专利名称：一种从霞水母刺丝囊毒素内分离热激蛋白60的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体的说是一种从霞水母(Cyanea nozakii)刺丝囊细胞毒素中分离纯化热激蛋白60 (Heat Shock Protein60, Hsp60)的方法。
背景技术：
热激蛋白(Hsp)又称热休克蛋白或应激蛋白，是细胞在应激原刺激下所生成的一组蛋白质。根据其分子量的大小可将Hs ρ分为高分子量热激蛋白(HMW-Hsp)和低分子量热激蛋白(LMW-Hsp)。HMW-Hsp主要合成于哺乳动物、昆虫和酵母等细胞中，可以和激素结合，维持其特殊构象，LMW-Hsp主要合成于植物中。按照SDS电泳的表观分子量大小可以把 Hsp分为五大类Hspl00、Hs p90、Hsp70、Hsp60及小分子量热激蛋白sHsp。Hsp的生理功能一致认为其具有分子伴侣作用，即协助蛋白质跨膜运输，防止蛋白质前体积累并协助蛋白质跨膜转移，与未折叠蛋白质形成络合物以维持其转移能力，维持蛋白质的正常折叠状态，促进错误折叠的蛋白质降解；在蛋白质从头折叠及应激条件下能起到稳定多肽链、防止蛋白质失活的作用。它参与靶蛋白活性和功能调节，却不是靶蛋白的组成部分。热激蛋白的提取纯化方法根据不同的材料其具体方法也不尽相同，例如从鲤鱼的肝脏中提取热激蛋白的方法是，先将鲤鱼肝脏组织破碎后超声波破碎提取，然后在将其盐析后上DEAE纤维素离子交换层析和凝胶过滤G75后获得Hsp70。此外有人采用低渗勻浆、 超速离心、ConA-S^harose亲和层析、ADP-Agarose亲和层析和DEAE离子交换的亲和层析， 从热处理的小鼠肝癌细胞中分离纯化到Hsp70。还有研究者用腺苷二磷酸琼脂糖柱免疫亲和层析法从水牛淋巴细胞中纯化到Hsp70。但是到目前为止还很少有关Hs p60的提取研究报道。Hsp60是热激蛋白重要的成员之一，它的结构高度保守，在电子显微镜照片上， Hsp60分子均由14个亚基组成，每七个亚基构成一个环状，整体结构象两个面包圈垒成的桶，这个桶的内腔为折叠蛋白提供了一个保护性环境。Hsp60s最重要的功能之一就是作为分子伴侣参与新生肽链的折叠、寡聚蛋白质组装和蛋白质的跨膜运输线粒体。Hsp60主要参与核编码的运输入线粒体的蛋白质的加工、定位和装配。它还能够影响线粒体膜上F1-ATP 酶复合体的装配和线粒体蛋白Fieskei^e/s和eytobz正确加工和定位。叶绿体内Hsp60是由核基因编码，在非热激条件下含量很高。Hsp60另一重要功能是在胁迫下的起到保护作用。当在热激或是外界刺激下，体内变性蛋白急剧增加，此时Hsp60可与变性蛋白结合，维持它们的可溶状态，在有Mg2+和ATP存在下能够使解折叠的蛋白质重新折叠成有活性的构象，或者降解。霞水母属刺胞动物门，钵水母纲，旗口水母目，霞水母科，触须4m_6m.广泛分布于我国沿海，尤其夏季会在近海区域集中出现，给渔业生产、生态环境以及游泳者都造成了严重的影响，尤其是毒素能使被蜇伤者出现皮疹、瘙痒、水肿、肌肉疼痛、血压降低、呼吸困难甚至死亡等现象。水母毒素中含有重要的功能蛋白和生物活性蛋白，其中科学家已经从其中分离出具有溶血活性、神经毒性以及致死活性的蛋白质(文献1 :Chimg，J.J.，
3et al,2001. Partial purificationand characterization of a hemolysin (CAHl) from Hawaiian box jellyfish(Carybdea alata)venom. Toxicon 39,981-990. t ■ 2 : Sanchez-Rodriguez, J et al. Partial purification and characterization of a novel neurotoxin and three cytolysins from box jellyfish(Carybdea marsupialis) nematocyst venom. Archives of Toxicology,2006,80 :163-168.文献3 :Nagai,Hiroshiet al, Isolation and Characterization of a Novel Protein Toxin from the Hawaiian Box Jellyfish(Sea Wa sp)Carybdea alata, Biochemical and Biophysical Research Communications. 2000,275 :589-594)，但是到目前为止还没有从霞水母毒素中分离到热激蛋白60的报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种从霞水母刺丝囊毒素内分离热激蛋白60(Hsp60)的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种从霞水母刺丝囊毒素中分离热激蛋白60的方法1)将从霞水母触手中得到的霞水母刺丝囊细胞加入预冷缓冲液中破碎，破碎后低温离心，收集上清液，待用；2)步骤1)所得上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素于2-6°C下对pH7.820mM Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后低温离心，收集上清液，待用；3)将步骤2~)所得上清液过滤，而后将其上含DEAE Sepharose Fast Flow的阴离子交换树柱进行分离，首先采用PH7. 820mMTris-HCl缓冲液洗脱，而后采用含有浓度分别为0. 1-2M不同浓度的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集各洗脱峰， 而后用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩，待用；4)将步骤3)用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩的浓缩物用凝胶树脂 Superdex75柱纯化分离，采用含有浓度为0. 15-0. 5M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为0. 2-0. SmLmin-1,收集各洗脱峰，其中流出体积50mL_80mL内的组分(第一个洗脱峰)即为热激蛋白60。所述步骤1)霞水母触手中得到的霞水母刺丝囊细胞为将置于-80至_20°C的低温下保存的霞水母触手于2-6°C自溶12-48h，自溶后利用20-60目的标准分样筛滤去触手残片，而后在2-6°C下10000-15000g离心5-20min，收集下部沉淀，2_6°C冷冻干燥，待用，所述步骤1)霞水母触手中得到的霞水母刺丝囊细胞加入pH7. 820mM Tris-HCl预冷缓冲液中，而后将其置于冰浴下用超声波功率为200-400kw下破碎20-60min中，工作/ 间隙为5s/30s。所述步骤2)离心条件为在2-6°C下，10000-15000g离心5-20min。所述步骤3)中的过滤时将步骤2)收集的上清液用孔径为0. 22 μ m的微孔滤膜过滤。本发明的优点1.本发明从霞水母中分离纯化热激蛋白60的方法，为获得Hsp60提供了新的方法。2.本发明采用阴离子交换剂DEAE Sepharose Fast Flow和Superdex75分离纯化
4Hsp60，具有流速快、分辨率高的特点，而且分离步骤少，只经过两步柱层析分离就能够得到较纯的Hs p60，有效地缩短了分离时间，减少了 Hsp60的活性损失。
图1为本发明实施例提供的阴离子交换剂DEAE Sepharose !^stFlow分离霞水母毒素层析图。图2为本发明实施例提供的分子筛Superdex75分离DEAES印harose Fast Flow 0. 3M洗脱液的层析3本发明实施例提供的分子筛Superdex75Hsp60峰的SDS-PAGE电泳图。图4本发明实施例提供的目的蛋白Hsp60的N-端15氨基酸残基测序鉴定结果图。
具体实施例方式实施例11)霞水母毒素刺丝囊细胞的制备将Ikg冰冻的霞水母触手于4°C下自溶过夜后，利用20-60目(例如20、40、50、60)的标准分样筛滤去触手残片，然后取上清液并在 10000g、4°C下冷冻高速离心20min并收集下层沉淀，用生理盐水(0. 154mol .I^NaCl溶液) 于4°C反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后，-20°C下冷冻保存备用。2)霞水母毒素的提取取步骤1)霞水母刺丝囊细胞0. 5g和30mLpH7.820mM Tris-HCl预冷缓冲液置于烧杯中，在冰浴下用超声波功率为200kw下破碎30min中，工作/ 间隙为5s/30s。破碎完毕后在4°C下，IOOOOg离心20min，上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素，并用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，测定上清液中霞水母刺丝囊细胞毒素的蛋白浓度为1. Oang.mL—1。3)阴离子交换剂DEAE Sepharose Fast Flow分离霞水母毒素①上样前样品的预处理将提取到的霞水母刺丝囊毒素于4°C下对pH7.820mM Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后IOOOOg冷冻离心20min，弃沉淀，收集上清液。②上样和洗脱将上述处理好的样品上DEAE Sepharose FastFlow柱 (1. 0X20cm)，流速为0. SmLmirT1，然后以分别含有浓度为0、0. 1,0. 2,0. 3、2M的NaCl的 PH7. 820mM Tris-HCl进行梯度洗脱，收集各洗脱峰，同时用紫外检测器同步检测并收集各洗脱峰，而后用截留分子量为3kDa的Millipore超滤管浓缩，待用通过截留分子量为3kDa 的Millipore超滤管浓缩的洗脱组分即为含浓度为0. 3M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl 洗脱液洗脱下的组分(参见图1)。4)分子筛 Superdex75 分离①上样前样品的预处理将上述组分浓缩至lmL，然后IOOOOg冷冻离心20min，弃
沉淀，收集上清液。②上样和洗脱取上述处理好的样品ImL上分子筛Superdex75(l. OX 100cm)，然后以分别含有浓度为0. 15M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl洗脱，流速0. ZmLmirT1，紫外检测器同步检测并收集各洗脱峰，其中流出体积50mL-80mL内的组分(第一个洗脱峰)即为热激蛋白60 (参见图2)。 5) SDS-PAGE纯度检测将步骤4)分子筛SuperdeX75分离到的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。6)N_端序列测定同时将步骤4)分子筛SuperdeX75分离到的洗脱液进行N-端序列测定(参见图4)由上述图3和图4可知SuperdeX75的第一个洗脱峰为单一条带，分子量为60kDa， 并且经Edman降解法，测定该条带N-端序列为APKEIKFGADAKSLM，经NCBI数据库搜索结果显示，该蛋白为热机蛋白60。HSP60是由14个相同亚基构成双层环柱状体结构，每个环包括7个亚基，其中突出在环状空心内的2个亚基的疏水C-末端，能够与新合成的、定位蛋白以及变性蛋白疏水相互作用。HSP60有3个区域一个是与其它的伴侣蛋白如HSPlO相互作用的顶端区域，一个是ATP结合位点，最后一个是中间的铰链区域。实施例21)将2kg冰冻的霞水母触手于6°C下自溶过夜后，用滤筛过滤去除霞水母触手残片，收集上清液后15000g，4°C下冷冻高速离心15min并收集下层沉淀，用生理盐水 (0. 15mol -Γ1 NaCl溶液)于4°C反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后，-20°C下冷冻保存备用。2)取1. Og步骤1)的霞水母刺丝囊细胞和50mL pH7. 820mMTris_HCl预冷缓冲液置于烧杯中，在冰浴下用超声波功率为400kw下破碎60min中，工作/间隙为k/30s。破碎完毕后在4°C下，15000g离心15min，上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素，并用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，测定上清液中霞水母刺丝囊细胞毒素蛋白的浓度1. 26mg. ml/1。3)阴离子交换剂DEAE Sepharose Fast Flow分离霞水母毒素①上样前样品的预处理将提取到的霞水母刺丝囊毒素于4°C下对pH7.820mM Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后12000g冷冻离心15min，弃沉淀，收集上清液。②上样和洗脱将上述处理好的样品上DEAE Sepharose Fast Flow柱 (1. 6X20cm)，流速为lmLmirT1，然后以分别含有浓度为0、0. 1、0· 2、0· 3、2Μ的NaCl的 pH7. 820mM Tris-HCl进行梯度洗脱，收集各洗脱峰，同时用紫外检测器同步检测并收集各洗脱峰，而后用截留分子量为3kDa的Millipore超滤管浓缩，待用通过截留分子量为3kDa 的Millipore超滤管浓缩的洗脱组分即为含浓度为0. 3M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl 洗脱液洗脱下的组分。4)分子筛 Superdex75 分离①上样前样品的预处理将上述组分浓缩至1. 5mL，然后12000g冷冻离心15min，
弃沉淀，收集上清液。②上样和洗脱取上述处理好的样品ImL上分子筛SuperdeX75 (1. 6 X 70cm)，然后以含有浓度为0. 3M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl进行洗脱，流速0. SmLmin"1,紫外检测器同步检测并收集各洗脱峰，其中流出体积50mL-80mL内的组分(第一个洗脱峰)即为热激蛋白60。实施例31)将Ikg冰冻的霞水母触手于4°C下自溶过夜后，用滤筛过滤去除霞水母触手残片，收集上清液倒掉。然后10000g、4°C下冷冻高速离心20min并收集下层沉淀，用生理盐水 (0. 154mol -L-1NaCl溶液)于4°C反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后，-20°C下冷冻保存备用。
2)将1. Og的霞水母刺丝囊细胞和50mL pH7. 820mM Tris-HCl预冷缓冲液置于烧杯中，在冰浴下用超声波功率为400kw下破碎60min中，工作/间隙为5s/30s。破碎完毕后在4°C下，15000g离心15min，上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素，并用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，测定上清液中霞水母刺丝囊细胞毒素蛋白的浓度为1. 32mg. Hir103)阴离子交换剂DEAE Sepharose Fast Flow分离霞水母毒素①上样前样品的预处理将提取到的霞水母刺丝囊毒素于4°C下对pH7.820mM Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后15000g冷冻离心5min，弃沉淀，收集上清液。②上样和洗脱将上述处理好的样品上DEAE Sepharose Fast Flow柱 (2. 6X20cm)，流速为SmLmirT1，然后以分别含有浓度为0、0. 1、0· 2、0· 3、2Μ的NaCl的 pH7. 820mM Tris-HCl进行梯度洗脱，收集各洗脱峰，同时用紫外检测器同步检测并收集各洗脱峰，而后用截留分子量为3kDa的Millipore超滤管浓缩，待用通过截留分子量为3kDa 的Millipore超滤管浓缩的洗脱组分即为含浓度为0. 3M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl 洗脱液洗脱下的组分。4)分子筛 Superdex75 分离①上样前样品的预处理将上述组分浓缩至2mL，然后15000g冷冻离心5min，弃沉
淀，收集上清液。 ②上样和洗脱将上述处理好的样品2mL上分子筛SuperdeX75 ()，流速 0. SmLmirT1，用含浓度为0. 5M NaCl的pH7. 820mMTris-HCl洗脱液进行洗脱，紫外检测器同步检测并收集各洗脱峰。取上述处理好的样品2mL上分子筛SuperdeX75 0. 6X60cm)，然后以分别含有浓度为0. 5M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl依次洗脱，流速0. SmLmirT1，紫夕卜检测器同步检测并收集各洗脱峰，其中流出体积50mL-80mL内的组分(第一个洗脱峰)即为热激蛋白60。 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种从霞水母刺丝囊毒素中分离热激蛋白60的方法，其特征在于1)将从霞水母触手中得到的霞水母刺丝囊细胞加入预冷缓冲液中破碎，破碎后低温离心，收集上清液，待用；2)步骤1)所得上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素于2-6°C下对pH7.820mMTris-HCl 缓冲液透析过夜，然后低温离心，收集上清液，待用；3)将步骤幻所得上清液过滤，而后将其上含DEAESepharoseFast Flow的阴离子交换树柱进行分离，首先采用PH7. 820mMTris-HCl缓冲液洗脱，而后采用含有浓度分别为 0. 1-2M不同浓度的NaCl的pH7.820mM Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集各洗脱峰，而后用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩，待用；4)将步骤幻用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩的浓缩物用凝胶树脂SuperdeX75柱纯化分离，采用含有浓度为0. 15-0. 5M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为 0. 2-0. SmLmirT1，收集各洗脱峰，其中流出体积50mL_80mL内的组分即为热激蛋白60。
2.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离热激蛋白60的方法，其特征在于 所述步骤1)霞水母触手中得到的霞水母刺丝囊细胞为将置于-80至-20°C的低温下保存的霞水母触手于2-6°C自溶12-48h，自溶后利用20-60的标准分样筛滤去触手残片，而后在 2-6°C下10000-15000g离心5_20min，收集下部沉淀，2_6°C冷冻干燥，待用，
3.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离热激蛋白60的方法，其特征在于 所述步骤1)霞水母触手中得到的霞水母刺丝囊细胞加入pH7.820mM Tris-HCl预冷缓冲液中，而后将其置于冰浴下用超声波功率为200-400kw下破碎20-60min中，工作/间隙为 5s/30so
4.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离热激蛋白60的方法，其特征在于 所述步骤幻离心条件为在2-6°C下，10000-15000g离心5_20min。
5.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离热激蛋白60的方法，其特征在于 所述步骤幻中的过滤时将步骤幻收集的上清液用孔径为0.22 μ m的微孔滤膜过滤。
全文摘要
本发明涉及海洋生物技术领域，具体的说是一种分离纯化热激蛋白60(Heat Shock Protein 60，Hsp60)的方法。其分离方法如下水母刺丝囊细胞经超声破碎提取得到水母粗毒素，透析除盐后先后利用阴离子交换和凝胶过滤技术分离到Hsp60，测得其分子量为60kDa，本发明具快速、简便的特点，为获得Hsp60蛋白提供了新的方法。
文档编号C07K14/435GK102153639SQ20101059689
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者于华华, 冯金华, 刘松, 孟祥涛, 崔金会, 李克成, 李荣锋, 李鹏程, 秦玉坤, 邢荣娥 申请人:中国科学院海洋研究所