对抗病毒医药产品的 抗性。本发明中使用的术语“肽”定义为寡核苷酸和多肽两者。现有技术状态在LAS或AIDS发展中起作用的两种类型的人类免疫缺陷病毒(HIV)已被分离并 确定特征。被称为LAV-I或HIV-I的第一种病毒已被分离，并且在英国专利申请83 ，800 和欧洲专利申请84401, 834(14/09/1984)中有描述，该病毒也由F. Barrie-Sinoussi等在 科学(1983)，220，868-871 中描述。2型HIV逆转录病毒属于不同的类别，与1型HIV逆转录病毒仅有有限的免疫学关 系。HIV-2逆转录病毒在欧洲专利申请87，400, 151，4 (公开号239，425)中已有描述。HIV-I逆转录病毒是最普遍的，其存在在世界上几个地区占优势。就HIV-2而言， 最多的是在西非发现，尽管Grez等((1994)病毒学杂志，68，2161-2168)最近报道了其在这
4一地区之外传播。灵长类免疫缺陷慢病毒属(包括1型和2型人免疫缺陷病毒以及几种类型的非人 灵长类病毒)的总数数量上和复杂性上逐渐增加。这些病毒的最普遍的HIV-I当前以在世 界范围内流行的方式传播，产生最大的公共卫生问题。在这种病毒的鉴别和分子特征确定 之后不久，其被认识到是高度可变的，目前包括若干亚型(Myers，1994，Louwagie等，1993， Louwagie等，1992，Myers, G. (1994)在人类逆转录病毒和爱滋病1994中的HIV-I亚型系 统树；Myers, G. , Korber, B. , ffain-Hobson, S. , Smith, R. F.禾口 Pavlakis, G. N. , Eds. Los Alamos国家实验室，LosAlamos，NM. II1-2-111-9)。这种亚型的分型主要基于gag和env的 差别。至少已鉴别出6种亚型，指定为A到F，但在基于HIV-I分离物的正在进行的广泛的 世界范围的调查中很可能还出现几种亚型。业已发现这些各亚型在被成为星号(star)系 统发育的系统发育轮廓上是相互等距离的。这表明各HIV-I亚型可能已进化并且同时区别 于共同的祖先。前不久，HIV-I病毒这一组的2种不同的病毒被分离并确定特征。这两种病毒是 从生活在非洲中西部的喀麦隆的病人中获得的(Gurtler等，1994，Vanden Heasevelde等 1994)。它们的序列，更具体地说是它们的env (包膜)基因的序列，清楚地显示这些病毒属 于HIV-I相关病毒的一个不同的类别。称为HIV-I O组(Nkengasong等，1993)。然而，这一 HIV-I相关病毒组内的分离物的差别是未知的，其在非洲之外的扩散 未见报道。开发HIV血清学检验中的总的要点是避免假阳性或假阴性结果-同时保持或改善 以前的试验所具有的血清反应阳性性检测的敏感性。在发现HIV-I-O变体之前，基于采用共有肽(基本上得自“env”基因)的试验被 认为是揭示假阴性结果之可能性的近乎理想的解决办法(基因组克隆和高趋异进化非洲 人免疫缺陷病毒分离物的全序列分析，病毒学杂志，1994 ；68 =1586-96 ；来源于喀麦隆的人 免疫缺陷病毒1型的新亚型(MPV-5180)，病毒学杂志，1994 ；68 :1581-85)。某些用“env”肽抗原的试验的非反应性(然而在病人中表现出(有时在它们之 前)某种艾滋病临床综合病症特征或淋巴结病综合病症)有时归因于HIV-I-O组感染(在 HIV-I 0亚型感染病人中的HIV-1/HIV-2血清学反应阴性性，Lancet, 1994 ；343 :1393-94 ； 瑞士的新 HIV-I 亚型，Lancetl994 ；344 :270-71)。发明描述本发明的目的是为诊断实验室提供一种手段，具体说来是一种特异性肽，其使得 可以检测迄今不能检测的抗HIV抗体。本发明也涉及从HIV-I DUR获得的肽混合物和从其 它HIV获得的相应的肽的混合物，以避免潜在的"假阴性"结果。此外，本发明涉及在生物样品中检测和辨别HIV-I-M型逆转录病毒特征性抗体和 HIV-I 0组(或亚组)逆转录病毒特征性抗体的方法。本发明基于在一个血清学反应阳性女性(曾在喀麦隆逗留，表现出非典型的血清 学反应性)上在几个筛选HIV感染的试验(这些技术已被〃 Western印迹〃技术证实)中 的观察结果。考虑到这一非典型的血清学反应性，特别是即使修饰0型也缺乏对某些第三-产 生试验的反应性，本发明的发明人认为进行这一 HIV-I DUR毒株基因组某些部分(更具体地说是GAG和ENV基因)测序是有益的。然而，利用从M组获得的引物和从0组获得的已知引物经PCR成功地进行了 gpl20 的V3环的编码部分和gp41的优势免疫区的基因扩增。仅GAG区可以用现有技术已知的引 物(Loussert-AjakaLLancet 1994 ；343 :1393)扩增。因此，本发明的另一个目的是确定能 够解决这一问题的引物。测定了糖蛋白gp41和gpl20的部分序列，也测定了来源于淋巴细胞DNA以及病毒 的培养物的衣壳蛋白质(GAG基因)，结果表明这一 HIV-I DUR毒株部分属于HIV-I-O组，其 与M组(更具体地说是与gp41和gpl20)有很大的不同。这样，有可能说明(更具体地说是说明HIV-1(_GAG序列)在几个区0组共有序 列的存在，其不同于相同区的M组共有序列。在包含有PSTl位点的Bluescript 质粒中进行GAG、gp41和gpl20片段的
编码序列。按照采用T3和T7通用引物的标准技术或者经采用先前扩增的引物直接测序 来克隆扩增产物。然后，所述序列用应用生物系统373A自动测序仪(ESGS Montigny Ie Bretonneux，法国)测定。在本发明中，发明人已从0组分离物HIV-I(VAU)分离env基因并测序，所说分离 物是从从未离开过欧洲的并于1992年死于艾滋病的法国病人获得的。按照其包膜序列， HIV-I(VAU)与两种最近确定特征的喀麦隆病毒HIVantto和HIVmvp518ci相关。env基因的系统发 育分析揭示三种病毒看来似乎构成一个单独的组，本文称为HIV-I 0组。HIV-1(vau)从这一 病人分离也表明HIV-I _0组的传播范围已在非洲之外发生。HIV-I (VAU)病毒的分离HIV_1(vau)病毒是1992年从41岁患爱滋病的法国病人中分离到的。这一病人在 1986年表现出严重的与子宫颈癌相关的无色中性白细胞减少(leuconeutropenia)。然而 她逐渐表现出机会感染的症状，循环CD4+数量较低，其1992年死于艾滋病。1990年首次用 ELISA (Elavia, SanofiDiagnostics Pasteur 和 Abbott 试验)检测抗 HIV-1 抗体。该病人从未离开过欧洲，没有静脉内使用过医药产品，也没有接受过任何已知的 血液输注。没有已辨明的非洲来源的性伙伴。她于1971年生下一个健康的孩子，但1980 年生下的一个儿子在很能说明新生期艾滋病的疾病临床发作后在1岁时死亡。其1983年 出生的第三个孩子和其丈夫目前健康状况良好，未被感染。按以下方式进行病毒的分离用涂上一层I 0 T8抗体(Immimotech)的小珠除去 在病人PBMCs (外周血淋巴细胞)中存在的⑶8+细胞。用植物血细胞凝集素刺激这些余下 的PBMCs，然后，与从健康供体获得的CD8+-缺失PBMCs —起共培养，并用植物血细胞凝集素 刺激。通过测定上清液的逆转录酶(RT)活性和经HIV-IpM的ELISA试验(由DuPont推 向市场的诊断试剂盒)监测共培养中的病毒生长。从初级共培养获得的病毒进行CD8-缺 失和植物血细胞凝集素-刺激PBMC培养物中的几次继代移植。进行了用HIV-1(vau)感染各 种转化的细胞系的几种尝试，所说细胞系包括MT4细胞(Harada等，1985)和CEM细胞(Rey 等，1989)以及 Hela-CD4-LTRLacZ 细胞系 P4-2，(Clavel 和 Charneaul994)。HIV-I_)的生物学特征在与健康供体的类似细胞一起共培养病人的CD8-缺失，植物血细胞凝集素-刺激 PBMCs两周后，以RT活性高峰的形式在培养物上清液中检测病毒的产生。然后可以将这病毒在⑶8-缺失，PHA-刺激的正常的PBMCs上进行系列继代移植。在
图1中，图IA代表在 感染PBMC培养物上清液中HIV-1(vau)的产生，其由RT试验(实心圆圈)和HIV-I p24抗原 俘获ELISA(空心圆圈)检测。HIV-IpM的浓度以毫微克/毫升表示，RT活性以cpm/μ 1 表示。在图IB中，用从艾滋病患者获得的初级HIV-I分离物进行相同的实验。尽管HIV-1_)的生长可容易地被RT试验检测，但经HIV-lpMELISA(DuPont)在 培养上清液中检测病毒实质上具有较低的灵敏度。图1显示了用Hiv-1(VAU)和来源于艾滋 病患者的初级Hiv-I分离物的PBMCs的有效感染的轮廓之间的比较结果。就等量的颗粒而 言，在所试验的上清液中用RT活性试验检测时，在HIV-I(VAU)的情况下与在其它HIV-I分离 物的情况下比较，约少25倍的pM被检测到。这种不同可能是由于单克隆抗体对HIV-IpM 是特异性的，该抗体用于涂覆在ELISA平板上，对HIV-l(VAU)gag产物仅具有弱的亲和性。进行了在对HIV-I敏感的转化的人类T细胞系上繁殖HIV-1_的几种阴性尝试。 具体地说，由HIV-I (VAU)感染的PBMCs和MT4细胞或CEM细胞的共培养物不导致病毒的 繁殖。也发现这一病毒不能感染携带有IacZ基因(可由tat基因诱导)的⑶4+HeLa细胞 (P4-2) (Clavel和Charneaul994)。同样地，在来源于几种黑猩猩的活化的外周血淋巴细胞 中不能检测到HIV-I(VAU)的复制。HIV-I(VAU)包膜序列的分析(稍后将详尽地描述)和与前不久所描述的两种喀麦隆 分离物的序列的比较表明，所有三种病毒都属于HIV-I相关病毒的相同的组。此外，这一比 较表明，这三种病毒变体相互大约是系统发育等距离的。因而，三种病毒变体其自身各自构 成它们的组的不同亚型，现在被称为HIV-I 0组。这一组不同于迄今所鉴别的其它HIV-I 分离物的组(发明人在此称为HIV-I M组)。这一新组的出现产生了它的起源问题0组是从M组病毒进化的吗(或相反)或者 各组具有不同的历史吗？发明人认为，迄今M组和0组具有类似的趋异轮廓，很可能它们各 自相应于不同人群中的不同病毒祖先的趋异进化。从目前可获得的系统发育和病毒学数据 不可能估计两组的祖先是天然地影响人的还是从其它物种引入到人类的。仅类似于存在在 非人灵长类中的HIV-I的病毒是SIVCPZGAB分离物(Huet等，1990)，其是从明显天然感染 的黑猩猩分离的，明显不同于M组和0组两者，没有其人类等同物被发现。0组病毒不可能 是最近从黑猩猩病毒进化来的，因为HIV-1(vau)在黑猩猩淋巴细胞中的复制没有取得成功。为什么0组的流行仅出现在M组之后15至20年？有三种可能的解释首先，0组 病毒的祖先进入人类被认为比M组更近期地出现；其次，由于在其来源区域的社会条件不 同，与0组比较，可能M组可以更早地扩散；第三，与M组病毒比较，0组病毒可能具有较低的 传播能力。业已提出这种性质解释了 HIV-2不出现明显世界范围的传播，感染宿主中HIV-2 较小的病毒荷载与降低的传播性相关联(DeCock等，199 。在这一点上，虽然在由HIV-I 0组感染患者中有关病毒荷载没有可供使用的数据，但是这些病毒的致病性没有显示出与 HIV-I的不同。与从其中获得HIVmvp518ci 0组分离物的病人一样，从其中分离HIV-1(VAU)的病 人死于艾滋病。然而，HIV_1(vau)病人感染的历史仍然不清楚，但是，如她的第二个孩子患有类似于 艾滋病的综合病症所提示的，有若干线索说明这一病人在1980年之前被感染。本发明涉及HIV_1(vau)病毒或任何0组等价病毒的核酸序列的任何变体，包括具有 与被erw基因编码的结构蛋白质相同的免疫学性质的结构蛋白质，所说基因具有图6所描
7述的序列，被称为"vau"，也被指定为kq IDNo. 50本发明也涉及一种组合物，该组合物包含按照本发明任何抗原或按照本发明的抗 原的混合物以及得自一种或多种HIV-I 0组病毒或得自其它变体病毒的提取物，和另一方 面得自一种或多种HIV-2和/或HIV-I病毒的提取物，另一方面这些组合物可以是可以不 是标记的。采用任何类型的合适的标记(酶，荧光，放射性等)是可能的。核酸本发明涉及DNA或者DNA片段，更具体地说涉及可以从RNA，cDNA或可以用于PCR 或其它基因扩增方法的引物获得的克隆DNA和DNA片段，来源于HIV-1_逆转录病毒RNA 或DNA的克隆DNA和DNA片段。本发明更具体地说涉及所有等同DNA，特别是涉及具有同 源于HIV-I(vau)DNA的序列，特别是具有编码HIV-I(VAU)毒株env区之序列(包括相应于称 为〃 vau"的以图6代表的kq ID No. 5的序列)的任何DNA。与HIV-1 M组的同源性至 少等于50%，优选的等于70%，更优选的等于约90%。总的来说，本发明涉及能够与0组 HIV-I逆转录病毒DNA或RNA杂交的等价DNA (或RNA)。本发明也涉及相应于以上所限定的DNA序列的RNA序列。本发明也涉及HIV_1(VAU)病毒整合酶基因，其包括由名称kq ID No. 7所限定的序 列或与kq ID No. 7杂交的序列。本发明也涉及相应于以上所述DNA的RNA。本发明的主题也是一种组合物，其包含被以上提到的DNA或DNA片段所编码的肽 或多肽。衍生自VAU序列或者是衍生自HIV-I (VAU)病毒整合酶基因的寡核苷酸，特别是包含 至少9个核苷酸的寡核苷酸，可以用于在生物样品，细胞培养物或者细胞抽提物中用PCR技 术或任何其它基因扩增技术检测0组HIV-I病毒DNA或者RNA序列。这些序列可以用作 基因扩增引物或用作特异性检测基因扩增产物的探针。也可以用作杂交探针的是扩增产物 或者它们相应的从化学合成(应用生物系统)获得的合成序列。本发明也包括可以在杂交反应中用作探针和可以在高度严格杂交条件下与 HIV-I(VAU)变体的部分基因组反应的至少100个核苷酸的任何片段。HIV-1(vau) env基因的 克隆和测序就HIV-I(vau)DNA的初始的PCR扩增而言，从由HIV-1 _)感染的PBMCs提取总DNA， 用以下简并引物扩增Pol基因区段引物 4506 5 AGTGGAT (A/T) (T/C) ATAGAAGCAGAAGT 3 ；Seq ID No. 1 ；引物 5011 :5 ACTGC(C/T)) CCTTC(A/C/T) CCTTTCCA 3 ；Seq ID No. 2 ；反应介质包含50mM KCl，IOmM Tris-KCl (pH 值 8. 9)，1. 5mM MgCl2,0. 1 毫克 / 毫 升明胶，0. 2mM dNTP, IU尾端聚合酶(Amersham)。PCR进行43个热循环，在92°C 10秒钟， 50 0C 1 分钟，72 °C 40 秒钟。形成的扩增产物被克隆进pBluescript载体，产生克隆ph4，其特征在于1994年 10月20日以保藏号1-1486保藏在CNCM，接着将其用作探针，筛选低分子量DNA的λ文 库，其是用EcoRI消化并且是从由HIV-1(vau)感染的细胞获得的。简言之，由HIV-1_)感 染的PBMCs与用植物血细胞凝集素刺激的新PBMCs —起并且在排除CD8+细胞下共培养M 小时。此后可见高的细胞致病作用(CPE)。然后按照Hirt的方法(Hirtl967)提取低分子 量DNA，以酶EcoRI消化。这一 DNA的以前的Southern-印迹确实显示HIV-I(VAU)基因组仅包含EcoRI位点，允许克隆代表整个病毒基因组的非整合环状DNA物种。将所形成的消化 产物进行凝胶电泳，将大小约8-121Λ的DNA片段群纯化，并连接于EcoRI-消化的XZap DNA(Stratagene)。在衣壳化后，平板接种并经采用标记的ph4DNA的杂交筛选，克隆 λ H34被鉴别为阳性并扩增。纯化EcoRI插入物，超声处理，并经"shotgun"技术克隆进 磷酸酶-处理的以酶SmaI消化的载体M13mpl8。所获得的150个克隆在373A DNA测序仪 (应用生物系统)中测序，采用威斯康星GCG DNA分析包将所形成的序列装配进单一序列。这种序列分析揭示了在读框中的许多无意义的密码子，其很好地说明超变基因组 (Vartanian等，1991)。这一序列是不稳定的，因而决定经PCR扩增HIV-l(VAU)env基因，扩 增中采用由HIV-1(vau)感染的PBMCs的总DNA和源于序列λ Η34的寡核苷酸引物引物 ΤΗ2 5 GCTCTAGATGGGGATCTCCCATGGCAGG 3 Seq ID No. 3 ；引物 UH2 5 GCTCTAGATCAGGGAAGAATCCCTGAGTGT 3 Seq ID No. 4。PCR扩增进行35个热循环，在92°C 15秒钟，52°C 1分钟，60°C 2分钟，72°C 2分钟。 形成的大小3. 5kb的扩增产物被克隆进M13mpl8载体并经后续反应测序，首先采用M13通 用测序引物，然后采用从上游序列推断的引物。用威斯康星GCG DNA分析包分析核苷酸和 肽序列。HIV-l_env基因总共编码877个氨基酸，包括信号肽。HIV-l(VAU)env基因的核苷 酸序列相应于ID No. 5 (参见图3)。核酸作为探针的用途本发明也涉及DNA，cDNA或者其片段，以及包含这些片段的重组质粒或其它等同 载体作为探针的用途，所说探针用于在从怀疑携带Hiv-1(VAU)病毒的患者获得的血清样品或 其它生物体液或组织中检测HIV-I(vau)病毒的存在与否。这些探针可以是可以不是标记(放 射性，酶或荧光标记等)的。在实施检测Hiv-I(VAU)病毒或HIV-I(_)变体的方法上特别有 价值的探针的特征可以是它们包含全部或部分DNA，所说DNA互补于HIV-1(vau)病毒基因组 或者包含在各种克隆中的特定的片段。包含所有或部分env区的HIV-I(vau)cDNA片段将被 特别提到。用于这一检测HIV_1(vau)病毒之方法中的或者诊断试剂盒中的探针不以任何方式 限制在前面所描述的探针。它们包括从HIV-I(VAU)病毒或HIV-1(vau)变体或者结构类似的病 毒获得的所有核苷酸序列，其前提是它们使得可以采用来自很可能患有艾滋病的个体的生 物体液经与HIV-I(VAU)病毒DNA或RNA杂交检测HIV-I 0组病毒，特别是HIV-I(VAU)。特别有利的是这样一些探针，当与HIV-I杂交时，它们给出与属于0组的HIV的强 的反应和与属于M组的HIV的弱的反应。非限制性的例子是，从HIV-I病毒整合酶基因序列 (Seq ID No. 7)构建的探针在杂交条件下(例如专利EP178978中所描述的那些)与HIV-I 杂交时，给出与0组HIV强的反应和与M组HIV弱的反应。所说的检测可以以任何已知的方式进行，所说方式尤其是通过把这些探针与从包含在生物体液(例如脊髓液，唾液等)中之细胞获得的核 酸接触或者与这些体液本身(只要它们的核酸已经能用于与这些探针杂交)接触，这一接 触是在允许这些探针和这些核酸之间杂交的条件之下进行的，和通过检测可能产生的杂交。以上提到的牵涉杂交的诊断也可以采用分别得自HIV_1(VAU)、HIV-I和HIV-2的探 针混合物完成，只要不必区分所需HIV病毒型。
包含编码HIV-I包膜蛋白质之序列的表达载体和包含编码所述的整合酶的表达 载体也是本发明的主题。本发明包括用于在从很可能携带HIV_1(vau)病毒的患者获得的血清样品或其它生 物体液或组织中检测HIV-I(vau)病毒的存在与否的组合物。这些组合物的特征是它们包含 至少一种从得自或源于Hiv-1(VAU)病毒基因组(特别是包含Hiv-1(VAU)病毒或HIV-1(vau)变 体env蛋白质编码区或编码区部分的HIV-1(vau)DNA片段)的核苷酸序列获得的探针。有利地是，以上所描述的组合物也包含从源于HIV-I或HIV-2的核苷酸序列获得 的探针。其它诊断组合物包含本发明的引物，所述引物可以用于0亚组逆转录病毒或这些 逆转录病毒变体的基因扩增。 抗原，尤其是蛋白质和糖蛋白本发明涉及HIV-I 0组(或亚组)逆转录病毒蛋白质，或者包含至少一部分所述蛋 白质的天然或合成肽或多肽，其能够被可以从血清分离的抗体识别，所述血清是在由HIV-I 0组VAU毒株或者HIV-I 0组DUR毒株感染后获得的。本发明涉及由包含相应于kq ID No. 5的序列的基因编码的HIV_1 (VAU)逆转录病 毒的外包膜蛋白。按照本发明优选的实施方案，这一蛋白质的特征还有它包含相应于^^ ID No. 6的图3所示的氨基酸序列并包含氨基酸残基1到526。得自所述序列具有可以被 HIV-1(vau)病毒诱导的抗体识别的表位的任何多肽或肽也是本发明的主题。以上所提到的蛋白质可以以糖基化或者非糖基化的形式获得。包含氨基酸残基527和877之间的图3所示的氨基酸序列kq ID No. 8的包膜跨 膜蛋白质也是本发明的主题。在本发明范围内的这一跨膜蛋白质是糖基化或非糖基化形式 的。本发明也涉及通过表达HIV-1_)基因组编码序列获得的并且具有等价于 HIV-I(VAU)的生物学性质的所有的抗原，尤其是蛋白质，糖蛋白，多肽或肽。倘若它们被相同 的抗体(尤其是可以从由已感染HIV-1(vau)的病人获得的血清分离的抗体)识别，则这些抗 原被说成是本发明范围内等价的。具体地说，化学合成的其氨基酸序列包含在HIV-I(VAU)包膜蛋白质(其序列由图3 代表)中的肽或多肽或者等价肽或多肽也是本发明的主题。其中也应当包括的是等价肽、多肽、蛋白质或糖蛋白、以上抗原的片段和经化学合 成或基因工程方法制备的肽，只要它们与其所源于的抗原发生免疫交叉反应。换句话说，本 发明涉及具有相同于或类似于以上提到抗原的表位并且能够被相同的抗体识别之表位的 任何肽或多肽。后面这一类型的多肽的形成部分是相应于编码以上提到的多肽或抗原之 DNA序列的DNA序列的表达产物。更具体地说，从HIV_1(vau)病毒获得的或者经基因工程或常规化学合成产生的并且 是本发明的最大的目标的抗原是这样一些抗原，它们使得获得本发明的HIV_1(vau)病毒和 HIV-I和HIV-2组病毒之间的明显区别成为可能。在这一点上，在HIV-I(VAU)病毒包膜蛋白 水平上以及PM蛋白质外蛋白优势免疫表位水平上已观察到大量的区别。明显地是gag和 pol蛋白质比包膜蛋白表现出与HIV-I病毒更大的相似性。本发明也涉及相同于HIV_1(vau)包膜跨膜糖蛋白优势免疫区的肽或多肽。所述区由图3所示。这个区的优选的多肽是，例如，包含序列CKNRLIC的那些或相应于这一序列的 那些。它们也可以是相应于序列RLLALETFIQNWffLLNLWGCKNRLIC或包含这一序列的肽或者多肽。以下由名称"VAU肽"所限定的另一个更为优选的肽相应于以下序列或者包含 这一序列或者包含这一序列的能够被针对Hiv-1(VAU)逆转录病毒之抗体识别的任何部分R ARLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRLICYTSVKWNKT。这一序列的变体多肽是例如图4所示的HIV-1_5_和HIV-Iiant7t0分离物的多肽。 这些序列也可以经插入和/或缺失和/或取代(例如经氨基酸残基的保守取代)从上面的 序列衍生。本发明涉及从HIV-I-O DUR病毒(于1995年2月23日以保藏号1-1542保藏在 CNCM)获得的肽或者这样一些肽，由于氨基酸的取代，缺失或者添加，其序列不同于以上那 些，但其保持以上各种的抗原特征。本发明的范围内的其它肽在下面限定。这样，本发明优选的肽是从HIV-I-O DUR病毒获得的包含至少4个保守氨基酸的 肽，所述的氨基酸包含在图8所示的GAG序列中或者免疫学上类似的GAG序列中，所述的免 疫学上类似的序列被也特异性识别序列AHPQQA，LffTTRAGNP (包含在图8的GAG序列中)至 少一个之抗体识别。优选地，这一肽包括氨基酸序列包含在以下序列之一中或相应的免疫学上类似的 序列中的肽SPRTLNAffVKAVEEKAFNPEIIPMFMALSEGA(1)MLNAIGGHQGALQVLKEVIN(2)GPLPPGQIREPTGSDIAGTTSTQQEQI(3)IPV⑶IYRKWIVLGLNKMVKMYSPVSILDI(4)
QGPKEPFRDYVDRFYKTKLAE(5)AHPQQA (5a)LffTTRAGNP (5b)这一肽包含所述序列之一的至少4个连续的氨基酸。优选地这一肽包括氨基酸序列包含在以下序列之一中或相应的免疫学上类似的 序列中的肽SPRTLNAffVK (6)GSDIAGTTST(7)QGPKEPFRDYVDRF(8)本发明特别优选的肽是包含氨基酸序列NPEI (9)或氨基酸序列 AVEEKAFNPEIIPMFM(10)的肽，更具体地说是其氨基酸序列包含在以下序列之一中或相应的 免疫学上类似的序列中的肽IGGHQGALQ (23)REPTGSDI (24)这一肽包含所述序列之一的至少4个连续的氨基酸，以及其氨基酸序列包含在以 下序列之一中或相应的免疫学上类似的序列中的肽
INDEAADffD (25)这一肽包含所述序列之一的至少4个连续的氨基酸。本发明涉及编码肽03)，(24)和05)的核酸序列，和编码免疫学上类型序列的核 酸序列，以及包含至少一种这些核酸的组合物。本发明也涉及至少一种这样的核酸在检测和辨别HIV-IM组和HIV-I 0组毒株上 的用途。一种得自以上所限定的HIV-I-O DUR病毒的肽也在本发明的范围内，所述肽包含 图9所示的gpl20的V3环区序列或者从HIV-I 0组(或亚组)DUR病毒变体获得的免疫学 上类似的序列的至少4个连续的氨基酸，所说的免疫学上类似的序列被抗体识别，这些抗 体也特异性地识别以下序列的至少一个KEIKI (12)，EREGKGAN(13)，CVRPGNNSVKEIKI(14)，QIEREGKGANSR(15)。这一肽优选地包括a)序列 CVRPGNNSVKEIKIGPMAWYSMQIEREGKGANSRTAFC(ll)或这一序列的包含至少 4个氨基酸的部分，b)或者氨基酸序列，该序列不同于a)的序列之处在于，在所述肽保持其与抗以上 所说肽之抗血清的反应性的前体下，其中的一个或多个氨基酸被两个氨基酸取代，c)或者氨基酸序列，该序列不同于a)或b)的序列之处在于，在所述肽保持其与抗 a)的肽之抗血清的反应性的前体下，其中的一个或多个氨基酸已被缺失或添加，d)或者相应的免疫学上类似的序列或者序列的一部分。这一肽包含以下序列也是优选的序列KEIKI (12)，或序列EREGKGAN (13)，或序列GPMAWYSM (16)。特别优选地是，以上所限定的肽包含氨基酸序列CVRPGNNSVKEIKI (14)或序列 QIEREGKGANSR(15)。来自如上所限定的HIV-I-O DUR病毒的肽也在本发明的范围内，所述的肽包含至 少4个连续的氨基酸，其整个序列包含在图9所示的gp41的优势免疫区序列中，或者包含 在从HIV-I 0组(或亚组)DUR病毒变体获得的免疫学上类似的序列，所说的免疫学上类似 的序列被抗体识别，这些抗体也特异性地识别以下序列的至少一个RLLALETLMQNQQL (17)，LNLffGCRGKAICYTSVQffNETffG(18)，CRGKAI (19)，SVQffN (20),RLLALETLM Q NQQLLNLffGCRGKAICYTS(21),QNQQLLNLffGCRGKAICYTSVQffN(22)。这样一种肽是优选的，其包括序列RLLALETLMQNQQL(17)，或LNLffGCRGKAICYTSVQffNETffG (18)或该肽的部分，所述肽包含a)序列CRGKAI (19)或序列SVQWM20)或者两者，其中Q合适地是被不同的氨基酸 取代，然而其也不同于K，b)或者氨基酸序列，该序列不同于a)的序列之处在于，在所述肽保持其与抗a)的 肽之抗血清的反应性的前提下，其中的一个或多个氨基酸被两个氨基酸取代，c)或者氨基酸序列，该序列不同于a)或b)的序列之处在于，在所述肽保持其与抗 a)的肽之抗血清的反应性的前提下，其中的一个或多个氨基酸已被缺失或添加，d)或者相应的免疫学上类似的序列或者序列的一部分。这一肽具有下列特征之一也是优选的-包含至少8个氨基酸的其N-末端序列免疫学上不被抗序列RILAVERY所形成的 抗体识别，所述序列包含在HIV-I-LAI毒株的gp41的优势免疫区中。-其不被抗HIV-I-LAI毒株之肽SGKLIC所形成的抗体识别。-其包含以下两个序列中的任何一个RLLALETLMQNQQLLNLffGCRGKAICYTS (21),QNQQLLNLffGCRGKAICYTSVQffN(22)。VAU肽的合成采用〃继续流〃 Fmoc方法经常规固相肽合成技术制备VAU肽。采用Milligen 9050 PEP合成仪并采用"微孔"PEG PAL树脂制备所述的肽，取代第一个C-末端氨基酸 残基。氨基酸侧链受到下列基团的保护精氨酸为RllC ；天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸为 Trt ；赖氨酸为Boc ；谷氨酸为tBu酯；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸为tBu醚。临时的Fmoc基团 用在DMF中的20%六氢吡啶溶液除去。用6当量的DIP⑶I和H 0 BT完成偶联各氨基酸的 反应。一些残基需要双偶联，尤其是精氨酸1和23，半胱氨酸19和沈；天冬酰胺11 ；谷氨 酰胺10、12和13 ；丙氨酸4;异亮氨酸9和亮氨酸2、3、14和15。在连接之后，树脂在真空下干燥。经K试剂在室温下4小时使肽从支持物上裂解。 用乙醚沉淀粗肽并洗涤。经高压液相色谱(HPLC)纯化，这一步骤中使用具有WATERS Delta Pak C18 40 X IOOmm 柱体的 WATERS LC PREP4000 仪器，流速 30 毫升 / 分钟，乙腈 /0. 1 % TFA梯度。合并包含肽的组分，然后在旋转蒸发器上浓缩并冻干。环化将肽(0. 025mM)在IOmM乙酸铵溶液中溶解。pH值以IM氢氧化铵溶液调整至8. 5。 3或4小时之后再调整pH值。经HPLC (WATERS Delta PakC185 μ柱，乙腈/0. 1 % TFA梯度) 在214毫微米和280毫微米监测环化作用。环化在15小时之后完全。pH值用97-100%醋 酸调节至6，冻干溶液，并在与粗肽相同的条件下纯化。肽由HPLC和按照电喷射技术的质谱(FIS 0 N VG Trio2000分光光度计)检测。Fmoc :9-芴基甲氧羰基Pmc 8-甲基戊烷_6_磺酰苯并二氢吡喃Trt:三苯甲基Boc 叔丁氧羰基tBU:叔丁基DMF: 二甲基甲酰胺
DIP⑶I 二异丙基碳化二亚胺H 0 BT 1-羟基苯并三唑TFA:三氟乙酸反应剂K 苯酚/水/苯硫基甲烷/乙二硫醇/TFA2. 5ml/2. 5ml/2. 5ml/l. 5ml/41mlHIV-I(VAU)包膜氨基酸序列与其它HIV病毒的相应序列的比较从HIV_1(vau)感染病人获得的一系列血清样品的Western-印迹分析结果在图2中 给出。将携带有经电泳分离的和从纯化的HIV颗粒(LAV BL 0 T SANO FI DIAGN 0 STIC SPASTEUR)获得的蛋白质的硝基纤维素条与血清样品一起温育，它们的反应性按照制造商 推荐的方法估价。获得的结果如下1通对HIV-2特异性的蛋白质，其与1992年从HIV-1(vau) 病人获得的血清样品反应。2-7通HIV-I阳性血清；得自HIV-1(vau)病人的血清2 :1990年 9月获得的；3 1990年12月获得的；4 :1991年2月获得的；5 :1992年2月获得的；6 阴性 对照；7 阳性对照(从感染HIV-I个体获得的血清)。蛋白质的名称和大小在页边注明。图3显示了 HIV-I _)包膜的氨基酸序列与HIV-I-LAI参照分离物(Wain-Hobson 等，1985)的相应的序列的序列对比。信号肽、V3环以及gp41优势免疫表位由阴影矩形突 出。外包膜糖蛋白gpl20和跨膜gp41之间的裂解位点由箭头表明。氨基酸字母之间的垂直 线表示完全等同，冒号()表示高的同源性，园点(.)表示单个氨基酸之间有限的同源性。 采用威斯康星GCG包GAP程序进行序列对比。GAP 禾Π BESTFIT 程序原始版本(1.0)由 Paul Haeberli 从 Needleman 和 Vunsch (分子生物学杂志，48，443-453 (1970)以及 Smith 和 Waterman (Adv. App 1. Math. 2 ； 482-489(1981)出版物的详尽的研究编写。PaulHaeberli发展了有限的序列对比，并添 加到程序包中构成3.0版本。然后它们由Wiilip Marquess融合成一个单一程序构成 4.0版本。蛋白质序列对比的缺口缺乏障碍按照Rechid，Vingron和Argos(CABI 0 S5 ； 107-113(1989))的建议被修饰。图3的序列对比显示出许多高度差异的区，具有在这里或那里保持的很少的区。 这些保持的区大致相应于在常规的HIV-I分离物中也保持的区(Alizon等，1986，Benn 等，1985)。在差异的区域中，V3环，也称作主要的中和决定簇(Javaherian等，1990， Javaherian等，1989，Matsushita等，1988)明显地是最大差异的一个，尽管两个半胱氨酸 限定的环被保持。环的帽序列(HIV-1-LAI WGPGRAF)在HIV-I_)中是GPMAWY。这一帽单 位与喀麦隆0组分离物HIV(MT7Q)的(van den Heasevelde等，1994)相同，但是不同于另一 0 组分离物，基序为 GPMRWR 的 HIVmvp518ci (Gurtler 等，1994)。在整个包膜中，总共鉴别四个潜在的N-糖基化位点，与其它包膜蛋白质比较，其 中13个被保持。总共也发现19个保持的半胱氨酸，这表明蛋白质的全部折叠体系结构被 保持，但是发现5个未保持的半胱氨酸。图4显示在各种HIV-I分离物的跨膜包膜糖蛋白的细胞外片段中的优势免疫肽多 种序列对比。所有序列与参照序列HIV-I-LAI比较。短线表示与HIV-I-LAI相同。借助威 斯康星GCG包的PILEUP程序进行序列对比。在PILEVP程序中，由树状图阐述的装配策略称为UPGMA，其意指“采用数学平均 值的非重量配对组方法(Smith, P. H. A. Sokal, R. R. (1973)，数值分类学(pp. 230-234)，W. H. Freeman and Company，旧金山，加利福尼亚，美国)。PILEVP中的各对序列对比采用 Needleman 和 Wunsch 方法(分子生物学杂志，48 ；443-453 (1970))。如图4所示，TM蛋白质的外部部分的优势免疫表位的氨基酸序列(&iarm等1987) 实质上不同于其它HIV-I和HIV-2分离物的。然而，它保持大多数发现在HIV-I和HIV-2 病毒之间保守的氨基酸。发现一些特异性氨基酸仅仅在0组病毒之间保守这样的情况是在沈个氨基酸的 肽中21位的赖氨酸，7位的苏氨酸和11位的天冬酰胺。这些区别能解释常规HIV-I包膜抗原检测的缺乏，所述检测是经一种得自HIV_1(vau)病人的血清 进行的或者也很可能是经感染其它0组病毒的病人的血清进行的。总之，HIV-I-LAI和 HIV-I(VAU)包膜序列之间的比较显示50%的等同性。HIV-1(vau)包膜序列也分别与其它HIV 代表(包括所描述的和测序的HIV-10组的两个成员=HIV-Iantto和HIV-Imvp518ci)和SIV代表 之序列比较。表1所示这一分析结果说明HIV-1(vau)属于0组。HIV-1(vau)包膜70%等同于 HIV-Iant70 包膜和 71%等同于 HIV-Imvp518q 包膜。在最普通的HIV-I亚型中，包膜水平的等同性是可以比较的，范围从74%到80 %。
权利要求
1.体外检测生物样品中HIV-I0组病毒的感染方法，所述方法包括i)使所述样品在一定条件下与至少一种探针接触，其中所述探针衍生自或由hiv-i(vau) 或HIV-1(duk)的env、gag或pol基因的至少IOObp的片段组成，所述条件能够导致与0组 HIV病毒的强杂交以及与M组HIV病毒的弱杂交，和 )检测所述探针和包含在所述生物样品中的核酸之间的分子杂交。
2.根据权利要求1的方法，其进一步包括，在所述检测之前，将探针/核酸复合物固定 在适宜的固体支持物上以及用合适的洗涤溶液洗涤所述固体支持物。
3.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中衍生自HIV-I(VAU)或HIV-I(DUK)的env、gag 或pol基因的探针选自i)含有SEQ ID NO 5的序列； )在高严紧条件下与SEQ ID NO 5特异性杂交的核酸；iii)含有SEQID NO 7的序列；iv)在高严紧条件下与SEQID NO 7特异性杂交的核酸； ν) 513bp的gag基因的扩增序列，如SEQ ID NO 9所示；vi)525bp的 V3 环序列，如 SEQ ID NO 10 所示；vii)312bp的优势免疫区序列，如SEQID NO 11所示；viii)通过引物4506(SEQ ID NO 1)和引物5011 (SEQ ID NO 2)扩增的pol扩增子；ix)通过引物TH2(SEQ ID NO 3)和引物UH2 (SEQ ID NO 4)扩增的env基因扩增子； χ)编码SEQ ID NO :5的1至5 位氨基酸且定义在SEQ ID NO 6中的核酸；xi)编码SEQID NO 5的527至877位氨基酸且定义在SEQ ID NO 8中的核酸；xii)扩增自HIV-Iara0的gag扩增子，所述扩增子编码含有下列区域的肽a)SPRTLNAffVKAVEEKAFNPEIIPMFMALSEGA,b)MLNAIGGHQGALQVLKEVIN,c)GPLPPGQIREPTGSDIAGTTSTQQEQI，禾口d)V⑶IYRKWIVLGLNKMVKMYSPV。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中探针使经标记的。
5.根据权利要求4的方法，其中所述标记选自放射性标记、酶标记或荧光标记。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述的生物样品选自血液、血浆、血 清、组织、细胞培养物或细胞提取物。
7.扩增自HIV-Iara0的gag扩增子，所述扩增子编码含有下列区域的肽i)SPRTLNAffVKAVEEKAFNPEIIPMFMALSEGA,ii)MLNAIGGHQGALQVLKEVIN,iii)GPLPPGQIREPTGSDIAGTTSTQQEQI，禾口iv)V⑶IYRKWIVLGLNKMVKMYSPV。
8.产生肽或多肽的方法，其包括表达选自如下的分离的核酸 i)含有SEQ ID NO 5的序列； )在高严紧条件下与SEQ ID NO 5特异性杂交的核酸；iii)含有SEQID NO 7的序列；iv)在高严紧条件下与SEQID NO 7特异性杂交的核酸；ν) 513bp的gag基因的扩增序列，如SEQ ID NO 9所示；vi)525bp的 V3 环序列，如 SEQ ID NO 10 所示；vii)312bp的优势免疫区序列，如SEQID NO 11所示；viii)通过引物4506(SEQ ID NO 1)和引物5011 (SEQ ID NO 2)扩增的pol扩增子；ix)通过引物TH2(SEQ ID NO 3)和引物UH2 (SEQ ID NO 4)扩增的env基因扩增子； χ)编码SEQ ID NO :5的1至5 位氨基酸且定义在SEQ ID NO 6中的核酸；xi)编码SEQID NO 5的527至877位氨基酸且定义在SEQ ID NO 8中的核酸；xii)扩增自HIV-Iara0的gag扩增子，所述扩增子编码含有下列区域的肽a)SPRTLNAffVKAVEEKAFNPEIIPMFMALSEGA,b)MLNAIGGHQGALQVLKEVIN,c)GPLPPGQIREPTGSDIAGTTSTQQEQI，禾口d)V⑶IYRKWIVLGLNKMVKMYSPV；禾口Xiii)在i)至xii)中定义的探针之一的至少IOObp片段。
全文摘要
本发明涉及HIV-1O组(或亚组)逆转录病毒抗原的核苷酸序列。本发明还涉及一种HIV-1O型(或亚型)逆转录病毒蛋白质，或者至少包含一部分所述蛋白质的天然或合成多肽或肽。其能够被从血清分离的起因于HIV-1O型VAU毒株或者HIV-1O型(或亚型)DUR毒株感染的抗体识别。
文档编号C07K16/10GK102134609SQ20101020089
公开日2011年7月27日 申请日期1995年10月20日 优先权日1994年10月20日
发明者A·伯尔曼, C·奎兰特, D·古塔尔德, F·克拉维尔, J·H·M·库翰, J·当约恩迪萨恩特马丁, L·蒙塔格尼尔, P·查尼恩 申请人:巴斯德研究所