专利名称：检测赤羽病抗体的胶体金试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及赤羽病抗体的检测试剂，具体涉及检测赤羽病抗体的胶体金试纸条及 其制备方法。
背景技术：
赤羽病又称阿卡斑病，由阿卡斑病毒(AKAV)引起，可导致流产、早产、死产以及 产出先天性关节弯曲-积水性无脑综合征胎儿，是牛的四大流产病之一，我国农业部也将 该病列为禁止进出境的重要传染病。该病分布于热带和温带地区，李昌林等0994年对全 国2639份牛、羊血清进行检测，牛阳性率为39. 18%，羊的阳性率为12.6%，且南方的阳性 率比北方高。卫龙兴等19999年对上海两家流产率较高的奶牛场进行抽样调查，阳性率竟 高达92. 85%。1996年-1997年上海爆发本病，牛场中流产、早产、死产和畸形胎儿约占 20%-30%，给牧场带来巨大损失。从上述数据可以看出，这种病在我国南方已经流行，个别 地区还相当严重，已经给养牛业造成严重损失。目前，我国检测赤羽病抗体的方法主要是琼 脂免疫扩散试验、病毒中和试验和酶联免疫试验(ELISA)。琼脂免疫扩散试验特异性很好， 但灵敏度不高；病毒中和试验中细胞易受污染，检测周期长；酶联免疫试验试剂昂贵，且需 配套仪器。上述三种方法均能够准确检测到赤羽病抗体，但具体操作复杂，均需要较为熟练 的专业技术人员和配备相应的仪器设备，不利于基层赤羽病快速验放，尤其是养殖场的日 常监测。免疫胶体金技术是60年代继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展 起来的固相标记免疫测定技术，免疫胶体试纸条技术，具有单份测定、简单快速、特异敏感， 不需任何仪器设备和试剂，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果，并可保存实验 结果的优点；免疫胶体金层析技术现已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一，特别 适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，因此 该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。如授权公告号为CN100494352，名称为“检测牛结 核抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法”的发明专利，就公开了由样品垫、结合垫(玻璃 纤维膜)、硝酸纤维素膜、吸水垫和背衬(底衬)组装而成的免疫胶体金试纸条，其中结合垫 上包被有MPB83蛋白-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有由纯化MPB70蛋白构成的检 测线和纯化的免疫MPB83蛋白IgG构成的质控线。赤羽病抗体为赤羽病病毒的免疫应答蛋白，目前本领域技术人员用常规纯化技术 都可以得到单克隆抗体或多克隆抗体，如公开号为CN101200709，名称为“抗赤羽病病毒单 克隆抗体的杂交瘤细胞系、单克隆抗体及其试剂盒和用途”的发明专利申请，就公开了单克 隆抗体的制备，其制备方法较复杂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了检测赤羽病抗体的胶体金试纸条，该胶体金 试纸条具有检测简便、快捷、特异、敏感和成本低等优点，使普通作业人员，在基层也可以方便检测赤羽病抗体。本发明还公开了上述胶体金试纸条的制备方法，该制备方法较简单，成本也较低， 得到胶体金试纸条特异性好，敏感度高。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为检测赤羽病抗体的胶体金试纸 条，色括底衬，所述底衬上设置有吸水垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜和样品垫，所述硝酸纤 维素膜上设置有检测带和质控带，所述检测带中包被有Gl重组蛋白，所述质控带中包被有 赤羽病抗体，所述玻璃纤维膜中包被有胶体金-Gl重组蛋白，所述Gl重组蛋白的氨基酸序 列如序列表SEQ ID NO. 2所示。所述赤羽病抗体为多克隆抗体。检测赤羽病抗体的胶体金试纸条的制备方法，包括下述步骤DRNA制备用病毒RNA抽提试剂盒从赤羽病病毒中抽提分离囊膜糖蛋白Gl基 因，以该Gl基因为模板进行RT-PCR扩增反应，测序，得到Gl基因，所述Gl基因的核苷酸序 列如序列表SEQ ID NO. 1所示，RT-PCR扩增反应的上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示，下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示；引物由大连宝生生物有限 公司合成；2)G1重组蛋白制备将上述Gl基因构建到表达载体pET_28a(+)中得到重组质 粒，再将该重组质粒导入表达宿主大肠杆菌BL21中，将该大肠杆菌BL21夜培养，按体积比 1 200，将上述大肠杆菌BL21接种至LB培养基中，37°C培养至0D_为1时，加入异丙基 硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至其终浓度为lmmol/L，诱导表达4h，得到诱导菌液，将该诱 导菌液5000r/min离心lOmin，收集细菌沉淀，所述细菌沉淀先用0. 01mol/L PH7. 4磷酸盐 (PBS)缓冲液洗溶，然后5000r/min离心lOmin，洗溶离心重复3次，得到去杂的细菌，根据 Novagen公司的His. Bind Purification Kit说明书将去杂的细菌破碎、提取、纯化、层析、 洗脱得到Gl重组蛋白溶液，测序Gl重组蛋白，该Gl重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0. 2所示，4°C冰箱保存备用；表达载体pET-28a(+)和大肠杆菌BL21由哈尔滨兽医研 究所提供；蛋白制备请依上述说明书操作，在此不作详述；3)胶体金-Gl重组蛋白制备用浓度为0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调 节至7. 9，然后在ImL的胶体金溶液中加入15. 9ug的Gl重组蛋白溶液，磁力搅拌混合均 勻30min，加入质量百分浓度为10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，至牛血清白蛋白终浓度 为1%，继续搅拌15min，再加入质量百分浓度为5%的聚乙二醇溶液，至聚乙二醇终浓度为 0. 5%，再继续搅拌15min，然后置于4°C冰箱过夜，次日以1500rpm离心lOmin，取上清液以 13000rpm离心lh，在沉淀中边搅拌边加入胶体金溶液至沉淀溶解，得到胶体金-Gl重组蛋 白溶液，4°C冰箱保存备用；胶体金溶液配制为常规方法，在此不作表述；4)赤羽病抗体制备按体积比1 1，在赤羽病病毒中加入弗氏完全佐剂(FCA) 乳化为乳化液，用2ml注射器吸取上述乳化液lmL，注射至兔的腋下和腹股沟中，间隔14 天，再吸取上述乳化液1.5mL，注射至兔的腋下和腹股沟中，间隔10天后，从耳静脉采血 0. 5 1. 0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价，在抗体效价不低 于1 16时，放兔血并分离血清，该血清即为多克隆的赤羽病抗体溶液；该抗体制备操作简 单，成本低，时间短，得到抗体符合要求；当然也可以用如CN101200709所述的单抗；5)胶体金试纸条制备将上述Gl重组蛋白溶液喷在硝酸纤维素膜的检测带上烘干备用，将上述赤羽病抗体溶液喷在硝酸纤维素膜的质控带上烘干备用，将上述胶体金-Gl 重组蛋白溶液喷在玻璃纤维膜上烘干备用，在不干胶的底衬上按顺序贴附吸水垫、含有Gl 重组蛋白和赤羽病抗体的硝酸纤维膜、含有胶体金-Gl重组蛋白的玻璃纤维膜、样品垫，然 后切割成4mm宽的纸条，得到胶体金试纸条。与现有技术相比，本发明的优点在于检测赤羽病抗体的胶体金试纸条，色括底衬， 底衬上设置有吸水垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜和样品垫，硝酸纤维素膜上设置有检测带 和质控带，检测带中包被有Gl重组蛋白，质控带中包被有赤羽病抗体，玻璃纤维膜中包被 有胶体金-Gl重组蛋白，Gl重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示；该胶体金试 纸条在养殖场等基层就可以检测赤羽病抗体，也无需实验室检测仪器，对检测技术要求也 不高，普通作业人员依说明书说可实施，且检测快捷、特异、敏感和成本低，因此本发明具有 检测简便、快捷、特异、敏感和成本低等优点。通过RNA制备、Gl重组蛋白制备、胶体金-Gl 重组蛋白制备、赤羽病抗体制备和胶体金试纸条制备步骤制备方法，得到特异性好和敏感 度高的该胶体金试纸条，该制备方法较简单，成本也较低。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例检测赤羽病抗体的胶体金试纸条的制备过程1)RNA制备用病毒RNA抽提试剂盒从赤羽病病毒中抽提分离囊膜糖蛋白Gl基 因，以该Gl基因为模板进行RT-PCR扩增反应，测序，得到Gl基因，Gl基因的核苷酸序列如 序列表SEQ ID NO. 1所示，RT-PCR扩增反应的上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 3 所示，下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示；具体RT-PCR扩增反应为常规方 法，在此不作详述；引物由大连宝生生物有限公司合成。2)G1重组蛋白制备将上述Gl基因构建到表达载体pET_28a(+)中得到重组质 粒，再将该重组质粒导入表达宿主大肠杆菌BL21中，将该大肠杆菌BL21夜培养，按体积比 1 200，将上述大肠杆菌BL21接种至LB培养基(市售)中，37°C培养至0D_为1时，加 入IPTG至其终浓度为lmmol/L，诱导表达4h，得到诱导菌液，将该诱导菌液5000r/min离 心lOmin，收集细菌沉淀，所述细菌沉淀先用O.Olmol/L PH7. 4自配的PBS缓冲液洗溶，然 后5000r/min离心lOmin，洗溶离心重复3次，得到去杂的细菌，根据Novagen公司的His. Bind Purification Kit说明书将去杂的细菌破碎、提取、纯化、层析、洗脱得到Gl重组蛋 白溶液，测序Gl重组蛋白，该Gl重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，4°C 冰箱保存备用。表达载体pET-28a(+)和大肠杆菌BL21由哈尔滨兽医研究所提供。PBS 缓冲液的配制将 8g NaCL,0. 2g KCL、1.44g Na2HPO4、0. 24g KH2PO4 溶解在 800mL 蒸馏水 中，用HCL调节溶液的pH至7. 4，加水至1000. 00mL。蛋白制备请依上述说明书操作用 Denaturing Binding Buffer (pH7. 9)按菌液1 20的比例重悬细菌沉淀，超声透明后， 10000r/min离心15min,取IOmL上清加入到处理好的Ni2+NTA(ImL)柱中，上清与树脂 悬浮作用 30min 后，依次用 IOmL denaturing bindingbuffer (pH7. 9) >40mL denaturing washing buffer (pH7. 9) 、8mL denaturing elutionbuffer (pH7. 9)过柱，取不同时间的洗 液进行SDS-PAGE电泳分析纯化结果；薄层扫描分析纯化蛋白的浓度。
3)胶体金-Gl重组蛋白制备用浓度为0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调 节至7. 9，然后在ImL的胶体金溶液中加入15. 9ug的Gl重组蛋白溶液，磁力搅拌混合均 勻30min，加入质量百分浓度为10%的BSA(市售)溶液，至BSA终浓度为1%，继续搅拌 15min，再加入质量百分浓度为5%的聚乙二醇溶液，至聚乙二醇终浓度为0.5%，再继续搅 拌15min，然后置于4°C冰箱过夜，次日以1500rpm离心lOmin，取上清液以13000rpm离心 lh，在沉淀中边搅拌边加入胶体金溶液至沉淀溶解，得到胶体金-Gl重组蛋白溶液，4°C冰 箱保存备用。4)赤羽病抗体制备按体积比1 1，在赤羽病病毒中加入FCA溶液(市售) 乳化为乳化液，用2ml注射器吸取上述乳化液lmL，注射至兔的腋下和腹股沟中，间隔14 天，再吸取上述乳化液1.5mL，注射至兔的腋下和腹股沟中，间隔10天后，从耳静脉采血 0. 5 1. 0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价，在抗体效价不低 于1 16时，放兔血并分离血清，该血清即为多克隆的赤羽病抗体溶液。5)胶体金试纸条制备将上述Gl重组蛋白溶液喷在硝酸纤维素膜的检测带上烘 干备用，将上述赤羽病抗体溶液喷在硝酸纤维素膜的质控带上烘干备用，将上述胶体金-Gl 重组蛋白溶液喷在玻璃纤维膜上烘干备用，在不干胶的底衬上按顺序贴附吸水垫、含有Gl 重组蛋白和赤羽病抗体的硝酸纤维膜、含有胶体金-Gl重组蛋白的玻璃纤维膜、样品垫，然 后切割成4mm宽的纸条，得到本发明用于检测赤羽病抗体的胶体金试纸条。上述赤羽病抗体也可以用如CN101200709所述的单抗，在此不作叙述。检测赤羽病抗体的胶体金试纸条的应用检测取上述胶体金试纸条，平放于桌上，在样品垫上分别滴入待测血清200uL， 当待检血清滴到样品点上后，根据虹吸原理会往上渗透，玻璃纤维膜上胶体金-Gl重组 蛋白随着待检血清上行，若待检血清为阳性，在上行至检测带时，待检血清中抗体与胶体 金-Gl重组蛋白以及检测带上的抗原形成复合体，显色，一般20分钟后就可判定结果。测 定标准分为无效、阴性、弱阳性、阳性。无效检测带和质控带带均不出现紫红色线，说明本 试纸已失效；阴性检测带不出现色线，质控带带出现一条颜色较深的紫红色线，说明检测 样品无AKAV抗体或有AKAV抗体，但抗体水平很低；弱阳性检测带出现一条颜色很浅的紫 红色线，质控带出现一条颜色较深的紫红色线，说明检测样品中的AKAV抗体水平刚好达到 阳性值；阳性检测带和质控带带都出现颜色较深的紫红色线，说明样检测品中的AKAV抗 体水平较高；检测带颜色越深，检测样品中的抗体水平越高。用AKAV标准阳性和阴性血清 进行8次重复试验，结果一致；用本发明的胶体金试纸条对14份赤羽病临床样品进行检测， 初步结果与进口 ELISA试剂盒比较，阳性符合率为83. 33%。
权利要求
检测赤羽病抗体的胶体金试纸条，色括底衬，所述底衬上设置有吸水垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜和样品垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测带和质控带，其特征在于所述检测带中包被有G1重组蛋白，所述质控带中包被有赤羽病抗体，所述玻璃纤维膜中包被有胶体金 G1重组蛋白，所述G1重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。
2.如权利要求1所述的检测赤羽病抗体的胶体金试纸条，其特征在于所述赤羽病抗体 为多克隆抗体。
3.权利要求2所述的检测赤羽病抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于包括下 述步骤DRNA制备用病毒RNA抽提试剂盒从赤羽病病毒中抽提分离囊膜糖蛋白Gl基因，以 该Gl基因为模板进行RT-PCR扩增反应，测序，得到Gl基因，所述Gl基因的核苷酸序列如序 列表SEQ ID NO. 1所示，RT-PCR扩增反应的上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 3 所示，下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.4所示；2)Gl重组蛋白制备将上述Gl基因构建到表达载体pET-28a(+)中得到重组质粒， 再将该重组质粒导入表达宿主大肠杆菌BL21中，将该大肠杆菌BL21夜培养，按体积比 1 200，将上述大肠杆菌BL21接种至LB培养基中，37°C培养至0D_为1时，加入异丙基 硫代_ β -D-半乳糖苷至其终浓度为lmmol/L，诱导表达4h，得到诱导菌液，将该诱导菌液 5000r/min离心lOmin，收集细菌沉淀，所述细菌沉淀先用0. 01mol/L PH7. 4磷酸盐缓冲液 洗溶，然后5000r/min离心lOmin，重复洗离3次，得到去杂的细菌，根据Novagen公司的 His. Bind Purification Kit说明书将去杂的细菌破碎、提取、纯化、层析、洗脱得到Gl重组 蛋白溶液，测序Gl重组蛋白，该Gl重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID而.2所示，41 冰箱保存备用；3)胶体金-Gl重组蛋白制备用浓度为0.lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调节 至7. 9，然后在ImL的胶体金溶液中加入15. 9ug的Gl重组蛋白溶液，磁力搅拌混合均勻 30min，加入质量百分浓度为10%的牛血清白蛋白溶液，至牛血清白蛋白终浓度为1%，继 续搅拌15min，再加入质量百分浓度为5%的聚乙二醇溶液，至聚乙二醇终浓度为0. 5%，再 继续搅拌15min，然后置于4°C冰箱过夜，次日以1500rpm离心lOmin，取上清液以13000rpm 离心lh，在沉淀中边搅拌边加入胶体金溶液至沉淀溶解，得到胶体金-Gl重组蛋白溶液， 4°C冰箱保存备用；4)赤羽病抗体制备按体积比1 1，在赤羽病病毒中加入弗氏完全佐剂乳化为乳化 液，用2ml注射器吸取上述乳化液lmL，注射至兔的腋下和腹股沟中，间隔14天，再吸取上述 乳化液1. 5mL,注射至兔的腋下和腹股沟中，间隔10天后，从耳静脉采血0. 5 1. 0ml，分离 血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价，在抗体效价不低于1 16时，放兔血 并分离血清，该血清即为多克隆的赤羽病抗体溶液；5)胶体金试纸条制备将上述Gl重组蛋白溶液喷在硝酸纤维素膜的检测带上烘干备 用，将上述赤羽病抗体溶液喷在硝酸纤维素膜的质控带上烘干备用，将上述胶体金-Gl重 组蛋白溶液喷在玻璃纤维膜上烘干备用，在不干胶的底衬上按顺序贴附吸水垫、含有Gl重 组蛋白和赤羽病抗体的硝酸纤维膜、含有胶体金-Gl重组蛋白的玻璃纤维膜、样品垫，然后 切割成4mm宽的纸条，得到胶体金试纸条。
全文摘要
本发明公开了检测赤羽病抗体的胶体金试纸条及其制备方法，试纸条色括底衬，底衬上设置有吸水垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜和样品垫，硝酸纤维素膜上设置有检测带和质控带，检测带中包被有G1重组蛋白，质控带中包被有赤羽病抗体，玻璃纤维膜中包被有胶体金-G1重组蛋白，G1重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；本发明具有检测简便、快捷、特异、敏感和成本低等优点；制备方法包括RNA制备、G1重组蛋白制备、胶体金-G1重组蛋白制备、赤羽病抗体制备和胶体金试纸条制备，该制备方法得到特异性好和敏感度高的本发明试纸条，该制备方法较简单，成本也较低。
文档编号C07K16/10GK101949936SQ20101024548
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月2日 优先权日2010年8月2日
发明者吴东来, 张吉红, 李如松, 闻伟刚, 黄素文 申请人:宁波检验检疫科学技术研究院