专利名称：高纯度ddmp大豆皂苷单体分离制备的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的制备方法，尤其是一种高纯度DDMP大豆皂苷单 体分离制备的方法。
背景技术：
大豆皂苷(Soyasaponin)是大豆中含有的一类重要的生物活性成分，具有显著的 降血脂、抗动脉粥样硬化、抗病毒等多种重要的生理功能，在医药、食品等领域具有很大的 应用潜力。大豆皂苷一般可分为A组大豆皂苷、B组大豆皂苷、E组大豆皂苷和DDMP组大豆皂 苷。每一组又可分为多种单体，具体有A组皂苷结构式如下B、E、DDMP类皂苷的结构式如下 表1. A组、B组、E组和DDMP组大豆皂苷基团结构及其相对应的分子量
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大豆皂苷在大豆中含量少，且极性大，亲水性强，与杂质分离较困难；另外，大豆皂 苷同与之共存的大豆异黄酮极性部分重叠也给大豆皂苷的分离纯化造成一定的困难；此 外，大豆皂苷还具有起泡性，这也给大豆皂苷的制备增加了困难；同时，大豆皂苷类别多，有 些皂苷结构差别不大，尤其是分离过程中导致一些天然结构的变化，如DDMP大豆皂苷在受 热和PH变化偏离中性的条件下都很容易发生降解，这些都导致纯化单体获得标准品的难 度增加。目前还没有非常有效的分离纯化方法，尤其是对DDMP大豆皂苷。经对现有技术文献的检索发现，目前为止，已有一些技术都是工业化生产富含大 豆皂苷混合物的方法。如中国专利 CN101278729A、CN1923845A、CN1245811A、CN1315323、 CN1327983A、CN1590385A、CN1683362A、日本专利 JP2003-171393A 等。也有专利公开文 献记载分离或制备高纯度大豆皂苷的技术或方法，如根据检索发现中国专利申请号 200810200834. 1，名称一种高纯度大豆皂苷A和B的制备方法，该技术称涉及一种高速 逆流色谱(HSCCC)制备高纯度大豆皂苷A和B的方法，得到大豆皂苷A和大豆皂苷B。该 技术制得的大豆皂苷A和大豆皂苷B能够达到相当高的纯度，并且该制备方法操作简便、分 离效率高、分离量较大、回收率高以及重现性好。但是，该发明分离的到的是高纯度的大豆 A组皂苷和大豆B组皂苷，即实现的是大豆皂苷的组分离，尚不能有效得到高纯度的各单体 皂苷的分离，尤其是DDMP大豆皂苷。DDMP大豆皂苷是各类皂苷中最具有生物活性，也是最不稳定的一种。DDMP大豆皂苷只有在非常温和的提取条件下才不会被破坏，因此解决DDMP皂苷的分离纯化已经成为 现有技术的一个难题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提出一种高纯度DDMP大豆皂苷单体 分离制备的方法，使其满足分离量大、纯度高和避免产品降解的综合要求。本发明包括步骤如下①利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷粗提物；②大豆皂苷粗分离；③大豆皂苷细分离。步骤①中所述的大豆皂苷粗提物，其制备方法为A、脱脂用石油醚(30-60°C )在索氏抽提装置中进行脱脂抽提大约3h左右，取出 后在通风处自然挥干石油醚。B、溶剂提取将脱脂的大豆胚芽粉按采用8-10 1的液料比(mL/g)溶于约的 70%的乙醇水溶液，置于摇床上，在25°C水浴中摇晃浸提大约4h左右，或辅以频率为20KHz 的超声波预处理45min，过滤，旋转蒸发回收乙醇。C、固相萃取将上述大豆皂苷提洗脱液加入装有大孔吸附树脂的吸附柱中，室温 下，流速控制在0. 5-2. OBV/h ； 1-5BV的去离子水，室温下，流速控制在0. 5-2. OBV/h洗脱杂 质；3-5BV的彡95%的低级醇于室温下2. 0-5. OBV/h冲洗吸附柱，旋转蒸发回收低级醇得洗 脱液；洗脱液冻干得到大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物粉末。步骤②中所述的大豆皂苷粗分离，其制备方法为选择上相为固定相，下相为流动相的溶剂体系，加入体积百分比3. 0-5.0%的乙 酸，以助于洗脱，体系中各组分按选定正丁醇-水体积比=1 1，或乙酸乙酯丁醇甲 醇水体积比=3-4 0. 5-1.0 1 5. 0-6.0，作为大豆皂苷的粗分溶剂体系置于分液 漏斗中，摇勻静置分层，待平衡20-40分钟后，将上相和下相分开，即得粗分溶剂体系；先用 固定相充满逆流色谱仪柱子，调节主机转速，将流动相以20-30ml/min的流速泵入柱内，待 整个体系建立动态平衡后，大豆皂苷和异黄酮粗提物100-300mg用5-10mL的上相下相体 积比1 1溶解后由进样阀进样；分别根据检测器图谱接收目标成分，将馏分进行浓缩冻干 后，得到大豆皂苷混合物。步骤③中所述的大豆皂苷细分离，其制备方法为选择氯仿甲醇正丁醇水体积比=4 3 0. 1 2体系或乙酸乙酯正 丁醇水体积比=1:6: 7体系，氯仿甲醇正丁醇水体积比=4 3 0. 1 2 体系下试验了两种流动相流速3mL/min和1. 5mL/min。乙酸乙酯正丁醇水体积比= 1:6: 7体系的体系流速为1.5mL/min。将溶剂体系的上相(固定相)连续泵入HSCCC 螺旋管，待螺旋管完全充满固定相后，开启HSCCC主机，缓慢调整螺旋管转速至900r/min， 设置恒温水浴为25°C。顺时针旋转，同时以设定流速泵入流动相。当螺旋管尾端流出流动 相，系统达到动力学平衡时，计量固定相保留率。然后将检测体系准备好，将30-50mg大豆 皂苷混合物溶于5mL下相后，通过进样阀注入螺旋管中。根据色谱图手动收集各馏分。将 收集到的馏分旋转蒸发至5-10mL体积。
本发明的优点及应用范围大豆皂苷的提取一般通过一个初步的萃取过程得到大豆皂苷粗提物，然后再通过 逆流色谱等分离技术分离得到大豆皂苷。鉴于大豆皂苷粗提物中含有多类物质，如各种大 豆异黄酮和各种大豆皂苷。而且大豆皂苷总共有20种，一些大豆皂苷之间差异很小。为 能最大程度的提取到大豆皂苷，采取分步提取的策略，先将大豆皂苷与其他类物质(大豆 异黄酮)分开(粗分)，然后再进行细分至大豆皂苷单体，即分为粗分和细分两个过程。粗 分过程主要目的是将各种大豆皂苷与大豆异黄酮类物质分离开，得到各类大豆皂苷的混合 物，为细分分离大豆皂苷单体做准备。本发明是一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液_液分配色谱分离技 术，综合看来，高速逆流色谱具有原理简单、操作简便、能够有效保持物质活性等优点，运用 高速逆流色谱法制备大豆皂苷将具有很大的潜力。本发明实验分离得到了四种大豆皂苷， 分别是大豆皂苷Aa、Ab和两种DDMP皂苷cig&i3g。本发明虽然通过了粗分和细分两个 步骤，仍然分离到了 DDMP类皂苷，是大豆皂苷分离的一个突破。本发明为DDMP大豆总体皂 苷单体皂苷的定量分析提供了基础，对于大豆皂苷的分析检测标准的建立也具有重要的意 义。
图1含5 %乙酸的正丁醇-水溶剂体系HSCCC图(粗分)；图2含5%乙酸的正丁醇溶剂体系各馏分的HPLC色谱图；图3氯仿甲醇正丁醇水(4 3 0. 1 2，ν/ν/ν/ν)体系在流速3. OmL/ min下HSCCC色谱(细分)图；图4 氯仿甲醇正丁醇水(4 3 0. 1 2,v/v/v/v)体系(3. OmL/min)下 各馏分“ 1 ”和“ 2 ”的HPLC色谱图；图5乙酸乙酯正丁醇水(1 6 7，ν/ν/ν)体系HSCCC色谱图(细分)；图6乙酸乙酯正丁醇水(1 6 7，ν/ν/ν)体系下馏分“3”的HPLC色谱图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下 述的实施例。实施例1(1)利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷粗提物Α、脱脂称取大豆胚芽粉20g，用石油醚(30-60°C )脱脂3hr，取出置于通风厨中 自然挥干。B、溶剂提取20g脱脂胚芽粉，按10 1的液料比(mL/g)用70% (ν/ν)的乙醇水 溶液200ml的浸提4hr，过滤，旋转蒸发回收乙醇得滤液。C、固相萃取将上述大豆皂苷浸提滤液加入装有大孔吸附树脂(AB-8，天津南 开大学化工厂)的吸附柱(Φ30πιπιΧ800mm，树脂床层高550mm)中，室温下，流速控制在 2. OBV/h经过大孔吸附树脂床层；5. OBV的去离子水，室温下，流速控制在1. 5-2. OBV/h洗去
6除糖等杂质(苯酚硫酸法验证糖是否洗去)；4BV的彡90%的甲醇于室温下5. OBV/h冲洗 吸附柱，旋转蒸发回收甲醇得洗脱液；洗脱液冻干得到大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物粉末。(2)大豆皂苷的粗分5%乙酸浓度下的正丁醇-水(1 1，ν/ν)体系，利用大豆皂苷粗提物通过HSCCC 制备大豆皂苷混合物。流动相泵速为3. OmL/min,主机恒温水浴25 °C，螺旋管转速为900r/ min。大豆皂苷和异黄酮粗提物IOOmg用IOmL的上相下相1 1 (ν/ν)溶解后由进样阀进 样，收集第二个峰，旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥即得大豆皂苷混合物。如图1所示，分别根据 检测器图谱接收目标成分，将馏分进行浓缩冻干后，得到大豆皂苷混合物(第二个色谱峰， 其HPLC定性检测分析，如图2所示)。(3)大豆皂苷的细分其溶剂体系氯仿甲醇正丁醇水为4 3 0. 1 2 (ν/ν/ν/ν)体系。将溶 剂体系的上相(固定相)连续泵入HSCCC螺旋管，待螺旋管完全充满固定相后，开启HSCCC 主机，缓慢调整螺旋管转速至900r/min，设置恒温水浴为25°C。顺时针旋转，同时以设定流 速泵入流动相，流速为1. 5ml/min。当螺旋管尾端流出流动相，系统达到动力学平衡时，计量 固定相保留率。然后将检测体系准备好，将30mg大豆皂苷混合物溶于5mL下相后，通过进 样阀注入螺旋管中。根据色谱图手动收集各馏分，得到馏分1和馏分3。馏分1，通过HPLC检测为保留时间为56. 6min的大豆皂苷单体，LC/MS质谱解析为 大豆皂苷Ab，纯度为86%。馏分3的HPLC分析中出现了保留时间为78. 3min的物质，LC/MS质谱解析分别为 DDMP类大豆皂苷α g，纯度为> 85 %。如图3-6所示，分别为细分操作过程中使用两种溶剂系统的高速逆流色谱色谱图 以及收集到的馏分的HPLC色谱分析图谱。其中图3为选择氯仿甲醇正丁醇水溶剂 系统的高速逆流色谱色谱图；图4为该溶剂系统高速逆流色谱馏分HPLC色谱分析图谱；图 5为选择乙酸乙酯正丁醇水溶剂系统的高速逆流色谱色谱图；图6为该溶剂系统高速 逆流色谱馏分HPLC色谱分析图谱。实施例2(1)利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷粗提物同实例1。(2)大豆皂苷的粗分5%乙酸浓度下的乙酸乙酯丁醇甲醇水(3-4 0.5-1.0 1 5. 0-6. O, ν/ ν/ν/ν)体系，利用大豆皂苷粗提物通过HSCCC制备大豆皂苷混合物。流动相泵速为3. OmL/ min，主机恒温水浴25°C，螺旋管转速为900r/min。大豆皂苷和异黄酮粗提物IOOmg用IOmL 的上相下相1 l(v/v)溶解后由进样阀进样，收集第二个峰，旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥 即得大豆皂苷混合物。(3)大豆皂苷的细分其溶剂体系乙酸乙酯正丁醇水为1 6 7 (ν/ν/ν) 0将溶剂体系的上相 (固定相)连续泵入HSCCC螺旋管，待螺旋管完全充满固定相后，开启HSCCC主机，缓慢调整 螺旋管转速至900r/min，设置恒温水浴为25°C。顺时针旋转，同时以设定流速泵入流动相， 流速为1. 5ml/min。当螺旋管尾端流出流动相，系统达到动力学平衡时，计量固定相保留率。
7然后将检测体系准备好，将50mg大豆皂苷混合物溶于5mL下相后，通过进样阀注入螺旋管 中。根据色谱图手动收集各馏分，得到馏分1和馏分3。馏分1，通过HPLC检测为保留时间为56. 6min的大豆皂苷单体，LC/MS质谱解析为 大豆皂苷Aa，纯度为90%。馏分3的HPLC分析中出现了保留时间为83. 2min的物质，LC/MS质谱解析分别为 DDMP类大豆皂苷β g，纯度为> 95 %。
权利要求
一种高纯度DDMP大豆皂苷单体分离制备的方法，其特征在于，包括步骤如下①利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷粗提物；②大豆皂苷粗分离；③大豆皂苷细分离。
2.根据权利要求1所述的高纯度DDMP大豆皂苷单体分离制备的方法，其特征是，步骤①中所述的大豆皂苷粗提物，其制备方法为A、脱脂用30-60°C石油醚在索氏抽提装置中进行脱脂抽提大约3h左右，取出后在通 风处自然挥干石油醚；B、溶剂提取将脱脂的大豆胚芽粉按采用8-10 1的液料比mL/g，溶于约的70%的乙 醇水溶液，置于摇床上，在25°C水浴中摇晃浸提大约4h左右，或辅以频率为20KHz的超声波 预处理45min，过滤，旋转蒸发回收乙醇；C、固相萃取将上述大豆皂苷提洗脱液加入装有大孔吸附树脂的吸附柱中，室温下， 流速控制在0. 5-2. OBV/h ； 1-5BV的去离子水，室温下，流速控制在0. 5-2. OBV/h洗脱杂质； 3-5BV的> 95%的低级醇于室温下2. 0-5. OBV/h冲洗吸附柱，旋转蒸发回收低级醇得洗脱 液；洗脱液冻干得到大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物粉末。
3.根据权利要求1所述的高纯度DDMP大豆皂苷单体分离制备的方法，其特征是，步骤②中所述的大豆皂苷粗分离，其制备方法为选择上相为固定相，下相为流动相的溶剂体系，加入体积百分比3. 0-5. 0%的乙酸，以 助于洗脱，体系中各组分按选定正丁醇-水体积比=1 1，或乙酸乙酯丁醇甲醇 水体积比=3-4 0. 5-1.0 1 5. 0-6.0，作为大豆皂苷的粗分溶剂体系置于分液漏斗 中，摇勻静置分层，待平衡20-40分钟后，将上相和下相分开，即得粗分溶剂体系；先用固定 相充满逆流色谱仪柱子，调节主机转速，将流动相以20-30ml/min的流速泵入柱内，待整个 体系建立动态平衡后，大豆皂苷和异黄酮粗提物100-300mg用5-10mL的上相下相体积比 1 1溶解后由进样阀进样；分别根据检测器图谱接收目标成分，将馏分进行浓缩冻干后， 得到大豆皂苷混合物。
4.根据权利要求1所述的高纯度DDMP大豆皂苷单体分离制备的方法，其特征是，步骤③中所述的大豆皂苷细分离，其制备方法为选择氯仿甲醇正丁醇水体积比=4 3 0. 1 2体系或乙酸乙酯正丁醇 水体积比=1 6 7体系，氯仿甲醇正丁醇水体积比=4 3 0. 1 2体系下试 验了两种流动相流速3mL/min和1. 5mL/min ；乙酸乙酯正丁醇水体积比=1:6:7 体系的体系流速为1. 5mL/min ；将溶剂体系的上相连续泵入HSCCC螺旋管，待螺旋管完全充 满固定相后，开启HSCCC主机，缓慢调整螺旋管转速至900r/min，设置恒温水浴为25 °C，顺 时针旋转，同时以设定流速泵入流动相；当螺旋管尾端流出流动相，系统达到动力学平衡时，计量固定相保留率，然后将检测体 系准备好，将30-50mg大豆皂苷混合物溶于5mL下相后，通过进样阀注入螺旋管中，根据色 谱图手动收集各馏分，将收集到的馏分旋转蒸发至5-10mL体积。
全文摘要
大豆皂苷是大豆中含有的一类重要的生物活性成分，本研究的目的就在于利用高速逆流色谱(HSCCC)对高纯度DDMP大豆皂苷进行制备分离和单体纯化。首先是利用大豆胚芽粉脱脂后经溶剂萃取和固相萃取制备大豆皂苷和异黄酮粗提物。大豆皂苷和异黄酮粗提物进一步分离制备实验分为粗分和细分两步，粗分的目的在于从大豆皂苷和异黄酮粗提物中分离出大豆皂苷单体混合物，而细分的目的则是从粗分得到的大豆皂苷混合物中分离出高纯度的DDMP大豆皂苷单体。粗分实验中，5％乙酸浓度下的正丁醇-水(1∶1)体系对大豆皂苷与大豆异黄酮等物质的分离效果最佳。对于柱体积300mL的HSCCC仪器，100mg是最合适的进样量。
文档编号C07H15/256GK101914127SQ201010242408
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月4日 优先权日2010年8月4日
发明者严明霞, 赵大云, 黄玉艾 申请人:上海交通大学