专利名称：一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法
技术领域：
本发明属于富集分离磷酸肽领域，特别涉及一种连续高通量富集分离磷酸肽的方 法。
背景技术：
蛋白质的翻译后修饰(PTMs)是目前蛋白质组学研究中的一个重要课题。蛋白质 磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式(据统计，在哺乳动物中大约有三分 之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的)，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞信号 传导，细胞的分化、增殖，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，转录和翻译，蛋白质降解等。磷酸 化蛋白在细胞生命活动中的重要作用，使其成为蛋白质组学研究的热点。目前生物质谱技术已经成为鉴定磷酸化蛋白及肽段的主要工具。然而，由于蛋白 质磷酸化的丰度低以及磷酸肽离子化效率低，磷酸肽的质谱信号常被非磷酸化肽的质谱信 号掩盖，因此在质谱分析鉴定前，对磷酸肽进行富集，提高磷酸肽的相对含量，成为磷酸化 蛋白质组学研究中的重要内容。在过去几十年中已有多种分离和鉴定磷酸化蛋白的技术发 展起来。
固相金属离子亲禾口色谱(Immobilized metal affinity chromatography, I MAC) 法是目前磷酸肽的常用的一种分离富集方法，它是通过带正电的金属离子(如Fe3+、Ga3+)与 带负电的磷酸基团产生静电相互作用结合，并在高PH值或磷酸盐存在的缓冲液中破坏金 属离子与磷酸基团间的结合力将磷酸化肽段释放出来。然而这种方法的特异性并不高，一 些酸性的非磷酸化肽段也往往与磷酸肽一起富集出来。金属氧化物亲禾口色谱(metal oxide affinity chromatography, M0AC)是近年 来兴起的另一种富集磷酸肽的方法，它较IMAC法有更高的选择性。金属氧化物如&02， TiO2, SnO2等已经成功地用于选择性富集磷酸肽。近年来一些研究者在提高TiO2富集磷 酸肽的效率和选择性上做了大量的研究。如在负载液中添加2，5_ 二羟基苯甲酸(DHB) 增强 TiO2 的选择性(Molecular & Cellular Proteomics 2005，4(7)，873-886)；将纳米 TiO2利用脉冲激光沉积(PLD)直接涂敷在MALDI靶板上实现磷酸肽的快速富集及检测 (Journal of ProteomeResearch 2009，8 (4)，1932-1942)；将纳米 TiO2 注入多孔聚合物 支架中设计吸管头式的磷酸肽富集器(Journal of Chromatography A 2007，1165 (1-2)， 128-135 ；Proteomics 2008，8 (21)，4593-4602)等。然而，目前所有用于磷酸肽富集的这 些方法都需要多次重复的人工操作，不仅耗时费力，而且难以实现磷酸肽的连续、高通量分 离及富集，在从大体积复杂临床分析样品中分离和富集磷酸肽上显得无能为力。此外，即 使利用上述新方法，从复杂样品上分离和富集磷酸肽有时候也难以达到理想的选择性，往 往还会依赖于负载液和清洗液中所用的溶剂及添加剂。故而，研究用于实现磷酸肽的快 速、自动、高通量分离及富集的新方法、新器件仍然是非常必要的，尤其是在临床即时检验 (Point-of-Care Testing, P0CT)应用上。在过去的近二十年中，芯片实验室(lab-on-a-chip)器件通过集成的微流控部件(microfluidic device)大大简化了生化分析操作过程。微型化为设计出快速、低成本、 易操作的迷你POCT器件提供了一条途径。在微通道的内表面上构筑特定的微/纳米结构 对于设计出特定功能化的微流控器件是非常有用的，如已经设计出的细胞分离器(Nature 2007,450(7173)，1235-U10)和 DNA 分离器(Analytical Chemistry 2004，76 (1)，15-22) 等。一维纳米材料具有巨大的比表面积和表面易修饰性，将其集成到微流控器件中将有利 于实现生物分子的高通量分离及检测。鉴于磷酸肽与金属氧化物之间的亲和力，有必要在 具有高比表面积和高活性表面的纳米金属氧化物材料的基础上设计出具有更强亲合力和 更高选择性的新颖微流控器件，寻找从复杂生物样品中连续高通量富集分离磷酸肽的新方 法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，该方 法操作简单，可通过调节微量注射泵的推速调控流体在微通道中的停留时间也即与吸附材 料的接触时间来自动控制富集条件，避免了常规方法所需的多次重复的人工操作，借助微 流控器件的内在优势实现了对磷酸肽的连续、快速、高通量分离及富集。本发明的一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，包括(1)微流控器件的组装以石英毛细管作为富集磷酸肽的微流控通道，在其内表面上垂直生长TiO2包覆 Zn0(Ti02/Zn0)纳米棒阵列作为磷酸肽的富集吸附材料，选取三根聚四氟乙烯微管，以其中 两根微管作为流体输送通道，第三根微管作为流体接收通道，用环氧树脂胶将流体输送微 管封接到石英毛细管的一端，流体接收微管封接到另一端；将两根流体输送微管分别与两 支置于微量注射泵上的注射器相连，在接收微管处放置流体接收器，即得到了所需微流控 器件；(2)磷酸肽在微流控器件中的连续高通量富集将上述微流控器件用预清洗液在30 60s的停留时间下预清洗1 3min，然后向 微流控通道输送用负载液按体积比1 5稀释后的蛋白酶解产物，经富集、二次清洗、洗脱 后得到富集产物，并对其进行MALDI-TOF MS分析。所述步骤(1)中的石英毛细管内径为530 550 μ m，外径为660 700 μ m，长度为 8 12cm。所述步骤(1)中的磷酸肽的富集吸附材料是Ti02/Zn0纳米棒阵列；首先将等摩 尔浓度的锌盐溶液和胺溶液分别装入两支置于微量注射泵上的注射器中，在推速为10 25 μ L/min下，将两溶液同时输送到置于90°C烘箱中的毛细管微通道中，控制流体输送时 间为2 5h，在微通道内表面制备垂直生长的ZnO纳米棒阵列；随后在注射泵推速为5 μ L/ min、烘箱温度为70 80°C下向微流控通道内输送浓度为65 μ g/mL的TiO2溶胶，控制流体 输送时间为12h，得到垂直生长的Ti02/Zn0纳米棒阵列。优选的锌盐为醋酸锌，胺溶液为六亚甲基四胺溶液。所述步骤(1)中的聚四氟乙烯微管，其中流体输送微管内径为300 400 μ m,长度 为20 40cm，流体接收微管内径为800 900 μ m，长度为10 20cm。所述步骤(1)中的微量注射泵是可调节的双通道微注射泵。所述步骤(2)中的预清洗液依次为100%的乙腈和含0. lvol%三氟乙酸的50vol%乙腈水溶液。所述步骤(2)中的负载液为含0. Ivol %三氟乙酸或甲酸的50 SOvol %乙腈水溶液。所述步骤(2)中的蛋白酶解产物为单一蛋白酶解产物或混合蛋白酶解产物，其中 单一蛋白酶解产物为α酪蛋白或β酪蛋白酶解产物，混合蛋白酶解产物为α-酪蛋白、 β-酪蛋白和牛血清蛋白BSA酶解产物按摩尔比1 1 1混合后的酶解产物。所述步骤(2)中的富集停留时间为10 30s，富集时间为1 3min;二次清洗停留 时间为30 60s，清洗时间为1 3min ；洗脱停留时间为30 60s，洗脱时间为1 3min ；所述步骤(2)中的二次清洗所用清洗液为含0. lvol%三氟乙酸的50vol%乙腈水 溶液；洗脱所用洗脱液为5vol% NH3 · H2O,停留时间为30 300s。有益效果(1)利用垂直生长在微流控通道内表面上的ZnO纳米棒阵列作为负载TiO2纳米颗 粒的支架，增大微通道的内表面的同时增大了 TiO2与磷酸肽的接触面积，借助TiO2与磷酸 肽之间的特异性相互作用，实现了对磷酸肽的高效选择性富集。(2)该方法操作简单，可通过调节微量注射泵的推速调控流体在微通道中的停留 时间也即与吸附材料的接触时间来自动控制富集条件，避免了常规方法所需的多次重复的 人工操作，借助微流控器件的内在优势实现了对磷酸肽的连续、快速、高通量分离及富集。(3)该方法中纳米材料修饰后的微通道在连续重复使用多次后仍然对富集磷酸肽 具有很高的选择性。
图1为微通道内表面上生长的TiO2包覆的ZnO纳米棒阵列的场发射扫描电镜照 片。图2为用于磷酸肽富集的微流控器件的示意图；其中，1)微量注射泵，2)聚四氟乙 烯输送微管，3)石英毛细管微通道，4)流体接收器，5)长有纳米棒阵列的微通道放大部分， 6)聚四氟乙烯接收微管，7)注射器。图3为500fmol α -酪蛋白酶解产物的MALDI-TOF MS谱图，“ ”号为磷酸肽的特 征峰。图4为500fmol α -酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图(富集停留时间 为IOs持续lmin，实验方法依照实施例1)，“ ”号为磷酸肽的特征峰。图5为500fmol α -酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图(富集停留时间 为30s持续3min，实验方法依照实施例2)，“ ”号为磷酸肽的特征峰。图6为500fmol β-酪蛋白酶解产物的MALDI-TOF MS谱图，“ ”号为磷酸肽的特 征峰。图7为500fmol β -酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图(洗脱停留时间 为30s持续lmin，实验方法依照实施例3)，“ ”号为磷酸肽的特征峰。图8为500fmol β -酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图(洗脱停留时间 为Imin持续2min，实验方法依照实施例4)，“ ”号为磷酸肽的特征峰。图9为500fmol β -酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图(洗脱停留时间为5min持续lOmin，实验方法依照实施例5)，“ ”号为磷酸肽的特征峰。图10为混合蛋白酶解产物(各含500fmol)的MALDI-TOF MS谱图。图11为混合蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图(实验方法依照实施例 6)，其中“《”和“ ”号分别为α-酪蛋白磷酸肽和β-酪蛋白磷酸肽的特征峰。图12为50fmol α -酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图(实验方法依照 实施例7)，“ ”号为磷酸肽的特征峰。图13为α-酪蛋白酶解产物经重复使用5个循环的微流控器件富集后的 MALDI-TOF MS谱图(实验方法依照实施例8)，“ ”号为磷酸肽的特征峰。图14为微流控器件连续重复使用5个循环后其微通道中的Ti02/Zn0纳米棒阵列 的场发射扫描电镜照片。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1用直尺量取长度为8cm、内径为530 μ m,外径为660 μ m石英毛细管。将0. 05M醋 酸锌和0. 05M六亚甲基四胺溶液分别装入两支置于微量注射泵上的注射器中，设定推速为 25 μ L/min，将两溶液同时输送到置于90°C烘箱中的毛细管微通道中，控制流体输送时间为 2h，在微通道内表面制备垂直生长的ZnO纳米棒。随后在注射泵推速为5 μ L/min、烘箱温度 为80°C下向微通道内输送65 μ g/mL的TiO2溶胶，控制流体输送时间为12h，干燥后得到垂 直生长的Ti02/Zn0纳米棒阵列。图1为本实施例得到的在微通道内表面上生长的Ti02/Zn0 纳米棒阵列的场发射扫描电镜照片，可以看出纳米棒阵列垂直生长在微通道的内表面上。取两根内径为300 μ m，长度为20cm的聚四氟乙烯微管作为流体输送通道，用环氧 树脂胶封接到石英毛细管的一端；再取一根内径为800 μ m，长度为IOcm的聚四氟乙烯微管 作为流体接收通道，用环氧树脂胶封接到石英毛细管的另一端。将装有100%乙腈的两支注射器置于微量注射泵上，设置推速使其在微通道中 的停留时间为60s，流体输送Imin后，更换注射器中的液体为50vol %乙腈水溶液(含 0. 三氟乙酸)条件同上完成对微流控器件的预清洗。更换注射泵中的流体为 50vol%乙腈水溶液(含0. lvol%三氟乙酸)按体积比1 5稀释后的α-酪蛋白酶解产 物，设置富集停留时间为IOs并持续Imin ；然后将注射器中的流体更换为50vol %乙腈水溶 液(含0. lvol%三氟乙酸)作为清洗液，在停留时间为30s下清洗2min ；之后再以5vol% NH3 · H2O作为洗脱液在洗脱停留时间为30s下Imin将富集产物洗脱下来并将流体装入样 品瓶中冷冻干燥。最后将样品进行 MALDI-TOF MS (4700 Proteomics Analyzer, Applied Biosystems)分析。图2是所设计的用于磷酸肽富集的微流控器件的示意图。图3是本实 例中500fmol α -酪蛋白酶解产物的MALDI-TOF MS谱图，图4是本实例中500fmol α -酪 蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图，其中“ ”号为磷酸肽的特征峰。比较两图 可看出，α-酪蛋白酶解产物在富集前其谱图中仅出现一个很弱的磷酸肽的特征峰(m/z1660. 79)，经微流控器件富集后可检测到α-酪蛋白磷酸肽的三个特征峰(m/z 1660.79， 1832. 70，1951. 95)。实施例2调整富集停留时间为30s并持续3min，其他条件同实施例1。图5是本实例中 500fmol α -酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图，其中“全”号为磷酸肽的特征峰。 不难发现，当富集停留时间为30s时α _酪蛋白磷酸肽的三个特征峰在谱图中的信号增强， 非磷酸化肽段的信号降低，表明该微流控器件能够对磷酸肽进行快速而有效的富集。实施例3用直尺量取长度为12cm、内径为530 μ m，外径为660 μ m石英毛细管。将0. 05M醋 酸锌和0. 05M六亚甲基四胺溶液分别装入两支置于微量注射泵上的注射器中，设定推速为 10 μ L/min，将两溶液同时输送到置于90°C烘箱中的毛细管微通道中，控制流体输送时间为 5h，在微通道内表面制备垂直生长的ZnO纳米棒。随后在注射泵推速为5 μ L/min、烘箱温度 为70°C下向微通道内输送65 μ g/mL的TiO2溶胶，控制流体输送时间为12h，干燥后得到垂 直生长的Ti02/Zn0纳米棒阵列。取两根内径为300 μ m，长度为40cm的聚四氟乙烯微管作为流体输送通道，用环氧 树脂胶接到石英毛细管的一端；再取一根内径为800 μ m,长度为20cm的聚四氟乙烯微管作 为流体接收通道，用环氧树脂胶封接到石英毛细管的另一端。将装有100%乙腈的两支注射器置于微量注射泵上，设置推速使其在微通道中 的停留时间为40s，流体输送2min后，更换注射器中的液体为50vol %乙腈水溶液(含 0. 三氟乙酸)条件同上完成对微流控器件的预清洗。更换注射泵中的流体为 50vol%乙腈水溶液(含0. lvol%三氟乙酸)按体积比1 5稀释后的β-酪蛋白酶解产 物，设置富集停留时间为30s并持续1. 5min ；然后将注射器中的流体更换为50vol %乙腈水 溶液(含0. Ivol %三氟乙酸)作为清洗液，在停留时间为30s下清洗80s ；之后再以5vol% NH3 · H2O作为洗脱液在洗脱停留时间为30s下Imin将富集产物洗脱下来并将流体装入样 品瓶中冷冻干燥。最后将样品进行 MALDI-TOF MS (4700 Proteomics Analyzer, Applied Biosystems)分析。图6是本实例中500fmol β -酪蛋白酶解产物的MALDI-TOF MS谱图，图 7是本实例中500fmoli3-酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图，其中“ ”号为磷 酸肽的特征峰。比较两图可发现，β-酪蛋白酶解产物在富集前其谱图中仅出现一个很弱 的磷酸肽的特征峰(m/z 2061. 83)，经微流控器件富集后可以检测到β-酪蛋白磷酸肽的 三个特征峰(m/z2061. 84，1832. 70，1951. 95)。实施例4调整洗脱停留时间为Imin并持续2min，其他条件同实施例3。图8是本实例中 500fmol β -酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图，其中“ ”号为磷酸肽的特征峰。 当洗脱停留时间为Imin时，β-酪蛋白磷酸肽的三个特征峰在谱图中的信号较30s时有明 显增强，非磷酸化肽段的信号显著降低，这表明洗脱停留时间为Imin时能够将微流控器件 所富集的磷酸肽充分洗脱下来。实施例5调整洗脱停留时间为5min并持续lOmin，其他条件同实施例3。图9是本实例中 500fmol β -酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图，其中“ ”号为磷酸肽的特征峰。当洗脱停留时间延长至5min时，β -酪蛋白磷酸肽的三个特征峰在谱图中的信号较洗脱停 留时间为Imin时并没有明显增强，也即说明继续延长时间对有效洗脱微流控器件中富集 的磷酸肽是没有必要的。实施例6用直尺量取长度为8cm、内径为550 μ m,外径为700 μ m石英毛细管。将0. 05M醋 酸锌和0. 05M六亚甲基四胺溶液分别装入两支置于微量注射泵上的注射器中，设定推速为 20 μ L/min，将两溶液同时输送到置于90°C烘箱中的毛细管微通道中，控制流体输送时间为 2. 5h，在微通道内表面制备垂直生长的ZnO纳米棒。随后在注射泵推速为5yL/min、烘箱温 度为75°C下向微通道内输送65 μ g/mL的TiO2溶胶，控制流体输送时间为12h，干燥后得到 垂直生长的Ti02/Zn0纳米棒阵列。取两根内径为300 μ m，长度为20cm的聚四氟乙烯微管作为流体输送通道，用环氧 树脂胶封接到石英毛细管的一端；再取一根内径为800 μ m，长度为IOcm的聚四氟乙烯微管 作为流体接收通道，用环氧树脂胶封接到石英毛细管的另一端。将装有100%乙腈的两支注射器置于微量注射泵上，设置推速使其在微通道中 的停留时间为50s，流体输送2min后，更换注射器中的液体为50vol %乙腈水溶液(含 0. 三氟乙酸)条件同上完成对微流控器件的预清洗。更换注射泵中的流体为 50vol%乙腈水溶液(含0. lvol%三氟乙酸)按体积比1 5稀释后的α-酪蛋白、β-酪 蛋白和牛血清蛋白(BSA)按物质的量为1 1 1混合后的酶解产物(各含500fmol)，设置 富集停留时间为30s并持续3min ；然后将注射器中的流体更换为50vol%乙腈水溶液(含 0. Ivol %三氟乙酸)作为清洗液，在停留时间为30s下清洗2min ；之后再以5vol % NH3 ·Η20 作为洗脱液在洗脱停留时间为Imin下2min将富集产物洗脱下来并将流体装入样品瓶中冷 冻干燥。最后将样品进行MALDI-TOF MS(4700 Proteomics Analyzer,Applied Biosystems) 分析。图10是本实例中混合蛋白酶解产物(各含500fmol)的MALDI-TOF MS谱图，图11 是本实例中该混合蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图，其中“全”和“ ”号分别为 α-酪蛋白磷酸肽和β-酪蛋白磷酸肽的特征峰。从两图中可看出，混合蛋白酶解产物在 富集前由于大量非磷酸化肽段电离信号的掩盖其谱图检测不到任何磷酸肽的特征峰(图 10)，但经微流控器件富集后α-酪蛋白磷酸肽和β-酪蛋白磷酸肽的特征峰作为主要的质 谱信号而被检测到(图11)，这表明该器件在从复杂样品中富集磷酸肽上具有很高的选择 性。实施例7调整蛋白酶解产物为浓度稀释100倍的α-酪蛋白酶解产物，其他条件同实施例 6。图12是本实例中50fmol α-酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图，其中“鋈"号 为磷酸肽的特征峰。从图中可以看出，当蛋白浓度降低100倍时，经微流控器件富集后，仍 然可以通过MALDI-TOF MS分析检测到α -酪蛋白磷酸肽的两个特征峰，表明该器件在选择 性富集磷酸化肽上具有很高的灵敏度。实施例8用直尺量取长度为8cm、内径为530 μ m,外径为660 μ m石英毛细管。将0. 05M醋 酸锌和0. 05M六亚甲基四胺溶液分别装入两支置于微量注射泵上的注射器中，设定推速为 25 μ L/min，将两溶液同时输送到置于90°C烘箱中的毛细管微通道中，控制流体输送时间为
82h，在微通道内表面制备垂直生长的ZnO纳米棒。随后在注射泵推速为5 μ L/min、烘箱温度 为80°C下向微通道内输送65 μ g/mL的TiO2溶胶，控制流体输送时间为12h，干燥后得到垂 直生长的Ti02/Zn0纳米棒阵列。取两根内径为300 μ m，长度为20cm的聚四氟乙烯微管作为流体输送通道，用环氧 树脂胶封接到石英毛细管的一端；再取一根内径为800 μ m，长度为IOcm的聚四氟乙烯微管 作为流体接收通道，用环氧树脂胶封接到石英毛细管的另一端。将装有100%乙腈的两支注射器中置于微量注射泵上，设置推速使其在微通 道中的停留时间为30s，流体输送3min后，更换注射器中的液体为50vol%乙腈水溶液 (含0. lvol%三氟乙酸)条件同上完成对微流控器件的预清洗。更换注射泵中的流体为 50vol%乙腈水溶液(含0. lvol%三氟乙酸)按体积比1 5稀释后的α-酪蛋白酶解产 物，设置富集停留时间为30s并持续3min ；然后将注射器中的流体更换为50vol %乙腈水溶 液(含0. lvol%三氟乙酸)作为清洗液，在停留时间为30s下清洗2min ；之后再以5vol% NH3 · H2O作为洗脱液在洗脱停留时间为Imin下2min将富集产物洗脱下来并将流体装入样 品瓶中冷冻干燥。利用0. 5% NH3 ·Η20、超纯水和无水乙醇在停留时间为30s下先后清洗微 通道2min使其内表面活化再生，再次用于富集磷酸肽。将微流控器件重复使用5个循环后 得到的样品进行 MALDI-TOF MS (4700 Proteomics Analyzer, Applied Biosystems)分析。 图13是本实例中α-酪蛋白酶解产物富集后的MALDI-TOF MS谱图，其中“ ”号为磷酸肽 的特征峰。由图可知，在连续重复使用5个循环后该微流控器件仍然可以从蛋白酶解产物 中有效富集磷酸肽，显示出了其较高的耐用性。图14是该微流控器件连续重复使用5个循 环后其微通道中的Ti02/Zn0纳米棒阵列的场发射扫描电镜照片，可发现纳米棒阵列的形貌 在使用前后基本不变，表明了其高的稳定性和耐冲刷性。
权利要求
一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，包括(1)微流控器件的组装以石英毛细管作为富集磷酸肽的微流控通道，在其内表面上垂直生长TiO2包覆ZnO(TiO2/ZnO)纳米棒阵列作为磷酸肽的富集吸附材料，选取三根聚四氟乙烯微管，以其中两根微管作为流体输送通道，第三根微管作为流体接收通道，用环氧树脂胶将流体输送微管封接到石英毛细管的一端，流体接收微管封接到另一端；将两根流体输送微管分别与两支置于微量注射泵上的注射器相连，在接收微管处放置流体接收器，即得到了所需微流控器件；(2)磷酸肽在微流控器件中的连续高通量富集将上述微流控器件用预清洗液在30～60s的停留时间下预清洗1～3min，然后向微流控通道输送用负载液按体积比1∶5稀释后的蛋白酶解产物，经富集、二次清洗、洗脱后得到富集产物，并对其进行MALDI-TOF MS分析。
2.根据权利要求1所述的一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，其特征在于所述 步骤(1)中的石英毛细管内径为530 550 μ m，外径为660 700 μ m，长度为8 12cm。
3.根据权利要求1所述的一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，其特征在于所述 步骤(1)中的磷酸肽的富集吸附材料是Ti02/Zn0纳米棒阵列；首先将等摩尔浓度的锌盐溶 液和胺溶液分别装入两支置于微量注射泵上的注射器中，在推速为10 25μ L/min下，将 两溶液同时输送到置于90°C烘箱中的毛细管微通道中，控制流体输送时间为2 5h，在微 通道内表面制备垂直生长的ZnO纳米棒阵列；随后在注射泵推速为5 μ L/min、烘箱温度为 70 80°C下向微流控通道内输送浓度为65 μ g/mL的TiO2溶胶，控制流体输送时间为12h， 得到垂直生长的Ti02/Zn0纳米棒阵列。
4.根据权利要求1所述的一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，其特征在于所述 步骤(1)中的聚四氟乙烯微管，其中流体输送微管内径为300 400 μ m,长度为20 40cm， 流体接收微管内径为800 900 μ m，长度为10 20cm。
5.根据权利要求1所述的一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，其特征在于所述 步骤(1)中的微量注射泵是可调节的双通道微注射泵。
6.根据权利要求1所述的一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，其特征在于所述 步骤⑵中的预清洗液依次为100%的乙腈和含0. Ivol %三氟乙酸的50vol %乙腈水溶液。
7.根据权利要求1所述的一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，其特征在于所述 步骤(2)中的负载液为含0. lvol%三氟乙酸或甲酸的50 SOvol%乙腈水溶液。
8.根据权利要求1所述的一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，其特征在于所述 步骤(2)中的蛋白酶解产物为单一蛋白酶解产物或混合蛋白酶解产物，其中单一蛋白酶解 产物为α酪蛋白或β酪蛋白酶解产物，混合蛋白酶解产物为α-酪蛋白、β-酪蛋白和牛 血清蛋白BSA酶解产物按摩尔比1 1 1混合后的酶解产物。
9.根据权利要求1所述的一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，其特征在于所述 步骤(2)中的富集停留时间为10 30s，富集时间为1 3min ；二次清洗停留时间为30 60s，清洗时间为1 3min ；洗脱停留时间为30 60s，洗脱时间为1 3min ；
10.根据权利要求1所述的一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，其特征在于所述 步骤(2)中的二次清洗所用清洗液为含0. lvol%三氟乙酸的50vol%乙腈水溶液；洗脱所 用洗脱液为5vol% NH3 · H2O,停留时间为30 300s。
全文摘要
本发明涉及一种连续高通量富集分离磷酸肽的方法，包括首先组装微流控器件；然后以微量注射泵作为流体输送动力源，将微流控器件依次用两种预清洗液在30～60s的停留时间下清洗1～3min，向其微通道中输送蛋白酶解产物，经富集、清洗、洗脱后得到富集产物。本发明的分离方法操作简单，可通过调节微量注射泵的推速调控流体在微通道中的停留时间也即与吸附材料的接触时间来自动控制富集条件，避免了常规方法所需的多次重复的人工操作，借助微流控器件的内在优势实现了对磷酸肽的连续、快速、高通量分离及富集。
文档编号C07K1/22GK101885754SQ20101020769
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者何中媛, 张青红, 李耀刚, 王宏志 申请人:东华大学