专利名称：α-葡聚糖抗原及特异性单克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种α -葡聚糖抗原及特异性单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
α -葡聚糖(Dextran)是一种完全由葡萄糖单体组成的多糖，分子式(C6HltlO5)η，分 子量一般在几万至几百万之间，通常为白色的无定形粉末固体，呈胶粘状，粘度随分子量和 浓度的增加而增加，无臭无味，易溶于水，溶解性随分子量的增加而下降。在常温、中性溶液 中可稳定存在，遇强酸分解，在碱性溶液中其端基易被氧化，受热时可逐渐变色或分解。α-葡聚糖对制糖工业的危害有以下几个方面(1)造成糖分损失，减少收回率; (2)使糖液的粘度增加；(3)使转光度测定结果偏高；(4)使糖液的粘度增大；(5)使蔗糖结 晶时晶体生长变形；(6)大大降低制糖生产的效率。1959年，Nicholson和Horsley首次报道了 Haze法测定制糖过程中的α -葡聚 糖，这种方法是在样本中加入酒精使α -葡聚糖沉淀，然后利用分光光度计测量所产生的 浊度。ICUMSA第16届会议上讨论了采用50%酒精以保证α -葡聚糖完全沉淀，又避免过高 酒精度下其它多糖沉淀的可能(CSRHaze法)，在第17届会议上被列为试行方法，当时命名 为“原糖中类α-葡聚糖的Haze法”。此方法须在加入酒精前除去淀粉、蛋白质、脂肪、无 机盐等在50%酒精中不溶解的非α-葡聚糖物质，前处理比较麻烦。该方法作为ICUMSA的 试行方法一直到1986年才被取消。1984年周重吉和Wnukowski对Haze法进行了改进，主要是化验结果用MAU (千分 之一吸光度单位)取代CRSHaze的ppm (百万分之一吸光度单位)，这样可以避免作标准曲线 时所涉及的α-葡聚糖相对分子质量的问题。此方法被原糖贸易契约所采用，由于Haze法 的测定结果随着用来标定的α -葡聚糖相对分子质量的改变而变化，Amstar契约法不用标 准曲线，而以浊度或Haze (模糊度)作为结果，其单位是MAU，在酒精沉淀前使用大量的离子 交换树脂、微孔过滤器，使用无水酒精。罗伯特法是用80%的酒精分离糖液中所有的多糖，然后再用碱式硫酸铜处理这些 收集到的多糖，通过形成铜-α-葡聚糖络合物而分离出α-葡聚糖。用硫酸水解分离的 α-葡聚糖，所得的α-葡聚糖与苯酚显色，再通过分光光度法测定。据ICUMSA报道，对 于α -葡聚糖含量在300mg/L以上的原糖，CSRHaze法和罗伯特法的重复性和再现性在含 α-葡聚糖相当的水平上是一致的。近年来，在寻找更准确、更快捷的α-葡聚糖检测方法方面已经开展了大量的研 究。出现了酶水解法、SPRI快速扫描检验法和免疫分析法等新方法。美国糖业研究院的Brown和hkerman研究出用酶法测定还原糖中α -葡聚糖含 量的定量分析法。首先用80%的酒精沉淀α-葡聚糖，然后用α-葡聚糖酶进行水解，所 得的主要产物异麦芽糖(Isomaltose)用HPLC检测，根据异麦芽糖的含量可计算出α-葡 聚糖的含量。该方法所需时间较长，并且α-葡聚糖酶较贵，不适于常规检验。Richard和 Storkee的酶解法采用专一的α -葡聚糖酶，但该酶只能切断直链(1，6)键，对支链(1，2)，(1,3),(1,4)键不起作用，同时酶解后的短链分子很难通过渗透膜。英国旋光仪器公司(OPTICALACTIVITY)与伦敦的^festminster大学和牙买加的糖 业研究所合作开发了一种新的近红外旋光测定仪，使用了专用的酶，能分解α-葡聚糖，用 近红外旋光仪测定其旋光度的变化，可精确测量甘蔗样品中的α-葡聚糖。但目前专用的 α -葡聚糖酶和近红外旋光仪都较贵，还不适用于常规检验。澳大利亚的Curtin曾尝试过用免疫分析法对α -葡聚糖进行分析。免疫分析法 的操作步骤是根据抗体和抗原发生反应生成络合物制定的。免疫法具有操作简单，灵敏度 高，不需要特殊仪器和设备等优点，特别适合测定甘蔗的α-葡聚糖，目前正在研究将这种 方法用在常规检验中。但目前只有美国米兰公司(Midland)等能制备α-葡聚糖特异性单 克隆抗体，且价格昂贵，需进一步研究低成本、高效价抗体的制备技术。美国Clarke等研究出SPRI快速扫描检验法，也称为Tilbury修订法。这种扫描 法可在5min内完成检验，因此这种测定方法耗时少，从而避免了由于时间、温度等因素对 样品中α-葡聚糖含量的变化的影响，还具有操作简单，不需要特殊仪器和设备等优点，适 合于用在对甘蔗和蔗汁的常规检验中。此法相对快速，但前处理过程不可避免，且所测结果 包括所有多糖，使结果偏高。此外，近年来对α -葡聚糖含量的测定方法的研究报告主要还有苯酚-硫酸法、刚 果红法、双酶法和荧光钠法等。苯酚-硫酸法测量准确度不够，主要原因是加入样品中浓 硫酸会水解多糖和寡糖，特别是在糖品中存在大量蔗糖和多糖。刚果红法经常使测量结果 偏低，主要原因是α -葡聚糖分子可能被其它大分子所包裹，未能充分溶解，使显色不足。 双酶法利用苔酶将被包裹的α-葡聚糖分子打开成为分子量较小的α-葡聚糖，然后利用 α -葡聚糖酶将其分解为葡萄糖，并通过测定α -葡聚糖前后样品中葡萄糖含量的差异来 计算α-葡聚糖含量。该方法主要缺点是测量时间较长，试剂盒单价高，试剂保存时间短。 荧光钠法是利用荧光钠与α-葡聚糖结合后荧光最大激发和发射波长发生明显变化，而与 葡萄糖、乳糖、麦芽糖等结合后荧光性质不发生变化的原理测定α-葡聚糖含量。主要缺点 是如果样品中同时存在其它类似α-葡聚糖的多糖时，结果可能偏高。到目前为止，还没有一种α -葡聚糖测定方法被ICUMSA列为正式方法，主要是现 有的实验方法都有不完善的地方，有准确度不高、繁琐复杂、耗时太多等缺点。免疫学检测法具有特异性高，操作方便，结果可行等优点，是当前α-葡聚糖的定 量分析的主要发展方向。免疫学检测法结果的好坏，直接取决于抗体的效价和特异性，而抗 体的效价和特异性又直接取决于抗原的好坏。在CN 101139395Α中，公开了一种α-葡聚糖单克隆抗体的制备方法，通过将 葡聚糖分别与钥孔戚血红蛋白和牛血清蛋白偶联得到抗原，之后按常规方法制得单克
隆抗体，但是得到的抗体效价极低，其效价比不超过10_4，根本无法和α-葡聚糖有效反应 得到沉淀，其主要原因是抗原的免疫原性弱。
发明内容
本发明的目的在于提供一种α -葡聚糖抗原及特异性单克隆抗体的制备方法。本发明所采取的技术方案是
一种α-葡聚糖抗原的制备方法，包括以下步骤1)将α-葡聚糖与蛋白混合，用水溶解，调节溶液的pH为5 8，冷冻干燥，研磨成
粉；
2)将粉末置于50 60°C的恒温，相对温度为60% 90%，至少反应3天，得到α -葡 聚糖-蛋白交联物，所述α-葡聚糖-蛋白交联物即为α-葡聚糖抗原。蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白中的一种。α -葡聚糖的分子量在10 200kDa之间。一种α -葡聚糖特异性单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤
1)使用制备得到的α-葡聚糖抗原与佐剂混合，乳化，注射到动物体内；
2)选取血清效价高的动物体，取其脾细胞制成悬液，并与对数生长期的瘤细胞混合， 介导融合、筛选得到可以分泌α-葡聚糖特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；
3)使用杂交瘤细胞生产得到α -葡聚糖特异性单克隆抗体或使用腹水法生产得到 葡聚糖特异性单克隆抗体。本发明方法制备的抗原，免疫原性高，可有效地诱导产生免疫反应，获得性能优异 的抗体。由本发明抗原诱导的抗体，可特异性的与α-葡聚糖反应，可产生肉眼可见的沉 淀，效价高，可用于α-葡聚糖的定量分析。
图1抗原交联物的电泳图。图2是不同免疫部位获得的抗体效价测定对比图。图3是血清效价的测试结果图。图4是腹水的效价测试结果图。图5是抗体与竞争物的交叉反应性。图6是抗体与Dextran_T2000反应的效果图。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步说明本发明。α-葡聚糖抗原的制备 抗原制备实施例1
1)将Dextran 40 (分子量40kDa)与BSA按1 :1的质量比混合，之后使用蒸馏水溶 解，调节溶液的PH=6，固形物含量为6% (w/v)，冷冻干燥，研磨成粉；
2)将粉末置于60°C的恒温下，保持相对湿度为79%，反应7天，得到Dextran-BSA交 联物，该交联物即为α-葡聚糖抗原。按同样的条件制备Dextran-OVA交联物。对不同反应时间取样，并对产物进行SDS-PAGE电泳并使用糖染色和考马斯亮蓝 R250染色，其结果如图1所示，图Ia为糖染色，图Ib为考马斯亮蓝R250染色。图1中，条 带 1 为 BSA ;2 为 Dextran 40-BSA 偶联反应 Od ；3 为 Dextran 40-BSA 偶联反应 Id ；4 为 Dextran 40-BSA 偶联反应 3d ；5 为 Dextran 40-BSA 偶联反应 7d。结果表明反应Od时，未见交联物条带；反应Id后，BSA大量减少，交联物大量出现(图1 b，条带3)，交联物条带非常明显。随着反应时间的增加，交联物条带越来越深，说明 共价结合反应不断发生，聚合程度不断增加，分子量越来越大，得到大量的交联物(图1 b， 条带4、5)。可见，只要反应3d以上，即可获得可观的α-葡聚糖-蛋白交联物(α-葡聚 糖抗原)
抗原制备实施例2
1)将Dextran 400 (分子量400kDa)与BSA按2 :1的质量比混合，之后使用蒸馏水溶 解，调节溶液的PH=5，固形物含量为8% (w/v)，冷冻干燥，研磨成粉；
2)将粉末置于50°C的恒温下，保持相对湿度为90%，反应3天，得到Dextran-BSA交 联物，该交联物即为α-葡聚糖抗原。按同样的条件制备Dextran-OVA交联物。抗原制备实施例3
1)将Dextran 1000 (分子量IOOOkDa)与BSA按1 :2的质量比混合，之后使用蒸馏水 溶解，调节溶液的ΡΗ=8，固形物含量为6% (w/v)，冷冻干燥，研磨成粉；
2)将粉末置于55°C的恒温下，保持相对湿度为60%，反应5天，得到Dextran-BSA交 联物，该交联物即为α-葡聚糖抗原。按同样的条件制备Dextran-OVA交联物。抗原制备实施例4
1)将Dextran 2000 (分子量2000kDa)与BSA按1 :1. 5的质量比混合，之后使用蒸馏 水溶解，调节溶液的PH=7，固形物含量为5% (w/v)，冷冻干燥，研磨成粉；
2)将粉末置于60°C的恒温下，保持相对湿度为75%，反应6天，得到Dextran-BSA交 联物，该交联物即为α-葡聚糖抗原。按同样的条件制备Dextran-OVA交联物。抗原制备实施例5
1)将Dextran 10 (分子量IOkDa)与BSA按1. 5 :1的质量比混合，之后使用蒸馏水溶 解，调节溶液的ΡΗ=6. 5，固形物含量为5% (w/v)，冷冻干燥，研磨成粉；
2)将粉末置于58°C的恒温下，保持相对湿度为83%，反应5天，得到Dextran-BSA交 联物，该交联物即为α-葡聚糖抗原。按同样的条件制备Dextran-OVA交联物。抗原对比例
高碘酸氧化法取200mg的葡聚糖Dextran 40与等当量的高碘酸钾(KIO4)溶于pH=8 的PBS中，搅拌lh，加入一定量的BSA，在36°C水浴恒温搅拌池，再加入硼氰化钠(妝8!14)还 原。用7kD的透析袋在PBS中透析，冷冻干燥，得到Dextran-BSA交联物。α -葡聚糖抗体的制备 血清抗体的制备
将抗原制备实施例1制得的Dextran-BSA交联物与等量完全弗氏佐剂混合并充分乳 化，分别经背部皮内、腹腔、脾内注射C57黑鼠或Balb/C白鼠，每次抗原剂量为50 μ g/只，2 周后以等量不完全弗氏佐剂进行第2次免疫，之后每隔2周加强免疫1次，3次免疫后采血 测定血清中抗体的效价；按同样的处理，将通过高碘酸氧化法制备得到的Dextran-BSA交 联物免疫C57黑鼠或Balb/C白鼠。
6
小鼠经过4次免疫后，尾静脉采血，用ELISA法测定血清效价，以P/N彡2. 1的血 清稀释度判为血清效价。结果显示抗原制备实施例1制得的Dextran-BSA交联物的不同免疫方式，其免 疫效果有所不同，其ELISA效价如图2所示，以皮下注射的免疫效果最好。皮下注射获得 的血清抗体，其效价在1 :8000以上(P=O. 166，N=O. 070)，可见，抗原制备实施例1制得的 Dextran-BSA交联物具有很好的免疫原性，可诱导产生高效价的α -葡聚糖血清抗体。按同样的操作，使用其他α-葡聚糖-蛋白交联作为α-葡聚糖抗原免疫动物，得 到血清抗体。经测定，其诱导效果较抗原制备实施例1制得的Dextran-BSA交联物差。按同样的操作，使用高碘酸氧化法制备得到的Dextran-BSA交联物免疫C57黑鼠 和BALB/C白鼠，无法诱导产生血清抗体。按同样的操作，使用Dextran 40直接免疫C57黑鼠和BALB/C。多次免疫后，其血 清效价依然极低，表明Dextran 40单独作为抗原不能引起小鼠的免疫应答。杂交瘤细胞的制备
1)选择血清效价最高的鼠，处死，取出脾脏，置于灭菌的含少量培养液的平皿中，用 眼科剪刀将脾脏剪成小块，然后置入研磨器内，加入RPMI-1640培养液，充分研磨，挤出脾 细胞，再加入约IOml RPMI-1640培养液，充分混合后吸入大离心管，IOOOrpm离心6min，弃 去上清，重复上述过程2 3次；用RPMI-1640培养液重悬脾细胞；
2)将对数生长期的骨髓瘤细胞与上述制备的脾细胞分别用台盼蓝染色计数，吸取含 IO8个细胞和1 3 X IO7个骨髓瘤细胞的悬液量，充分混勻。IOOOrpm离心7min，上清尽量 弃净。将试管放于37°C恒温水浴中，沿管壁加入50% PEG 0. 8ml，静置Imin ；
3)在5分钟内加入25ml不完全培养液，第1分钟加1ml，第二分钟加細1，随后的3 分钟内将剩余液加完；
4)IOOOrpm离心7min，弃上清，加入IOml HAT培养液，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮 并混勻；
5)将细胞悬浮液加入已铺有饲养细胞层的96孔培养板中，每孔0. lml,37°C,5%C02 培养箱中培养，筛选得到可分泌α -葡聚糖单克隆抗体的杂交瘤细胞。经筛选，得到两株产出性能好的杂交瘤细胞，分别记为D9和D24。直接培养杂交瘤细胞，可获得α -葡聚糖单克隆抗体。 出于成本考虑，一般将杂交瘤细胞注射到动物体内，通过腹水法生产抗体。本发明中，将采用腹水法生产抗体，其具体步骤如下
1)采用健壮成年Balb/c小鼠，在注射杂交瘤细胞前1周，预先腹腔注射0. 5mL灭菌 液体石蜡；
2)每只鼠腹腔注射含1 5X IO6杂交瘤细胞的0. 5mL的盐水；当小鼠产生腹水时， 腹部穿刺放出腹水，离心腹水除去细胞，3000rpm离心15min ；
3)无菌储存或加0.01%叠氮钠置于_20°C冰箱冻存备用。腹水的间接ELISA检测结果如图4所示，筛选得到杂交瘤细胞腹水的效价均大于 IO60图4中，A为使用D9杂交瘤细胞生产得到的腹水效价，B为使用DM杂交瘤细胞生产 得到的腹水效价。使用rProtein A亲和层析纯化腹水，可得到高纯度的抗体。
抗体的特异性鉴定
采用竞争ELISA方法鉴定抗体的特异性，使用的抗体为纯化后的抗体。1) 将抗原制备实施例1制得的Dextran-OVA包被于96孔板，4°C过夜；
2)1%的明胶封闭2h，PBST洗板3次，分别加入倍比稀释的Dextran 2000与其竞争 物BSA、OVA、蔗糖、葡萄糖各50 μ L/孔，再加入抗体50 μ L/孔，板内竞争反应45min ；
3)用PBST洗涤液洗3次，加羊抗鼠酶标二抗，37°C放置Ih；
4)用PBST洗3次，加入OPD底物溶液，37°C避光放置15 min，加终止液(2M H2SO4溶 液)终止反应，酶标仪490nm读取结果。结果显示，OD值随标准品Dextran 2000增加而快速下降，当竞争抑制物Dextran 2000浓度为128 μ g/mL时，OD值为0. 167，抑制率达到85. 57%。而添加同浓度倍比稀释的 BSA、0VA，蔗糖，葡萄糖，其OD值与Dextran 2000为0时(OD=L 108)相当，抑制率均在3%以 下，说明抗体与这些竞争物无任何交叉反应。反应结果如图5所示。图5中，A为Dextran 2000，B为BSA，C为OVA，D为蔗糖，E为葡萄糖。抗体的免疫沉淀反应
在IOOyL rProtein A亲和层析纯化的抗体中，加入不同量的Dextran 2000和PBS，实 验表明，加入IOOng的DeXtran-T2000即可获得肉眼可见的明显沉淀，而加PBS没有沉淀产 生。反应结果如图6所示，表明本发明的抗体可有效地与α-葡聚糖反应，产生沉淀。比色 皿上标示的数据为Dextran 2000的加入量，con为对照。
权利要求
1.一种α-葡聚糖抗原的制备方法，包括以下步骤1)将α-葡聚糖与蛋白混合，用水溶解，调节溶液的ρΗ为5 8，冷冻干燥，研磨成粉；2)将粉末置于50 60°C的恒温，相对温度为60% 90%，至少反应3天，得到α-葡聚 糖-蛋白交联物，所述α-葡聚糖-蛋白交联物即为α-葡聚糖抗原。
2.根据权利要求1所述的一种α-葡聚糖抗原的制备方法，其特征在于蛋白为牛血 清白蛋白或卵清蛋白中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种α-葡聚糖抗原的制备方法，其特征在于α-葡聚糖的 分子量在10 200kDa之间。
4.一种α-葡聚糖特异性单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤1)使用权利要求1 3任意一项方法制备得到的α-葡聚糖抗原与佐剂混合，乳化，注 射到动物体内；2)选取血清效价高的动物体，取其脾细胞制成悬液，并与对数生长期的瘤细胞混合，介 导融合、筛选得到可以分泌α-葡聚糖特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；3)使用杂交瘤细胞生产得到α-葡聚糖特异性单克隆抗体或使用腹水法生产得到 葡聚糖特异性单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种α-葡聚糖抗原及特异性单克隆抗体的制备方法。抗原的制备方法，包括将α-葡聚糖与蛋白混合，用水溶解，调节溶液的pH为5～8，冷冻干燥，研磨成粉；将粉末置于50～60℃的恒温，相对温度为60～90%，至少反应3天，得到α-葡聚糖抗原。抗体的制备方法包括使用制备得到的抗原与佐剂混合，乳化，注射到动物体内；选取血清效价高动物体的脾细胞与瘤细胞融合，得到可分泌抗体的杂交瘤细胞；使用杂交瘤细胞生产或腹水法生产抗体。本发明方法制备的抗原，免疫原性高，可有效地诱导产生免疫反应，获得性能优异的抗体。本发明的抗体，可与α-葡聚糖特异性反应，产生肉眼可见的沉淀，效价高，可用于α-葡聚糖的定量分析。
文档编号C07K1/113GK102127143SQ20101060698
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者张远平, 曾练强, 李雨虹, 梁达奉, 王生育, 蚁细苗, 钟映萍, 颜江华, 黄玉南 申请人:广州甘蔗糖业研究所