专利名称：一种提取分离杆菌肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种从杆菌肽发酵中分离提取杆菌肽的方法，具体地说，涉及一种从 5 20W/V%的杆菌肽发酵液中分离提取杆菌肽的方法。
背景技术：
杆菌肽(Bacitracin，CAS1405_87_4)是一种白色或浅黄灰色粉末，无臭、味苦。 在水、甲醇、丙酮、氯仿中几乎不溶，而易溶于吡啶中，在乙醚中微溶。该物质由多种氨基酸结合而成的不稳定的多肽，含有A、Ap B、C等至少9种组分组成的混合物，其中杆菌肽A为主要活性组分。1943年被美国的B. H. Johnson第一次发现，可以从枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)和B类地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)发酵液中提取分离制得，广泛用于治疗深部真菌、皮肤和粘膜真菌等疾病。杆菌肽主要通过发酵法制备，从发酵液提取分离杆菌肽的方法很多，主要有离子交换法、有机溶剂萃取法等方法，美国专利US2776240和US^15432公开了用离子交换吸附法提取分离杆菌肽的方法，这些方法的不足之处是收率低、工艺复杂。美国专利US2498165 和US26093M公开了用有机溶剂萃取提取分离杆菌肽的方法，这些方法使用的有机溶剂通常为醇类或各种酯类，工艺较为简单，但由于大量使用有机溶剂，对溶剂的选择性和再生能力提出了较高要求，而且这种有毒、易爆、易挥发溶剂的使用，对环境造成了严重污染，给操作也带来不便。同时有机溶剂价格昂贵，其易挥发的特性也使得工业运行的成本大幅度提尚ο因此，杆菌肽的提取分离方法已经不少，但是，这些方法运用在工业生产中，都存在不少困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取分离杆菌肽的方法，该方法具有效率高、设备简单、 经济性好、分离系数大、选择性高、能耗低、无二次污染、可在常温下连续操作等特点。本发明是通过如下步骤实现的1)、超滤提取分离杆菌肽浓缩液杆菌肽发酵液经过经过酸化，如盐酸、硫酸、草酸，震动筛过滤或离心去除菌体后，超滤去除菌体和大分子杂质、树脂吸附脱除无机盐、真空蒸发浓缩得到杆菌肽浓缩液；2)、杆菌肽浓缩液制备杆菌肽结晶体杆菌肽浓缩液经过溶剂萃取、脱色、纳滤、结晶分离、干燥、粉碎、筛分、检验、成品包装等生产步骤得到合格的杆菌肽。具体步骤如下(1)将杆菌肽发酵液经过酸化，如盐酸、硫酸、草酸，震动筛过滤或抽滤或泵入离心机中分离，将分离后的清液输入贮罐中。(2)将经过分离菌体后的杆菌肽发酵液清液再经超滤过滤除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子，并用1 5倍的水洗涤菌渣中残留的杆菌肽，边清洗，边超滤以获得高的产品收率。超滤所用的膜组件为无机膜组件，主要由1根、3根、7根、19根、37根多通道、管式、平板式、蜂窝体等膜元件组成，膜材料为截留分子量5000 200000的陶瓷膜、 沸石膜、玻璃膜。(3)杆菌肽发酵液也可以直接经过超滤过滤除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子，并用1 5倍的水洗涤菌渣中残留的杆菌肽，边清洗，边超滤以获得高的产品收率。超滤所用的膜组件为无机膜组件，主要由1根、3根、7根、19根、37根多通道、管式、 平板式、蜂窝体等膜元件组成，膜材料为截留分子量5000 200000的陶瓷膜、沸石膜、玻璃膜。(4)将经超滤去杂质所得的杆菌肽发酵液的超滤透析液和残余菌液洗涤水超滤透析液合并，用阳离子交换树脂静态吸附，如Amberlite IRC-50、Duolite C-20，树脂洗脱剂选用亲水性的低级醇类，如甲醇、乙醇；洗脱剂浓度为5% 45%，收集高含量部分洗脱液。(5)将杆菌肽洗脱液加入真空旋转蒸发器中，在10 40Kpa、30 60°C条件下减压蒸发去除洗脱剂及部分水，得到效价大于3000u/ml杆菌肽浓缩液。(6)向杆菌肽浓缩液中加入1 4倍的萃取剂，如甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丁醇，分离去除水相，再经过真空旋转蒸发器脱除萃取剂，向有机相中加入1 3W/V%的活性炭脱色，调节pH至3. 5 6. 5，搅拌，过滤，得到杆菌肽脱色液。(7)将杆菌肽脱色液用纳虑浓缩脱盐，浓缩至效价大于5000u/ml，电导小于 2000μ s/cm。除菌过滤，喷雾干燥，得到效价大于65U/mg的杆菌肽。纳滤所用的膜组件为板式膜组件、管式膜组件和卷式膜组件，纳滤膜材料为截留分子量200 500的醋酸纤维膜、 聚醚砜膜、聚酰胺膜。与已有的方法比较，本发明所采用的技术具有如下优点1、通过超滤、树脂吸附和纳滤三步分离技术的有机结合，直接从杆菌肽发酵液中分离得到杆菌肽，提高了杆菌肽产品的收率。2、杆菌肽是一种不稳定的生化产品，而膜分离是一种无相变低温操作的工艺过程，前端工艺采用陶瓷膜等无机膜超滤，后端工艺采用醋酸纤维膜等纳滤，可有效保护杆菌肽产品结构不被破坏。3、采用超滤、树脂吸附和纳滤三步分离，再结合真空旋转蒸发，精制的杆菌肽溶液被高度浓缩，使萃取步骤所用的萃取剂用量大幅降低，因而在收率上也将大大超过其它工艺方法。4、利用超滤、树脂吸附和纳滤三步分离法去除菌丝、菌体、色素、盐类等杂质，可获得高质量、高纯度的杆菌肽产品。5、本发明分离提取所得的杆菌肽产品工艺稳定、操作简便，是一种高效低成本的分离提取杆菌肽的技术，特别适合工业化生产。
具体实施例方式实施例一1、过滤离心将经过过滤的杆菌肽发酵液泵入离心机中分离，将离心液输入中转贮罐作为下步超滤的原料。(该步收率大于98% )。2、超滤将100L离心液泵入管式超滤系统超滤过滤，并不断加入纯水稀释冲洗浓缩液，得到除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子超滤透析液和含有残余菌丝体、 蛋白质、糖、色素等生物大分子的150L超滤浓缩液。超滤所用的膜材料为截留分子量5000 的陶瓷膜，工作条件为常温，进压3. 5bar,出压2. Obar。3、树脂吸附与解析在150L超滤浓缩液中加入树脂静态吸附，饱和的树脂用 15 %乙醇水溶液洗涤，再用30 %乙醇溶液解析，得到62L解析液；所用树脂为Amberlite IRC-50。4、真空旋转蒸发浓缩将62L杆菌肽解析液加入真空旋转蒸发器中，在10 40Kpa、30 60°C条件下减压蒸发去除乙醇，得到14L效价为3300u/ml杆菌肽浓缩液，所得乙醇再进行提纯，循环使用。5、萃取向14L杆菌肽浓缩液中加入15L乙酸乙酯提取分层，分离去除水相，再经过真空旋转蒸发器脱除乙酸乙酯，向有机相中加入2W/V%的活性炭脱色，用5%盐酸调节 PH = 5. 0，搅拌，过滤，得到杆菌肽脱色液12L。6、精制将12L杆菌肽脱色液用纳滤浓缩脱盐，纳滤膜选用醋酸纤维膜 (MWC0500)，浓缩至效价大于5000u/ml，电导小于2000 μ s/cm。除菌过滤，喷雾干燥，得到 685g效价大于65U/mg的杆菌肽。实施例二1、过滤离心与实施例一相同。2、超滤将IOOL离心液泵入管式超滤系统超滤过滤，并不断加入纯水稀释冲洗浓缩液，得到除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子超滤透析液和含有残余菌丝体、 蛋白质、糖、色素等生物大分子的150L超滤浓缩液。超滤所用的膜材料为截留分子量10000 的陶瓷膜，工作条件为常温，进压4. 5bar,出压2. ^ar。3、树脂吸附与解析在150L超滤浓缩液中加入树脂静态吸附，饱和的树脂用20% 甲醇水溶液洗涤，再用30%甲醇溶液解析，得到60L解析液；所用树脂为Duolite C-20。4、真空旋转蒸发浓缩将60L杆菌肽解析液加入真空旋转蒸发器中，在10 40Kpa、30 55°C条件下减压蒸发去除甲醇，得到15L效价为3300u/ml杆菌肽浓缩液，所得甲醇再进行提纯，循环使用。5、萃取向15L杆菌肽浓缩液中加入30L乙酸乙酯提取分层，分离去除水相，再经过真空旋转蒸发器脱除乙酸乙酯，向有机相中加入2W/V%的活性炭脱色，用5%盐酸调节 PH = 5. 0，搅拌，过滤，得到杆菌肽脱色液12L。6、精制将12L杆菌肽脱色液用纳滤浓缩脱盐，纳滤膜选用醋酸纤维膜 (MWC0500)，浓缩至效价大于5000u/ml，电导小于2000 μ s/cm。除菌过滤，喷雾干燥，得到 680g效价大于65U/mg的杆菌肽。实施例三1、过滤离心与实施例一相同。2、超滤与实施例二相同。3、树脂吸附与解析在150L超滤浓缩液中加入树脂静态吸附，饱和的树脂20%甲醇水溶液洗涤，再用30%甲醇溶液解析，得到60L解析液；所用树脂为D113。4、真空旋转蒸发浓缩将64L杆菌肽解析液加入真空旋转蒸发器中，在10 40Kpa、30 60°C条件下减压蒸发去除乙醇，得到15L效价为3300u/ml杆菌肽浓缩液，所得
5甲醇再进行提纯，循环使用。5、萃取向15L杆菌肽浓缩液中加入30L正丁醇提取分层，分离去除水相，再经过真空旋转蒸发器脱除正丁醇，向有机相中加入2W/V%的活性炭脱色，用5%盐酸调节pH = 5. 0，搅拌，过滤，得到杆菌肽脱色液15L。6、精制将14L杆菌肽脱色液用纳滤浓缩脱盐，纳滤膜选用聚醚砜膜(MWC0500)， 浓缩至效价大于5000u/ml，电导小于2000 μ s/cm。除菌过滤，喷雾干燥，得到688g效价大于65U/mg的杆菌肽。实施例四1、过滤离心与实施例一相同。2、超滤与实施例一相同。3、树脂吸附与解析在150L超滤浓缩液中加入树脂静态吸附，饱和的树脂用15% 乙醇水溶液洗涤，再用30%乙醇溶液解析，得到62L解析液；所用树脂为D152。4、真空旋转蒸发浓缩将62L杆菌肽解析液加入真空旋转蒸发器中，在10 40Kpa、30 60°C条件下减压蒸发去除乙醇，得到15L效价为3300u/ml杆菌肽浓缩液，所得乙醇再进行提纯，循环使用。5、萃取向15L杆菌肽浓缩液中加入45L正丁醇提取分层，分离去除水相，再经过真空旋转蒸发器脱除正丁醇，向有机相中加入2W/V%的活性炭脱色，用5%盐酸调节pH = 5. 0，搅拌，过滤，得到杆菌肽脱色液12L。6、精制将12L杆菌肽脱色液用纳滤浓缩脱盐，纳滤膜选用聚酰胺膜(MWC0500)， 浓缩至效价大于5000u/ml，电导小于2000 μ s/cm。除菌过滤，喷雾干燥，得到690g效价大于65U/mg的杆菌肽。本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此，本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。
权利要求
1.一种提取分离杆菌肽的方法。其特征步骤如下(1)超滤提取分离杆菌肽浓缩液杆菌肽发酵液经过经过酸化，如盐酸、硫酸、草酸，震动筛过滤或离心去除菌体后，超滤去除菌体和大分子杂质、树脂吸附脱除无机盐、真空蒸发浓缩得到杆菌肽浓缩液；(2)杆菌肽浓缩液制备杆菌肽结晶体杆菌肽浓缩液经过溶剂萃取、脱色、纳滤、结晶分离、干燥、粉碎、筛分、检验、成品包装等生产步骤得到合格的杆菌肽。
2.根据权利要求1所述的提取分离杆菌肽的方法，其特征在于所述的超滤去除杂质是将杆菌肽发酵液直接用超滤膜过滤去除残余的菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子物质，并用1 5倍的水洗涤菌渣中残留的杆菌肽，再进行超滤，合并杆菌肽发酵液和残余菌渣洗水两部分超滤液，超滤所用的膜组件为无机膜组件，主要由1根、3根、7根、19根、37 根无机膜组成的多通道、管式、平板式、蜂窝体等膜元件组成，膜材料为截留分子量5000 200000的陶瓷膜、沸石膜、玻璃膜。
3.根据权利要求1所述的提取分离杆菌肽的方法，其特征在于所述的树脂吸附所用的树脂为弱酸阳离子大孔吸附树脂，将杆菌肽超滤液用阳离子交换树脂静态吸附，树脂选用 Amberlite IRC-50,Duolite C_20、LewatitCNP80、D113、D152，树脂洗脱剂选用亲水性的低级醇类，如甲醇、乙醇；洗脱剂浓度为5% 45%。
4.根据权利要求1所述的提取分离杆菌肽的方法，其特征在于所述的真空蒸发浓缩是在10 40Kpa、30 60°C条件下减压蒸发去除洗脱剂及部分水，得到杆菌肽含量大于 3000u/ml杆菌肽浓缩液。
5.根据权利要求1所述的提取分离杆菌肽的方法，其特征在于所述的溶剂萃取所选择的溶剂为低级脂肪酸酯类或低级脂肪醇类，如甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丁醇，向杆菌肽浓缩液中加入1 4倍的萃取剂，并向有机相中加入1 3W/V%的活性炭脱色，调节pH至3. 5 6. 5，搅拌，过滤，得到杆菌肽脱色液。
6.根据权利要求1所述的提取分离杆菌肽的方法，其特征在于所述的杆菌肽脱色液纳虑浓缩脱盐，是将杆菌肽脱色液浓缩至效价大于5000u/ml，电导小于2000μ s/cm。除菌过滤，喷雾干燥，得到效价大于65U/mg的杆菌肽。
全文摘要
一种提取分离杆菌肽的方法，其特征步骤如为(1)超滤提取分离杆菌肽浓缩液杆菌肽发酵液经过经过酸化，震动筛过滤或离心去除菌体后，超滤去除菌体和大分子杂质、树脂吸附脱除无机盐、真空蒸发浓缩得到杆菌肽浓缩液；(2)杆菌肽浓缩液制备杆菌肽结晶体杆菌肽浓缩液经过溶剂萃取、脱色、纳滤、结晶分离、干燥、粉碎、筛分、检验、成品包装等生产步骤得到合格的杆菌肽产品。本发明具有效率高、设备简单、经济性好、分离系数大、选择性高、能耗低、无二次污染、可在常温下连续操作等特点，特别适合杆菌肽的工业化大规模生产。
文档编号C07K1/34GK102153633SQ20101060658
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者孙立文, 李军, 杨宏, 陈军 申请人:江苏九阳生物制药有限公司