专利名称：一种对曲妥珠单抗及其片段特异性的亲和肽的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种对曲妥珠单抗及其片段特异性的亲和肽，属于生物技术领域。
背景技术：
曲妥珠单抗(商品名赫赛汀)是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于人表皮生长因子受体-2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2，HER2)的 细胞外部位。目前主要用于治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌，在其它因HER2过表达引 起的胃癌、肺癌、卵巢癌等癌症治疗中同样具有潜在的治疗作用。它主要利用中国仓鼠卵巢 细胞(CHO)表达及生产，目前的表达量不足10g/L。亲和层析法是从低浓度生物产品中快 速获得高纯度活性抗体的最有力方法，已经广泛应用于工程或研究中用来纯化蛋白质或抗 体。亲和层析是利用固定化配基与待分离生物大分子间特异、可逆的亲和力使待分离 物质得到纯化的策略。目前的亲和性配基如染料分子、过渡金属离子虽然成本较低，但通常 具有一定毒性，不能用于治疗性抗体的分离；而常用的蛋白A、蛋白B等天然配基存在价格 昂贵，吸附容量小、化学稳定性差、容易生物降解、洗脱条件苛刻、易脱落、可能引起免疫应 答等缺陷。而肽配基则可很好的避免以上不足，短肽具有高化学稳定性，并且价格低廉且不 会引起免疫应答等优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种对曲妥珠单抗及其片段特异性的亲和肽。为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是其对曲妥珠单抗及其片段特异性 的亲和肽具有如下结构R1-X-R2其中，R1为NH2 ；R2为COOH ；X为三肽至十八肽的肽段。进一步地，本发明所述X为四肽或六肽的肽段。进一步地，本发明所述X的结构如下R3-R4-R5-R6,其中，R3为天冬氨酸或谷氨酸；R4为谷氨酸或天冬氨酸；R5为甘氨酸或色氨酸或脯 氨酸；R6为色氨酸或酪氨酸或苯丙氨酸或组氨酸。进一步地，本发明所述R5为甘氨酸或脯氨酸；R6为色氨酸或组氨酸。进一步地，本发明所述X的序列为选自SEQ ID Nos. 1至50中的任一种。进一步地，本发明所述X的序列为选自SEQ ID Nos. 5至25中的任一种。进一步地，本发明所述X的序列为选自SEQ ID Nos. 8至19中的任一种。本发明的亲和肽的应用是用于分离纯化或检测曲妥珠单抗及其片段。进一步地，本发明通过将所述亲和肽偶联于载体以分离纯化曲妥珠单抗及其片 段。
与现有其他类型亲和配基相比，本发明的有益效果是 (1)本发明的亲和肽长度在三肽到十八肽之间，属于小肽，小肽的化学稳定性好、 不易被生物降解。(2)本发明的亲和肽肽链长度小，与曲妥珠单抗及其片段的结合位点较常用的天 然蛋白质类亲和配基如Protein A小，因此洗脱条件更温和。(3)本发明的亲和肽结构简单，因此易制备、价格低廉。(4)本发明的亲和肽分子量小，因此从亲和介质脱落混入样品中时易与大分子曲 妥珠单抗样品进行分离，一旦进入人体不会弓I起免疫应答。(5)本发明的亲和肽与曲妥珠单抗的结合位点位于其Fab段与受体HER2结合位点 中，任何对曲妥珠单抗的改造不会影响该结合位点，因此本发明的肽不仅能与完整曲妥珠 单抗特异性结合，还可与曲妥珠单抗有效片段特异性结合。
图1为实施例1中不同氨基酸残基与曲妥珠单抗Fab段相互作用能结果图。图2为实施例1中脯氨酸、苯丙氨酸深入曲妥珠单抗表面疏水口袋的示意图，其中，1表示脯氨酸；2表示苯丙氨酸；3表示曲妥珠单抗表面疏水性口袋。图3为实施例1中谷氨酸、天冬氨酸与曲妥珠单抗Fab段上两个精氨酸侧链胍基 间相互作用的示意图，其中，4表示谷氨酸；5表示天冬氨酸；6表示精氨酸上的胍基。图4显示了实施例4中曲妥珠单抗Fab段吸附于配基偶联的聚乙烯醇亲和介质示 意图，其中，7表示亲和介质，8表示曲妥珠单抗Fab段。
具体实施例方式
实施例1 曲妥珠单抗亲和肽的设计本发明的肽是利用分子动力学方法基于曲妥珠单抗抗原结合片段与HER2复合物 构型理性设计得到的，并在随后进行了定性。曲妥珠单抗抗原结合片段与HER2复合物的三维结构数据(PDB ID=INSZ)由 Hyun-Soo Cho 等人测得(Hyun-Soo Cho et al. (2003) Nature, 421 :756_760)。二者的相互 作用位点包括 HER2 中的三段 loop 结构，Ioopl :557_561，1οορ2 :570_573，1οορ3 :593_603。 从复合物的结构中截取HER2的557-574号残基构成一个结构如下所示Pro-Glu-Ala-Asp-Gln-Cys-Val-Ala-Cys-Ala-His-Typ-Lys-Asp-Pro-Pro-Phe-C ys的亲和肽，将上述十八肽与曲妥珠单抗Fab段一起，在周期性边界的水盒子中进 行4ns的平衡，模拟采用NPT系综，温度为298K，压强为latm。计算蛋白质-十八肽复合物 平衡时不同氨基酸残基与Fab间的相互作用能大小，结果如图1所示(负号表示作用为相 互吸引)，可挑出3个残基作为主要结合位点，即谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸，且三种氨基酸 残基在空间位置上极接近，将三种氨基酸按空间距离远近排列为结构如Glu-ASp-Pro的 三肽肽段，这种处理可以使合成成本可以大大降低，但该亲和肽与曲妥珠单抗Fab段的空间互补性较差，无法达到较好的亲和性。十A 肽 Pro-Glu-Ala-Asp-Gln-Cys-Val-Ala-Cys-Ala-Hi s-Typ-Lys-Asp-Pro-Pro-Phe-Cys可以简化为至少包含结构如Glu-Asp-Pro的三肽肽段， 这些肽对于曲妥珠单抗表面特定位点有特异性及一定的亲和性。因此本发明的对曲妥珠单 抗或其片段特异性的亲和肽可以用如下结构表述R1-X-R2 此时，R1位于该肽段的N端，为NH2 ；X为三肽至十八肽，R2位于该肽段的C端，为 COOH0根据20种天然氨基酸残基侧链的带电情况、亲疏水性、芳香性、空间位阻的不同， 对上述谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸位点及与脯氨酸相邻的强疏水性残基苯丙氨酸进行氨基 酸突变实验，突变的目标氨基酸残基包括色氨酸、酪氨酸、组氨酸、丝氨酸、甘氨酸。突变后 得到的13组蛋白质-十八肽体系同样经过分子动力学模拟达到平衡后进行相互作用能计 算。结果如表1所示(表中数字代表十八肽中N端至C端氨基酸残基序号，数字前为突变 前残基类型，数字后为突变后残基类型)表1不同突变体系蛋白质_配基相互作用能计算结果
/K 相互作用能
体系 ， / 、 (kcal/mol)
Glu2Gly -176. 1±15. 0
Glu2Asp -294.1 ±18. 2
Glu2Lys _116.6±14.2
Glu2Ser -166. 5±17. 7
Asp4Glu -289. 7 ±18. O
Prol6Gly -333. 9±19. 1
Prol6Trp -329. 8 ±25. 6 Prol6Tyr -292. 3 ±15. 6 Phel7Gly -295. 3±19. 6 Phel7His -354. 2± 17. O Phel7Trp -396. 6± 19. 8 Phel7Tyr -318. 7± 18. 7 Prol6Phe
-310·0±17· 1
Phel7Pro从表1中可看出，色氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、组氨酸四种氨基酸的突变体系具有较 强的相互作用，与谷氨酸和天冬氨酸一起可以组成X的结构如Glu-Asp-Trp-Pro-Phe-His 的六肽肽段，其中色氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸均具有一定的疏水性，但如图2所示只有脯氨酸1和苯丙氨酸2两个残基可以很好的深入曲妥珠单抗Fab段表面富含色氨酸与酪氨酸的 疏水性口袋3。同时如图3所示，酸性氨基酸天冬氨酸4与谷氨酸5可以与曲妥珠单抗表面 结合位点中的两个精氨酸侧链胍基6具有很好的亲和性。
因此，曲妥珠单抗Fab段表面的结合位点只可与四个肽段的亲和肽有效接触，即X 为由R3-R4-R5-R6组成的四肽肽段时，既能保证该亲和肽的亲和性，又能最大限度的缩短生 产过程降低成本。此时R3、R4应为酸性氨基酸谷氨酸或天冬氨酸；R5、R6应为疏水性氨基 酸色氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、组氨酸以及表1中相互作用能绝对值较大的甘氨酸或酪氨 酸。这些氨基酸可以组成序列表中结构如SEQ ID Nos. 1-50所示的对曲妥珠单抗片段特异 性的亲和肽。进而通过空间结构及性质的互补性进行筛选，可以确定除R3、R4位置的谷氨酸、 天冬氨酸外，R5> R6为脯氨酸、甘氨酸、色氨酸、组氨酸是更优选的氨基酸残基，其中R5作为 连接性残基，可以进一步优化为具有特殊环状结构的脯氨酸或不含侧基的甘氨酸。利用这 些残基可以理性设计得到序列表中结构如SEQ ID Nos. 5-25所示的亲和肽，其中色氨酸、 脯氨酸的疏水性要强于组氨酸、甘氨酸，经过理性设计可进一步筛选得到结构如SEQ ID Nos. 8-19所示的特异性亲和肽。实施例2 多肽与曲妥珠单抗Fab段的亲和性将结构如SEQ ID Nos. 11_14所示的对曲妥珠单抗片段特异性的亲和肽置于曲妥 珠单抗Fab段重链上结合位点附近(残基号33、50、55、59、99-105)，通过操控式分子动力学 (SMD)方法沿亲和肽质心-曲妥珠单抗Fab段质心方向以0. 25 A/ps恒速压缩配基使二者紧 密结合，再依“曲妥珠单抗亲和肽的设计”中方法及条件进行分子动力学模拟，弛豫4ns得到 优化的亲和肽_曲妥珠单抗Fab段复合物平衡构型，对弛豫过程中达到平衡状态期间二者的 相互作用能进行计算发现，这些结构如SEQ ID Nos. 8-19所示的对曲妥珠单抗片段特异性的 亲和肽与曲妥珠单抗Fab段的相互作用能大小在205-225kJ/mol之间，可见二者具有较好的 亲和性，既可以作为分离纯化曲妥珠单抗的亲和肽又可以用于曲妥珠单抗的检测。实施例3 多肽与曲妥珠单抗及的亲和性构建完整曲妥珠单抗，其FC段PDB ID为3D6G，完整曲妥珠单抗的人源化部分(大 于95% )氨基酸序列来自Taxonomy ID 9606。按照“多肽与曲妥珠单抗Fab段的亲和性” 中方法考察上述优选中如SEQ ID Nos. 14所示结构的对曲妥珠单抗片段特异性的亲和肽与 曲妥珠单抗的亲和性，其相互作用能大小为210kJ/mol。以上说明本发明的经过理性设计与相互作用能筛选得到的对曲妥珠单抗片段特 异性的亲和肽可以很好的与曲妥珠单抗或其片段良好结合，利用这种亲和性可以达到对其 进行分离纯化或检测的目的。实施例4 亲和介质与曲妥珠单抗Fab段的亲和性构建三维聚乙烯醇水凝胶体系，该体系是由六条聚乙烯醇链形成的三维水凝胶， 每条链均是由40个乙烯醇单体构成的，且每条链各偶联4个结构如SEQ ID Nos. 11所示的 亲和肽。利用实施例2中方法对固定后配基与曲妥珠单抗Fab段的亲和性进行考察。如图 4所示，四面体模型代表亲和介质7，卡通模型代表曲妥珠单抗Fab段8。由图4可知，亲和 介质7上的偶联亲和肽与曲妥珠单抗Fab段8结合紧密，具有良好的亲和性。本发明的对曲妥珠单抗片段特异性的亲和肽可根据肽化学中已确立的常规方法 制备，例如Merrifield固相合成的Fmoc法进行制备。
权利要求
一种对曲妥珠单抗及其片段特异性的亲和肽，其特征是具有如下结构R1 X R2其中，R1为NH2；R2为COOH；X为三肽至十八肽的肽段。
2.根据权利要求1所述的对曲妥珠单抗及其片段特异性的亲和肽，其特征是X为四肽 或六肽的肽段。
3.根据权利要求2所述的对曲妥珠单抗及其片段特异性的亲和肽，其特征是X的结构 如下R3-R4-R5-R6其中，R3为天冬氨酸或谷氨酸；R4为谷氨酸或天冬氨酸；R5为甘氨酸、色氨酸或脯氨酸； R6为色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸。
4.根据权利要求3所述的对曲妥珠单抗及其片段特异性的亲和肽，其特征是所述R5 为甘氨酸或脯氨酸；R6为色氨酸或组氨酸。
5.根据权利要求3所述的对曲妥珠单抗及其片段特异性的亲和肽，其特征是所述X 的序列为选自SEQ ID Nos. 1至50中的任一种。
6.根据权利要求5所述的对曲妥珠单抗及其片段特异性的亲和肽，其特征是X的序列 为选自SEQ ID Nos. 5至25中的任一种。
7.根据权利要求6所述的对曲妥珠单抗及其片段特异性的亲和肽，其特征是X的序列 为选自SEQID Nos. 8至19中的任一种。
8.—种权利要求1的亲和肽的应用，其特征是用于分离纯化或检测曲妥珠单抗及其 片段。
9.根据权利要求8所述的亲和肽的应用，其特征是通过将所述亲和肽偶联于载体以 分离纯化曲妥珠单抗及其片段。
全文摘要
本发明公开了一种对曲妥珠单抗特异性的亲和肽，属于生物技术领域。本发明涉及的肽结构为R1-X-R2，其中R1为NH2，R2为COOH，X是为三肽至十八肽的肽段，优选四肽或六肽。本发明所述亲和肽偶联于载体以分离纯化曲妥珠单抗及其片段。本发明能够克服现有配基成本高、稳定性差以及安全性不足的缺陷，具有高亲和性、高特异性、迅速捕获曲妥珠单抗、低生产成本、低免疫原性、高化学稳定性等优点。它有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益与经济效益。
文档编号C07K5/08GK101955510SQ20101029869
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者吴韬, 孙天杨, 王 琦 申请人:浙江大学