专利名称：一种顶头孢霉蛋白质组的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种顶头孢霉蛋白质组的制备方法。
背景技术：
顶头孢霉是工业上用于发酵生产头孢菌素C的主要生产菌，而头孢菌素C是头孢类抗生素关键中间体7-氨基烷酸的前体。比较蛋白质组学是蛋白质组学研究的重要领域， 用于分析不同条件下蛋白质组的变化和差异，发现并鉴定在不同生理状态下的差异蛋白。 鉴于头孢菌素C在生产头孢类抗生素中的重要地位，开展对顶头孢霉的比较蛋白质组学研究，对发现高产菌与低产菌在蛋白质水平上的差异，从而可以为通过基因工程优化头孢菌素产生菌的代谢途径，获得可用于工业生产的高产菌打下基础，具有重要的意义。但是目前还没有顶头孢霉的蛋白质组学研究报道。蛋白质组制备是比较蛋白质组学技术的关键，目前尚没有统一的蛋白提取标准。 但原则上是尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失，减少对蛋白质的人为修饰及破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。探索一种合适的蛋白处理方法是实验成败的关键。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的顶头孢霉缺乏蛋白质组学研究的不足，提供一种顶头孢霉蛋白质组的制备方法及顶头孢霉总蛋白的提取方法，该方法提取的顶头孢霉总蛋白适合用于顶头孢霉蛋白质组的双向凝胶电泳分析。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种顶头孢霉蛋白质组的制备方法，包括以下步骤将顶头孢霉菌体用液氮研磨成粉末状后，用TCA-丙酮沉淀法提取总蛋白样品；将所得的总蛋白样品与水化溶液混合后，水化上样，采用IPG固相胶条，然后进行等电聚焦，等电聚焦完成后将胶条平衡，然后转移至SDS-PAGE凝胶上进行电泳，当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳，得凝胶；将所得的凝胶经染色后，用凝胶扫描仪透射扫描，将得到的图像用软件进行分析。本发明中，所述的“TCA-丙酮沉淀法”是指本领域常用的蛋白样品制备方法，一般的包括用含20mmol/L DTT或者0. 07% β -巯基乙醇的10% TCA (三氯醋酸)溶液20°C沉淀45分钟以上，离心收集，再用20mmol/L DTT或者0.07% β-巯基乙醇清洗，空气(冷冻) 干燥。TCA-丙酮沉淀法是适合于双向电泳的常用蛋白样品制备方法，具有杂质少，离子浓度小的特点。具体的，本发明的顶头孢霉蛋白质组的制备方法包括以下步骤(1)制备顶头孢霉双向电泳的蛋白质样品a.将顶头孢霉菌体用液氮研磨成粉末状；b.加入预冷的含有20mmol/L DTT的10% TCA丙酮溶液混勻后置于_20°C中过夜；c.在4°C下，12000rpm离心25分钟，弃上清，取沉淀，此步骤可重复多次，较佳的重复2 5次，最佳的重复3次；d.沉淀放于 室温风干；e.在沉淀中加入双向电泳样品裂解液，室温条件下浸提2小时，此步骤中可以用无菌枪头吹吸裂解液中的沉淀多次，较佳的吹吸5 10次，最佳的吹吸8次，使溶液与沉淀充分接触，提高浸提效果；f.在4°C 12000rpm下离心20min，取上清，即得顶头孢霉胞内蛋白质样品，测总蛋白浓度，分装，贮存于-80°C ；双向电泳样品裂解液7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS, 2% IPG缓冲液，40mM DTT ；(2)双向凝胶电泳取步骤(1)所得的总量为Img的蛋白样品与水化溶液混合成总量为450 μ 1的上样液，水化上样，均勻泡涨24cm的IPG固相胶条，将泡涨后胶条转移至胶条槽中，进行等电聚焦；等电聚焦完成后，将胶条在平衡液I中平衡15分钟，再在平衡液II平衡15分钟。 将平衡后胶条转移至SDS-PAGE凝胶上，进行电泳，当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳，得凝胶；水化溶液8M尿素，2% CHAPS，0. 5% IPG 缓冲液，18mM DTT，0. 002%溴酚蓝；SDS 平衡母液6M 尿素，75mM Tris-Cl ρΗ 8. 8，29. 3%甘油，2% SDS，0. 002%溴酚蓝·
JUL，平衡液I :SDS平衡母液中加入DTT 0. Img/胶条；平衡液II =SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0. 25mg/胶条；(3)图像采集分析将步骤(2)所得的凝胶经染色后，用凝胶扫描仪透射扫描，将得到的图像用软件进行分析。本发明中，可采用蛋白质组研究中常用的线性或者非线性的各种ρΗ范围的固相干胶条，如线性的固相干胶条PH3-10，较佳的采用非线性的固相干胶条pH3-10，更佳的是线性的固相干胶条PH4-7。本发明中，所述的总蛋白样品进行水化上样时上样液中DTT的浓度为常规，较佳的是1 2mM，最佳的是1. 8mM，IPG缓冲液的浓度为常规，较佳的是0. 5% 2%，最佳的是
2 % ο本发明中，所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般范围在10 28°C， 通常是25°C。本发明中，所述的等电聚焦可以是蛋白质组双向电泳中常规的等电聚焦程序。 较佳的，等电聚焦的电泳程序为50V 4h, 100V 3h, 1000V 2h, 3000V2h, 5000V 2h, 10000V 10h，上限电流为50 μ A/胶条，温度20°C。本发明中，第二向的电泳程序可以是蛋白质组双向电泳中常规的第二向电泳程序。较佳的，第二向的电泳程序为起始条件，IW/胶条，2h，然后2W/胶条，直至当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳。本发明中，所述的凝胶的染色方法是本领域常规的方法，可以是考马斯亮蓝染色法或者银染染色法。
本发明中，图像用软件进行分析的方法是本领域常规的方法，一般用软件 ImageMaster 2D Platinum 7. 0进行分析，分析所得图像的一致性和差异性。本发明的上述方法中未特别提到的都是采用本领域常规的技术。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是，一种顶头孢霉总蛋白的提取方法，包括以下步骤a.将顶头孢霉菌体用液氮研磨成精细的粉末状；b.加入预冷的含有20mmol/L DTT的10% TCA丙酮溶液混勻后置于_20°C中过夜；c.在4°C下，12000rpm离心25min，弃上清，取沉淀，此步骤可重复多次；d.沉淀放于室温风干；e.在沉淀中加入双向电泳样品裂解液，室温条件下浸提2h，此步骤中可以用无菌枪头吹吸多次，使溶液与沉淀充分接触，提高浸提效果；f.在4°C 12000rpm下离心20min，取上清，即得顶头孢霉总蛋白质样品溶液；双向电泳样品裂解液7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS, 2% IPG缓冲液，40mM DTT。本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。 本发明除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明通过建立一种适合于丝状真菌顶头孢霉的蛋白质组制备方法，获得可用于比较蛋白质组学研究的样品，利用双向电泳检测总蛋白提取的质量。头孢菌素C在生产头孢类抗生素中具有重要地位，可由此开展对顶头孢霉的蛋白质组学研究，为优化头孢菌素产生菌的分子育种及代谢工程打下基础，具有重要的意义。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1是采用宽范围线性Immobiline DryStrip胶条，pH值3_10，24cm长，采用 0. 5%浓度IPG缓冲液3-10，电泳条件为120kVh的双向电泳凝胶的胶体考染图。图2是采用宽范围非线性(NL)的Immobiline DryStrip胶条，pH值3-10，24cm 长，采用2%浓度IPG缓冲液3-10NL，电泳条件为120kVh的双向电泳凝胶的胶体考染图。图3是采用中等范围线性Immobiline DryStrip胶条，pH值4_7，24cm长，采用2% 浓度IPG缓冲液4-7，电泳条件为120kVh的双向电泳凝胶的胶体考染图。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明人通过对顶头孢霉CPC产生菌Acremonium chrysogenum 46117进行发酵培养七天后，发酵液离心后取菌体沉淀进行蛋白质组样品的制备，经过双向电泳技术对制备的样本质量进行检测。证明所制备的样本在完整性和重复性方面都比较好。实施例1顶头孢霉蛋白质组样本的提取
1、顶头孢霉Acremonium chrysogenum 46117斜面培养与菌种保藏将顶头孢霉CPC产生菌Acremonium chrysogenum ATCC46117接种于表面湿润的基础培养基斜面(麦芽汁20%，麦芽糖4.0，聚胨1%，ρΗ 7. O，加纯化琼脂粉2%)，于28°C 恒温培养10 14d(天)，直至长出丰满的孢子。长好的斜面置于4°C冰箱可保存1个月左右。较长期的保存采取向节孢子悬浮液中加入等体积40%的无 菌甘油，混勻后用液氮速冻并迅速置于-70°C保存。长期保存需将节孢子与脱脂牛奶混勻，分装冷冻玻璃管，然后用冷冻干燥机冻干，最后抽真空封口，置4°C保存。2、顶头孢霉 Acremonium chrysogenum ATCC 46117 的发酵培养从培养约IOd的斜面上刮下适量孢子，接种于装量为20ml的种子培养基(玉米浆，6%，蔗糖，3.5%，葡萄糖，0.5%，甲硫氨酸，0.05%，(NH4)2SO4,0.8，CaCO3,0. 5，豆油，
0.2ml/20ml, pH 6. 5) (w/v)中，于旋转式摇床培养3d，转速为230r/min，温度28 °C。然后再以10% (ν/ν)接种量转接至装量为20ml发酵培养基[玉米浆，10%，淀粉，3%，糊精6% 葡萄糖，0. 5 %，甲硫氨酸，0.6%,尿素，0. 3 %，KH2PO4,0.9%, MgSO4 · 7H20，0. 3%, (NH4) 2S04，
1.3%, CaCO3,1 微量元素溶液(FeSO4 · 7Η20，0· 8%, MnSO4 · H20,0. 2%, ZnSO4 · 7Η20, 0. 2%,CuSO4 ·5Η20，0· 2% ) 1ml，豆油，0. 4ml/20ml，pH，6. 2]的 250ml 摇瓶中，25°C，230rpm， 培养7d。3、顶头孢霉发酵产物的HPLC检测上述发酵液经普通定性滤纸过滤，收集滤液直接进行HPLC分析。采用大连依利特公司Hypersil 20DS，C18 (5 μ m，4. 6 X 150讓)柱，流动相为甲醇0. 2% (w/v)磷酸二氢钠 (5 95)，检测波长为254nm，流速lml/min，柱温为40°C，进样量为10 μ 1。4、顶头孢霉蛋白质组的制备顶头孢霉属于丝状真菌范畴，其细胞壁是由胞壁蛋白质与葡聚糖、甘露聚糖及几丁质错综交织而成的厚而坚韧的壁状结构，这使得丝状真菌来源的蛋白质组制备较困难。 选择合适的破壁方式使得胞内蛋白质释放完全是胞内蛋白质组制备的关键。采用液氮多次研磨并加入一定浓度的DTT破坏所有含有二硫键的蛋白质的结构，辅助破壁。在裂解蛋白质时采用硫脲，辅助尿素对蛋白质进行变性，同时增加膜蛋白的溶解度。(1)将实施例2的发酵液离心，弃掉上清，分离出菌体沉淀，保存于_70°C。将保存于-70°C的菌体沉淀500mg用液氮研磨成精细的粉末状，丝状真菌细胞壁厚而坚韧，较难破壁，故研磨尽量彻底，以保证菌体完全破壁。(2)研磨后的细粉末置于1. 5ml的Eppendorf离心管中，加入约Iml预冷的含有 20mmol/L DTT的10% TCA丙酮溶液，颠倒数次混勻后置于_20°C中过夜沉淀蛋白。(3)过夜后的混合液在4°C下，12000rpm离心25min。弃掉上清，沉淀再加入约Iml 含有20mmol/L DTT的预冷丙酮溶液洗涤后，相同的条件下离心20min。(4)弃上清，沉淀放于室温风干，待残留的丙酮溶液挥发尽，直至沉淀干燥成细粉状。(5)在沉淀中加入约400 μ 1含有尿素和硫脲的双向电泳样品裂解液(7Μ尿素，2Μ 硫脲，4% CHAPS，2% IPG缓冲液，40mM DTT)，室温条件下浸提2h。在这之间要用无菌枪头吹吸多次，使溶液与沉淀充分接触，提高浸提效果。(6)样品混合液在4°C 12000rpm下离心20min，取上清保存于_70°C，即为胞内蛋白质溶液。经分光光度法测定后蛋白浓度约在8mg/ml 12mg/ml之间，可用于双向电泳技术检测。实施例2双向电泳对蛋白组样本进行分离取总量为Img的蛋白样品与尿素水化溶液(8M尿素，2% CHAPS, 0. 5% IPG缓冲液， 18mM DTT, 0. 002%溴酚蓝)混合成总量为450 μ 1的上样液，室温放置Ih (25°C )，期间轻柔摇动。将水化好的蛋白质溶液放入DryStrip泡涨盘中，拖动24cm的Immobiline DryStrip 干胶条使蛋白质溶液均勻浸泡胶条，泡涨12 16h(25°C )。将泡涨后胶条转移至Manifold 胶条槽中，采用用Ettan IPGphor III系统进行等电聚焦，聚焦程序为(24cm胶条)50V 4h， IOOV 3h, 1000V 2h, 3000V 2h, 5000V 2h, 10000V 10h，上限电流为 50 μ A/胶条，聚焦温度 20°C。聚焦完成后，配制SDS平衡母液(6M尿素，75mMTris-Cl pH 8. 8，29. 3%甘油，2% SDS， 0. 002 %溴酚蓝)，将IOml/胶条的平衡液I (SDS平衡母液中加入DTT 0. Img,平衡15min，取出胶条用去离子水进行清洗后加入IOml/胶条的平衡液II (SDS平衡母液中加入碘乙酰胺 0. 25mg/胶条)平衡。将平衡后胶条转移至Ettan DAL Tsix系统制备的SDS-PAGE凝胶上 (配制方法按常规SDS电泳配制)，用琼脂糖封胶。加入缓冲液(1. 5M Tris-HCl, pH8. 6和 0. 4% (w/v) SDS))，接通冷凝水，接通电源进行电泳，起始条件，Iff/胶条，2h，然后2W/胶条， 直至当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳采用双向电泳胶体考染方法(由Neuhoff等修正)对制备的SDS-PAGE凝胶进行染色。首先将跑完的凝胶放于固定液(10%冰乙酸，40%无水乙醇)中固定过夜。然后轻轻倒出固定液，并将凝胶置于胶体考马斯蓝G-250染料工作液(8%硫酸铵，0. 8%磷酸， 0. 08%考马斯蓝光-250，20%甲醇；每块凝胶约500ml)中进行胶体染色，染色时间在8h左右。染色完毕后的凝胶用去离子水清洗两次，除去残留的染料，再加入约400ml去离子水置于脱色摇床上进行背景脱色，时间约在24h，其间换水2-3次。背景干净后的凝胶可置于凝胶扫描仪扫描仪上进行透射扫描，保存图像，用LabScan软件进行扫描，ImageMaster 2D Platinum 7. 0进行分析或直接用凝胶比较分析。实施例3双向电泳不同条件下检测蛋白质组双向电泳的第一向是等电聚焦，依据各种蛋白质的等电点不同，且有向其等电点会聚的特性，蛋白质可以沿梯度分离至各自的等电点。第二向是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照蛋白质和多肽的分子量大小将其分离。现在常用的分离蛋白质的胶条有线性和非线性之分，其pH值范围有宽窄之别。线性和非线性胶条的区别在于线性胶条的等电点是等距分布的，而非线性胶条在4-7之间的距离被延长。宽范围的胶条可以用于大略获得蛋白分布的总体情况，而窄范围胶条可以用于近距离研究所感兴趣的蛋白质区域。本实验分别尝试了不同PH梯度的线性和非线性的胶条。既有宽范围的PH3-10线性和pH3-10非线性胶条，也有窄范围的pH4-7线性，比较详细的获得了蛋白质组中各种蛋白质在PH值和分子量方面的信息。最初采用pH值3-10的固相干胶条，其双向电泳的凝胶染色图见图1。可见，得到的蛋白质分离效果不明显。分析原因一方面是由于最初制备的蛋白样本中含有干扰一向聚焦的物质，另一方面是顶头孢霉偏酸性的生长环境导致胞内大部分蛋白也是偏酸性的。针对以上两点，样本进行水化时降低了 DTT的浓度，提高了 IPG的浓度；并且采用了宽范围非线性的固相干胶条PH3-10NL，并且提高IPG缓冲液的浓度为2%，所得的双向电泳的凝胶染色图见图2。从图2中可以看出，蛋白分离效果有显著改善。由于非线性的固相干胶条 PH3-10NL在4-7之间的距离被延长，以致等电点在4_7左右的蛋白质会分得比较开。因此又采用中等范围的PH4-7的固相干胶条对制备的蛋白质样本进行分离，双向电泳的凝胶染色图见图3。图3说明pH4-7线性的固相干胶条比较适合顶头孢霉胞内蛋白质组的分离。
同时本实验还对多批次的顶头孢霉发酵菌进行实验，证明采用以上制备方法得到的蛋白质溶液重复性比较高。同一菌株不同批次的样品制备溶液所得到的双向电泳图谱比较一致，没有明显蛋白点的丢失。说明顶头孢霉胞内蛋白质组的制备方法具有可行性和可重复性。
权利要求
1.一种顶头孢霉蛋白质组的制备方法，其特征在于，包括以下步骤将顶头孢霉菌体用液氮研磨成粉末状后，用TCA-丙酮沉淀法提取总蛋白样品；将所得的总蛋白样品与水化溶液混合后，水化上样，采用IPG固相胶条，然后进行等电聚焦，等电聚焦完成后将胶条平衡，然后转移至SDS-PAGE凝胶上进行电泳，当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳，得凝胶；将所得的凝胶经染色后，用凝胶扫描仪透射扫描，将得到的图像用软件进行分析。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)制备顶头孢霉双向电泳的蛋白质样品a.将顶头孢霉菌体用液氮研磨成粉末状，b.加入预冷的含有20mmol/LDTT的10% TCA丙酮溶液混勻后置于_20°C中过夜；c.在4°C下，12000rpm离心25分钟，弃上清，取沉淀；d.沉淀放于室温风干；e.在沉淀中加入双向电泳样品裂解液，室温条件下浸提2小时；f.在4°C12000rpm下离心20min，取上清，即得顶头孢霉胞内蛋白质样品，测总蛋白浓度，分装，贮存于-80°C ；其中，所述双向电泳样品裂解液7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS, 2% IPG缓冲液，40mMDTT ；(2)双向凝胶电泳取步骤(1)所得的总量为Img的蛋白样品与水化溶液混合成总量为450 μ 1的上样液， 水化上样，均勻泡涨24cm的IPG固相胶条，将泡涨后胶条转移至胶条槽中，进行等电聚焦；等电聚焦完成后，将胶条在平衡液I中平衡15分钟，再在平衡液II平衡15分钟。将平衡后胶条转移至SDS-PAGE凝胶上，进行电泳，当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳， 得凝胶；其中，所述水化溶液8M尿素，2% CHAPS, 0. 5% IPG缓冲液，18mMDTT，0. 002%溴酚蓝；SDS 平衡母液6M 尿素，75mM Tris-Cl pH 8. 8，29. 3%甘油，2% SDS，0. 002%溴酚蓝;平衡液I :SDS平衡母液中加入DTT 0. Img/胶条；平衡液II =SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0. 25mg/胶条；(3)图像采集分析将步骤(2)所得的凝胶经染色后，用凝胶扫描仪透射扫描，将得到的图像用软件进行分析。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的IPG固相胶条是线性的固相干胶条PH3-10、非线性的固相干胶条pH3-10或者线性的固相干胶条pH4_7。
4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的总蛋白样品进行水化上样时上样液中DTT的浓度是1 2mM，IPG缓冲液的浓度是0. 5% 2%。
5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的总蛋白样品进行水化上样时上样液中IPG缓冲液的浓度是0. 5% 2%。
6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的等电聚焦的电泳程序为 50V 4h, 100V 3h, 1000V 2h, 3000V 2h, 5000V 2h，10000V10h，上限电流为 50 μ A/胶条，温度 20°C。
7.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，第二向的电泳程序为起始条件，IW/胶条，2h，然后2W/胶条，直至当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳。
8.一种顶头孢霉总蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤a.将顶头孢霉菌体用液氮研磨成精细的粉末状；b.加入预冷的含有20mmol/LDTT的10% TCA丙酮溶液混勻后置于_20°C中过夜；c.在4°C下，12000rpm离心25min，弃上清，取沉淀；d.沉淀放于室温风干；e.在沉淀中加入双向电泳样品裂解液，室温条件下浸提2h；f.在4°C12000rpm下离心20min，取上清，即得顶头孢霉总蛋白质样品溶液；其中，所述双向电泳样品裂解液7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS, 2% IPG缓冲液，40mMDTT。
9.如权利要求8所述的提取方法，其特征在于，步骤c重复2 5次。
10.如权利要求8所述的提取方法，其特征在于，步骤e中用无菌枪头吹吸裂解液中的沉淀5 10次。
全文摘要
本发明公开了一种顶头孢霉蛋白质组的制备方法，包括以下步骤将顶头孢霉菌体用液氮研磨成粉末状后，用TCA-丙酮沉淀法提取总蛋白样品；将所得的总蛋白样品与水化溶液混合后，水化上样，采用IPG固相胶条，然后进行等电聚焦，等电聚焦完成后，将胶条平衡后转移至SDS-PAGE凝胶上，进行电泳，当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳，得凝胶；将所得的凝胶经染色后，用凝胶扫描仪透射扫描，将得到的图像用软件进行分析。头孢菌素C在生产头孢类抗生素中具有重要地位，可由此开展对顶头孢霉的蛋白质组学研究，为优化头孢菌素产生菌的分子育种及代谢工程打下基础，具有重要的意义。
文档编号C07K1/30GK102443047SQ201010503369
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者刘红, 刘艳, 朱宝泉, 朱春宝, 胡又佳, 龚桂花 申请人:上海医药工业研究院