专利名称：罗非鱼白细胞 cAMP 诱导早期抑制因子基因序列及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及 罗非鱼白细胞cAMP诱导早期抑制因子(inducible cAMP early repressor, ICER)基因序列，更具体涉及对免疫前后罗非鱼白细胞SSH cDNA文库测序、
分析获得的罗非鱼ICER全长cDNA序列、氨基酸序列、时空表达状况，本发明还涉及其 用途。
背景技术：
cAMP信号传导途径在高等动物的生殖系统、神经系统、免疫系统及内分泌系统 等多个领域具有重要的生物功能。ICER是cAMP反应元件调控因子基因编码的一种转录 抑制因子，可通过本身的自动负调节机制而抑制自身的表达，目前已报道的人类ICER包 括ICERI，ICERI y , ICER II，and ICERII Y。ICER参与众多细胞生理活动，如松果 体腺ICER呈昼夜周期变化，抑制前列腺癌细胞的生长，N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮 抗物等，在抑制肿瘤细胞生长、神经细胞发生与调亡、促进卵巢黄体化、促皮质激素细 胞周期及分泌调节等方面具有重要作用。目前，有关鱼类ICER的研究报道尚属空白，罗 非鱼ICER基因序列也未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供罗非鱼外周血白细胞cAMP诱导早期抑制因子的基因序 列，氨基酸序列及时空表达状况，分析方法简便。本发明还涉及罗非鱼外周血白细胞cAMP诱导早期抑制因子基因序列在罗非鱼 抗病选育中的应用。为实现上述任务，本发明采用了以下技术措施利用抑制性差减杂交技术(SSH)，以链球菌病疫苗免疫前后罗非鱼白细胞 cDNA为材料，成功构建了罗非鱼免疫前后正向和反向两个cDNA差减文库，通过 对文库测序结果进行去载体、序列拼接、同源检索等分析，获得ICER全长cDNA序 列。该序列总长569bp，包含1个完整的开放阅读框，该基因cDNA长336bp的开 放阅读框，编码111个氨基酸。5’端非编码区119bp，3’端非编码区114bp， PolyA尾长30bp。 序列表现出ICER II Y的基本结构特征，即仅有cAMP应答元 件调控因子(CREM)亮氨酸拉链DNA结合结构域DBD II，且无外显子Y。基序 (motif)搜索表明ICER II Y /T含有N-糖基化位点NKTL (92)，蛋白激酶C磷酸化位 点TRK(53)，2个酪氨酸蛋白激酶II磷酸化位点TGDE，TLIE(4, 94)，N_酰基化位 点GLAQSI (27)，亮氨酸拉链转录因子结构域标签序列RLMKNREAARECRRK (59)， 亮氨酸拉链结构域序列LENRVAVLENQNKTLIEELKAL(81)，核定位序列 RKREVRLMKNREAARECRRKKKE(53-70)。经BLASTN检索只获得 1 条同源序列，艮口 大西洋鲑推测的cAMP反应元件调控因子mRNA。采用实时荧光定量方法对免疫和攻毒 后奥尼杂交罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和吉富罗非鱼ICER进行时空表达分析。
基因ICER cDNA 序列GAGGAAAGGAGAAGCGGGAGCAAAGGAGATACAAGTAAAGCAGAAAAGG ATAGTGGTAGAGAAGAGTTTTTGTAGTGAGGTGTCTCTCTACCGTGGTGCTGGATTATTGGAAACCAGAGATGGCTGTAACTG GGGATGAGACTGAGTCAGCCGCTACTGGAGACATCCC CGCCTACCAGCTTCGTTCACCAAACTCGGGCTTGGCTCAGAG CATTGTAATGGCTGCGTCTCCAGGCAGCA TGCAGAGCCCCTCATCACAGCACGCCGAGGAGATCACCCGCAAGAGGGAG GTCCGGCTGATGAAAAACAGGGAAGCAGCTCGCGAGTGCCGCAGGAAAAAGAAAGAGTATGTCAAATGTCTGGAAAACCG CGTGGCTGTGTTGGAAAACCAAAACAAGACCTTGATTGAAGAGCTAAAAGCACTAAAGGACATTTACTGCCACAAAGCTGA GTAGCAGTGGCTGCTTGTGGTCATGGGCTGAAGACAGTTTACAAACTTCTACAGCAAAATAAGACAAAACAAAACAAAAC AAAAAACACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA基因ICER编码蛋白的氨基酸序列MAVTGDETESAATGDIPAYQLRSPNSGLAQSIVMAASPGSMQSPSSQHAEEITR KREVRLMKNREAARECRRKKKEYVKCLENRVAVLENQNKTLIEELKALKDIYCHKAE罗非鱼白细胞cAMP诱导早期抑制因子基因序列在罗非鱼抗病选育中的应用。通过ICER基因表达实时分析，攻毒后四种鱼的脑、肝、肾和脾四种组织的 ICER表达量均不同程度的下调，免疫后四种鱼的脑、肝、肾和脾四种组织ICER表达量 均是先下调，48h后又转为上调。另外，攻毒后ICER整体表达量和免疫后期ICER上调 幅度在奥尼杂交罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和吉富罗非鱼中呈依次下降，与四 种罗非鱼的试验室抗链球菌感染能力和生产上抗病力呈正相关。本发明的有益效果ICER基因在罗非鱼是首次发现，目前人类在罗非鱼对此基因的认识和了解仅限 于本发明人所做的科学工作研究。ICER在罗非鱼机体生命调节活动中具有重要的地位， 通过分析其时空表达状况，探索ICER与不同品种罗非鱼的抗病差异的关系，为罗非鱼的 抗病选育提供分子标记指导罗非鱼抗病选育。
图1罗非鱼免疫前后总RNA甲醛变性电泳结果。图2尼罗罗非鱼β-actin基因拷贝对数扩增标准曲线。图3尼罗罗非鱼ICER基因拷贝对数扩增标准曲线。图4海豚链球菌疫苗免疫后四种罗非鱼脑组织ICER表达水平。图5海豚链球菌疫苗免疫后四种罗非鱼肝组织ICER表达水平。图6海豚链球菌疫苗免疫后四种罗非鱼脾组织ICER表达水平。
图7海豚链球菌疫苗免疫后四种罗非鱼肾组织ICER表达水平。图8海豚链球菌感染后四 种罗非鱼脑组织ICER表达水平。图9海豚链球菌感染后四种罗非鱼肝组织ICER表达水平。图10海豚链球菌感染后四种罗非鱼脾组织ICER表达水平。图11海豚链球菌感染后四种罗非鱼肾组织ICER表达水平。注明(图4 图11)样品编码第1位表示组织(L 肝，K 前肾，S 脾， B 脑)；第2位表示鱼的种类(1 吉富，2 奥利亚，3 尼罗，4 奥尼杂交)；第3 位表示时间点(1 Oh, 2 6h，3 12h，4 24h，5 48h)。
具体实施例方式1、RNA的提取与SSH差减文库的构建罗非鱼分为两组饲养于鱼塘小网箱中。免疫组罗非鱼链球菌疫苗腹腔免疫 (109cell/ml，0.5ml/尾)，两周后腹腔免疫(109cell/ml，0.5ml/尾)加强免疫一次。加强 免疫一天后两组罗非鱼尾静脉采血(15IU肝素抗凝Iml血液)14ml，加PBS两倍稀释后再 缓慢加到等体积的淋巴细胞分离液表面，18°C，500gX50min,小心吸取中间白细胞层， 加入与采血量等量的PBS，500g离心20min收集白细胞，重复两次，加适量PBS重悬。 瑞氏染色鉴定和细胞计数板计数。每IO7个白细胞加Iml Trizol试剂，剧烈震荡至无可见 细胞团，室温作用5min ；每毫升Trizol加入0.2ml氯仿剧烈震荡30s后室温作用5min，
4°C, 12000gX15min ；小心吸取上层水相，每毫升Trizol加入0.5ml异丙醇_20°C沉淀 30min, 4°C, 12000gX IOmin ；弃上清，每毫升 Trizol 加 Iml 75% 乙醇 4°C，7500gX5min 洗涤沉淀两次；室温干燥15min，加适量DEPC水溶解(55°C水浴助溶5min)。核酸蛋白 测定仪检测OD260/C)D280，免疫前罗非鱼A260/A280为1.97，总量为123ug ；免疫后罗 非鱼A260/A280为2.0，总量为150ug。经变性电泳检测，28S和18S RNA带型清晰可 见，比例适当(图1)，证明总RNA质量好、纯度高。对得到的mRNA进行冻干浓缩提 高浓度。按照美国CLONTECH 公司 PCR-Select cDNA Subtraction Kit 说明构建 SSH 差
减文库，具体操作如下以免疫后罗非鱼白细胞cDNA为Tester组，正常罗非鱼白细胞 cDNA为Driver组。Tester cDNA酶切后被分成两份，分别连接两种不同的接头Adptorl 和Adaptor2R后完成Tester-I和Tester_2cDNA。将酶切后制备的Driver cDNA和接头连接 后的Tester cDNA进行两轮杂交。第一轮，过量的Driver cDNA加到每份Tester cDNA, 98°C变性1.5min后，68°C杂交8h。差异表达基因cDNA片段不与Driver cDNA杂交而 形成单链。紧接着进行第二轮杂交，不经变性迅速将两份第一次杂交的样品混合，同 时加入变性后的Driver cDNA，混勻后68°C继续杂交10h，差异表达的单链cDNA重新 退火形成有不同接头末端的双链cDNA。杂交产物再经过两轮PCR反应。第一轮PCR 采用Adaptorl和Adaptor2R的共有序列引物PCRPrimer 1。扩增参数为94°C，25s ； 9410s； 6630s； 72°C，1.5min ； 25个循环。只有杂交形成两端具有不同接头的 cDNA片段才能够扩增。第二轮PCR采用的是套式PCR引物(Nested primerl和Nested Primer2R),扩增参数为94°C，IOs ； 68°C, 30s, 72°C, 1.5min, 15 个循环。以正常 罗非鱼为Tester组、免疫后罗非鱼为Driver组，按上述正向杂交操作步骤进行抑制性差减杂交，以获取差异表达基因。正、负差减PCR产物中(共50ul)取Iul与pGEM-T进行T\A克隆载体4°C过夜连接。连接产物转化大肠杆菌JM109中。取20ul涂布在LB/ Amp/IPTG/X-Cal平板进行蓝白斑筛选，挑取白色克隆于含有Amp (50ug/ml)的LB培养 基中37°C，150rpm振荡培养16h。原始文库加甘油至20%，-80°C保存。2、序列分析正负文库随机挑选阳性克隆进行测序，通过BLAST程序在国际基因数据库 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB的nr数据库和EST数据库进行核酸序列同源性检索和 比对，从正库中获得56个有效EST序列与动物ICER cDNA序列相似性很高。利用 DNASTAR/SeqMan软件对56条EST进行拼接，将最后得到的contig作为目标序列在 NCBI上用BLASTN和BLASTP分别搜索nr库和swissport库，寻找同源性序列，ORF 分析，最终确定所得contig为ICER全长cDNA序列。该序列总长569bp，包含1个完 整的开放阅读框，编码111个氨基酸。序列表现出ICER II Y的基本结构特征，即仅 有cAMP应答元件调控因子(CREM)亮氨酸拉链DNA结合结构域DBD II，且无外显子 Y。基序(motif)搜索表明ICER II Y /T含有N-糖基化位点NKTL (92)，蛋白激酶C磷 酸化位点TRK(53)，2个酪氨酸蛋白激酶II磷酸化位点TGDE，TLIE (4，94)，N_酰基化 位点GLAQSI (27)，亮氨酸拉链转录因子结构域标签序列RLMKNREAARECRRK(59)， 亮氨酸拉链结构域序列LENRVAVLENQNKTLIEELKAL(81)，核定位序列 RKREVRLMKNREAARECRRKKKE (53-70)，所得序列命名为 ICERII Y /T (GenBank 登 陆号为 EU593895)。3、ICER时空表达分析a、引 物ICER 上游引 物5，-AGTCAGCCGCTACTGGAGACA-3， 和 下游引物5，-CTGGAGACGCAGCCATTACA-3，，扩增片段 90bp。 β -Actin 上游引物5，-AACAACCACACACCACACATTTC-3‘和下游引物 5' -TGTCTCCTTCATCGTTCCAGTTT-3 ‘扩增片段 134bp。b、奥尼杂交罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和吉富罗非鱼均分为免疫组和 攻毒试验组(50尾/组)分别饲养于分开的池塘小网箱。免疫组罗非鱼腹腔注射链球菌 疫苗进行免疫(1.0X109Cell/ml，0.5ml/尾)，分别于免疫前(Od)和免疫后Id、3d、5d、 7d随机取3尾试验鱼，解剖取其脑、肝、脾和前肾组织于液氮中保存。攻毒试验组罗非 鱼腹腔注射链球菌进行人工感染(1.0X108Cell/ml，0.5ml/尾)，各组分别于感染前(Oh) 和感染后6h、12h、24h、48h随机取3尾存活试验鱼，解剖取其脑、肝、脾和肾组织于液 氮中保存。C、RNA抽提及反转录，按标记从液氮中取出保存组织并研磨成粉末，提取总 RNA选用反转录通用弓I物进行反转录合成cDNA。d、扩增效率检测，以cDNA浓度梯度Lg值对Ct值作图，建立的内标β _actin标 准曲线(图2)及ICER基因的标准曲线(图3)，其相关系数分别为0.999和1.000，相关 性很好。根据公式LgXo = -Lg (1+EX) X Ct+LgN, ICER定量PCR反应效率是0.99947。e、ICER定量检测，采用两步法进行实时荧光定量PCR反应，反应条件为，第 一步，95度10s，第二步，95度，5s; 60度，34s，40个循环。反应结束后，按Δ Δ CT 值分析方法，使用7500 Software v2.0.1(ABI)分析数据，制作时空表达图谱(图4 图11)， 样品编码第1位表示组织(L 肝，K:前肾，S:脾，B:脑)，第2位表示鱼的 种类(1:吉富，2:奥利亚，3:尼罗，4:奥尼杂交)，第3位表示时间点(1: Od, 2 Id, 3 3d, 4: 5d，5 7d)；图5样品编码第1位表示组织(L 肝，K:前肾，S: 脾，B:脑)，第2位表示鱼的种类(1:吉富，2:奥利亚，3:尼罗，4:奥尼杂交)， 第3位表示时间点(1: Oh, 2 6h, 3 12h，4 24h，5 48h)。通过ICER基因表达实 时分析，攻毒和免疫后罗非鱼肝、脑、脾及前肾组织ICER基因表达量均不同程度下降， 但免疫处理的四种罗非鱼在7d后ICER表达量又出现大幅度上升，接近处理前表达水平 并有超过的趋势。四种罗非鱼ICER表达比较发现，正常情况下奥尼杂交罗非鱼ICER在 肝、脑、脾及前肾组织中表达量均显著高于其它3种罗非鱼，攻毒后奥尼杂交罗非鱼ICER 的整体表达量也明显高于其它3种罗非鱼，免疫后期奥尼杂交罗非鱼ICER上调幅度也明高 于其它3种罗非鱼。通过计算分析，攻毒后ICER整体表达量和免疫后期ICER上调幅度在 奥尼杂交罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和吉富罗非鱼呈依次下降。链球菌攻毒结果 发现奥尼杂交罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和吉富罗非鱼死亡率呈依次上升，说明 四种罗非鱼抗链球菌感染能力呈依次下降，这一结果与近年来生产养殖中这四种罗非鱼表 现的综合抗病能力一致。结合ICER攻毒或免疫后表达的变化趋势、四种罗非鱼ICER表达 差异和抗感染能力比较结果，发现ICER基因表达量与罗非鱼抗病力有内在正相关性，即在 一定范围内ICER表达量越高，越有利于罗非鱼机体抵抗链球菌等病原菌的感染。f、四种罗非鱼感染链球菌比较试验奥尼杂交罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗 非鱼和吉富罗非鱼均分为链球菌感染试验组和空白对照组(体重40-60g，50尾/组)， 感染量为尼罗罗非鱼半数致死量2.0X IO7CFU,对照组腹腔注射等体积生理盐水。试验 罗非鱼先在大体积水缸内驯养1周。感染试验在45L水箱中进行，每2d换水2/3，水温 在22-29°C间，每天按体重2%分两次投料，并对发病情况进行观察统计，同时利用鸡血 培养基对濒临死亡的罗非鱼脑、肝脏、脾脏和肾脏进行细菌分离鉴定。通过25天的观察 统计，四种罗非鱼均不同程度的出现了死亡，主要其中在4-6天，15天后死亡停止。经 细菌分离鉴定，所有濒临死亡罗非鱼脑、肝脏、脾脏和肾脏均分离到感染菌株CMS005， 四种罗非鱼的死亡情况见表1。表1四种罗非鱼感染链球菌后死亡统计
权利要求
1.罗非鱼白细胞cAMP诱导早期抑制因子基因序列，其特征在于基因ICERcDNA 序列和基因ICER编码蛋白的氨基酸序列；该基因cDNA长336bp的开放阅读框，编码 111个氨基酸，5，端非编码区119bp，3，端非编码区114bp，PolyA尾长30bp ；基因ICER cDNA序列GAGGAAAGGAGAAGCGGGAGCAAAGGAGATACAAGmAAGCAGAAAAGGATAGTGGTAGAGAAGAGTTTTTGTAGTGAGGTGTCTCTCTACCGTGGTGCTGGATTArTGGAAACCAGAGATGGCTGTAACTGGGGArGAGACTGAGTCAGCCGCTACTGGAGACArCCCCGCCTACCAGCTTCGTTCACCAAACTCGGGCTTGGCTCAGAGCATTGTAArGGCTGCGTCTCCAGGCAGCATGCAGAGCCCCTCATCACAGCACGCCGAGGAGArCACCCGCAAGAGGGAGGTCCGGCTGATGAAAAACAGGGAAGCAGCTCGCGAGTGCCGCAGGAAAAAGAAAGAGTATGTCAAATGTCTGGAAAACCGCGTGGCTGTGTTGGAAAACCAAAACAAGACCTTGArTGAAGAGCTAAAAGCACmAAGGACATTTACTGCCACAAAGCTGAGTAGCAGTGGCTGCTTGTGGTCATGGGCTGAAGACAGTTTACAAACTTCTACAGCAAAArAAGACAAAACAAAACAAAACAAAAAACACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA基因ICER编码蛋白的氨基酸序列MAVTGDETESAATGDIPAYQLRSPNSGLAQSIVMAASPGSMQSPSSQHAEEITRKRE VRLMKNREAARECRRKKKEYVKCLENRVAVLENQNKTLIEELKALKDIYCHKAE。
2.罗非鱼白细胞cAMP诱导早期抑制因子基因序列在罗非鱼抗病选育中的应用。
全文摘要
本发明公开了罗非鱼cAMP诱导早期抑制因子ICER基因序列及其用途，该基因cDNA序列总长569bp，包含1个完整的开放阅读框，编码111个氨基酸。序列表现出ICER IIγ的基本结构特征，即仅有cAMP应答元件调控因子(CREM)亮氨酸拉链DNA结合结构域DBDⅡ，且无外显子γ。该基因在众多细胞生理活动中有重要作用，在罗非鱼抗病选育中进行应用。
文档编号C07K14/46GK102021172SQ20101020732
公开日2011年4月20日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者余晓丽, 李莉萍, 李超, 梁万文, 王瑞, 甘西, 陈明, 陈晓汉, 雷爱莹 申请人:广西壮族自治区水产研究所