专利名称：罗汉果甜苷v半抗原和人工抗原及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫学技术领域，具体是罗汉果甜苷V半抗原和人工抗原及其制备方法。
背景技术：
免疫分析是一种基于抗原抗体特异性识别和结合反应的分析方法，不仅可用于测定蛋白质、酶等大分子物质，而且还广泛用于测定小分子量的药物，特别适用于那些色谱法难以分析的药物。免疫分析不仅为临床诊断提供了依据，在内分泌学、病毒学、药理学、血液学及肿瘤学等研究方面得以应用，而且在农业科学、食品科学、环境保护、生态学及法医学等领域的应用也有所进展。免疫分析具有检测灵敏度高、特异性强、前处理简单、反应速度快、检测费用低廉，适于现场监控和大批量样品分析的特点。罗汉果甜甙V为葫芦素烷三萜类化合物是罗汉果的主要有效成分，在罗汉果干果中的总含量为3. 755%-3. 858%。罗汉果甜苷V在医药领域与食品工业方面运用非常广泛，其社会需求呈逐年上升趋势。罗汉果甜苷V为小分子天然化合物，相对分子质量较小，仅具有反应原性，而不具有免疫原性，因此不能直接采用免疫方法检测，需要与大分子蛋白等偶联形成复合物后才能成为完全抗原。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种罗汉果甜苷V的半抗原和人工抗原；
本发明的另一个目的是要提供上述罗汉果甜苷V的半抗原和人工抗原的制备方法，所制备出的产品可用于诱导生成抗罗汉果甜苷V特异性抗体的免疫方法研究，可用于罗汉果甜苷V特异性抗体效价的检测，其制备方法合成步骤简单，条件温和，产率较高。本发明的目的通过如下技术方案来实现
一种罗汉果甜苷V半抗原和人工抗原的制备方法，以罗汉果甜苷V为原料，利用丁二酸酐与罗汉果甜苷V反应生成罗汉果甜苷V 丁二酸单酯(罗汉果甜苷V-HQ，得到罗汉果甜苷V人工半抗原，用红外光谱和紫外光谱确定半抗原的结构；人工半抗原不分离，在碱性条件下，使之分别与牛血清蛋白(BSA)和人血清蛋白(HAS)结合，制得罗汉果甜苷V人工抗原罗汉果甜苷V-HS-BSA复合物和罗汉果甜苷V-HS-HAS复合物，用红外光谱和紫外光谱鉴定罗汉果甜苷V人工抗原，测定其结合比；其反应方程式为 (1)罗汉果甜甙V-HS人工半抗原
权利要求
1. 一种罗汉果甜苷V半抗原，其特征是以罗汉果甜苷V为原料，应用丁二酸酐与罗汉果甜苷V反应生成罗汉果甜苷V 丁二酸单酯制得，其结构式为
2.一种罗汉果甜苷V半抗原的制备方法，其特征是该方法包括如下步骤(1)取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏的吡啶，搅拌溶解，加入适量的4- 二甲基氨基吡啶(DMAP)，于室温下反应；(2)用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；(3)取反应液用氯仿和甲醇制备薄层，得油状纯罗汉果甜苷V-HS半抗原，置于4°C冰箱保存，所述氯仿与甲醇的体积比为Vlttt Vw=I 1。
3.一种罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原，其特征是以罗汉果甜苷V为原料，应用丁二酸酐与罗汉果甜苷V反应生成罗汉果甜苷V 丁二酸单酯制得，用红外光谱和紫外光谱确定半抗原的结构；人工半抗原不分离，在碱性条件下，使之与牛血清蛋白-BSA结合制得，其结构式为
4.一种罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原的制备方法，其特征是该方法包括如下步骤1)取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的 4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；2)用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是步骤4)所述BSA-碳酸缓冲液是将 IOmgBSA 溶于 ImlNii2CO3-NaHCO3 缓冲液。
6.一种罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原，其特征是以罗汉果甜苷V为原料，应用丁二酸酐与罗汉果甜苷V反应生成罗汉果甜苷V 丁二酸单酯制得，用红外光谱和紫外光谱确定半抗原的结构；人工半抗原不分离，在碱性条件下，使之与人血清蛋白-HAS结合制得，其结构式为
7.一种罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原的制备方法，其特征是该方法包括如下步骤1)取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的 4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；2)用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；3)取步骤2)的反应液，不分离，加入适量二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应 IOmin ；4)搅拌下滴加HSA-碳酸缓冲液，加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9， 于室温反应5小时；5)反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4°C透析，每5小时换水一次，透析3天， 经冷冻干燥，得罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原，置于-20°C下保存。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是步骤4)所述HAS-碳酸缓冲液是将 IOmgHSA 溶于 ImlNii2CO3-NaHCO3 缓冲液。
全文摘要
本发明提供了一种罗汉果甜苷V半抗原和人工抗原及其制备方法，所制备的罗汉果苷V人工半抗原的结构式为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原的结构式为罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原的结构式为其制备方法是以罗汉果甜苷V为原料，以吡啶为溶剂，利用丁二酸酐与罗汉果甜苷V反应生成罗汉果甜苷V丁二酸单酯(罗汉果甜苷V-HS)，得到人工半抗原；人工半抗原不分离，在碱性条件下，使之分别与牛血清蛋白(BSA)和人血清蛋白(HAS)结合，制得罗汉果甜苷V人工抗原罗汉果甜苷V-HS-BSA复合物和罗汉果甜苷V-HS-HAS复合物，用红外光谱和紫外光谱鉴定罗汉果甜苷V人工抗原，这为后续的罗汉果甜苷V抗血清的制备和抗血清效价的检测提供了可靠的实验基础。
文档编号C07J17/00GK102153612SQ20101061728
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者卢曦, 李丽, 李勇文, 李芳耀, 杨新平, 林家逊, 段小群, 陈旭 申请人:桂林医学院