专利名称：检测维生素d的分析方法及用于其的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于维生素D的分析方法(测定分析，assaying)，更具体地涉及用于具有维生素D结合蛋白质的复合物中的维生素D的分析方法。
背景技术：
在动物中，维生素D主要用来保持血液、在体内影响诸如骨矿化、肌肉收缩、神经传导以及其他一般细胞功能的特性/过程的物质中的钙和磷酸盐(酯)的循环水平。因而， 维生素D浓度的变化会影响肌肉功能以及免疫、神经、心脏和循环系统，并与多种病征如骨病、II型糖尿病和癌症关联。维生素D以多种形式出现，其中主要的两种形式被认为是D2和D3，尽管本领域技术人员认为该术语泛指相关的脂溶性分子族，以及这些物质的代谢物、衍生物和其他类似物。相应地，下文中的维生素D将用于指代本领域的全体已知和/或被广泛描述的/称为维生素D的分子组的所有成员。维生素D可由饮食中获取，或通过阳光的作用在皮肤中光化学产生。还不知晓维生素D2由动物合成，而是在饮食中从真菌和植物源获取。维生素D3可类似地经由肉食性饮食被动物获取，或者如上文所述，在皮肤中重新合成。然而，无论其来源，维生素D主要以 25羟基维生素D (下文中的25 (OH) D)形式在体内贮存，该25羟基维生素D在肝脏中通过维生素D的羟基化生成。25 (OH)D是血液中发现的维生素D的主要形式，并且是1，25_ 二羟基维生素D (下文中的1，25 (OH)2D)的前体，该1，25 (OH) 2D是主要在肾脏中产生的维生素D 的生理活性形式。1，25 (OH)2D结合到维生素D受体(VDR)上，其在所述结合之后，可介导快速和长期的基因组响应。维生素D的生物学活性形式通过与靶细胞中例如在肠道、骨头或肾脏中的维生素 D受体(VDR)结合发挥作用。维生素D在水中溶解性差，因此为了使其能够在血液中运输到靶细胞，维生素D结合到具有可溶性52kDa载体蛋白质的复合物中，该可溶性52kDa载体蛋白称为维生素D结合蛋白质或组特异性成分(group specific component，Ge)。维生素D 结合蛋白质具有变体，该变体包括但不限于类型1S、1F和2。下文中，包括本领域已知为维生素D结合蛋白质或Gc的所有变体的蛋白质组(group)被称作DBP。DBP的浓度通常是血液中维生素D浓度的20倍，因此由于DBP对维生素D具有非常高的结合亲合力(binding affinity)，所以发现大多数血液维生素D与DBP结合在一起。 这种维生素D-DBP复合物在下文称作holo-DBP。根据结合亲合力，DBP以下列相对亲合力结合到维生素D的不同形式/代谢物上 25 羟基维生素 EK25 (OH)D) = 24，25-二羟基维生素 D ( ，25 (OH) 2D) > 1，25 (OH) 2D >胆钙化酉享(cholcalciferol)。循环的25 (OH) D中，超过90%通常被发现结合在DBP上，虽然其他蛋白质，如人血清白蛋白(HSA)已显示与25(0H)D结合，但是亲合力明显较低。维生素D对于健康具有广泛而重要的影响，显然医学上需要能够简单并精确地测定体内维生素D的水平。在体液中，可测定两种主要形式的维生素D，即25(0H)D和1，25(0H)2D。如上所述，25 (OH) D通常在血液中的浓度比1，25(0H) 2D高，而且，由于具有相对长的半衰期，所以 25 (OH) D通常被测定从而评估和监测个体中维生素D的状况。此外，作为维生素D的活性形式，1，25 (OH) 2D的血浆/血清水平趋于保持在恒定水平，所以25 (OH) D水平是个体总体循环维生素D状况的更好的指示物。然而，确定1，25(0H)2D的水平可作为这种化合物的活性形式在肾脏中是否有足够产量的指示。当试图确定目标的水平时，直接测定是常规惯例。因此，现行的确定维生素D水平的分析方法要求在测定在水性介质中溶解性差的维生素D水平之前，首先将维生素D从其 DBP上离解。这种分离可通过变性并除去DBP或使用置换试剂释放维生素D，再测定所产生的游离维生素D而实现。离解DBP的要求显然使得在任何维生素D分析中引入这样的步骤成为必需，并且因此增加执行分析的时间和复杂性。由于维生素D的疏水性质，当前的分析技术，例如，使用溶剂来释放维生素D并使 DBP变性。这样的方法使得随后的变性DBP的分离和维生素D含量可被评估前的溶剂抽提成为必需。此外，当前评估维生素D水平的方法被报告有显著的易变性问题，既与单个技术有关，也与不同的分析方法被比较时有关。由于工艺复杂性增加，所以诸如可靠性的问题变得更具挑战性。不精确水平对于高敏感度分析变得非常重要，而且因为现有工艺的多阶段性(包括维生素D置换、液体添加和去除，及多重洗涤步骤)，误差可以积累并且因此精确度受损失。所以，需要能够提供不精确度较低的简化的维生素D分析方法。为了解决这些问题，本发明试图克服与现有技术相关的问题。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供了一种识别holo-DBP但是不识别apo-DBP(也称为未结合DBP或DBP)或对其(apo-DBP)具有相对低亲合力的分子。相对低亲合力可例如通过对apo-DBP表现出的交叉反应性< 10%或优选< 1%，以使其相对于apo-DBP优先结合holo-DBP的分子表示。该识别分子(recognition molecule)将能够准确且有效地区分holo-DBP和 apo-DBP。这将允许这种分子用于样本如组织样本或体液中维生素D检测的测试。以该方式，通过允许选择性确定DBP的holo形式和apo形式，本发明允许比现有程序所准许的更精确、更快速和更有益的靶向测量维生素D的水平。该识别分子可主要识别维生素D，但是与holoDBP交叉反应(crossreact)，使得 holoDBP被识别。关于这一点，本说明书中的措辞“识别”(或它的任何衍生词(如“认识”))的使用认为是覆盖主要识别、交叉反应性或任何二级(辅助，secondary)或继后 (subsequent)形式的识别。术语“识别分子”应被理解为涵盖以任何方式与靶相互作用或结合的分子。优选地，所述识别分子可用于捕获、浓缩、分离或检测holo-DBP。优选地，识别分子不识别未结合的维生素D。可替换地，识别分子可以识别样本中未结合维生素D连同holo-DBP。
优选地，识别分子对维生素D的特定变体形式例如25(0H)D表现出选择性。优选地，用于产生和测试识别分子的DBP是混合型DBP，即，含有该蛋白质的遗传性变型混合物的DBP。可替换地，DBP可以是DBP的特定遗传性变型。方便地，所述识别分子选自抗体(例如单克隆抗体)、抗体片段(例如F(ab)、 F(ab' )2、F(V)、scFv)、蛋白质、分子印迹聚合物(MIP)、互补决定区(CDR)、寡肽、寡核苷酸 (例如适体(aptamer))或对holo-DBP有亲合力的小有机化学物质。可选地，所述识别分子包括信号成分(signal component)，其中所述成分是放射性同位素、荧光团、发色团、结合配体(binding ligand)或酶底物，以便所述信号成分使所述组合物能够被检测。可共轭结合到识别分子的信号分子的实例是但不限于酶，如辣根过氧化物酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酶、S-5-类固醇异构酶(delta-5-steroid isomerase)、酵母乙醇脱氢酶、α -磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、葡糖淀粉酶、和乙酰胆碱酯酶；化学发光性化合物，如吖啶酯；合适的荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、若丹明(rhodamine)、藻红蛋白(phycoerythrin)、藻青蛋白 (phycocyanin)、别藻蓝蛋白(allophycocyanin)、邻苯二醛(o-phthaldehyde)和荧光胺 (fluorescamine)。根据本发明的另一方面，提供了一种与本文中描述的识别分子竞争的分子。根据本发明的另一方面，提供了一种用于检测样品中的维生素D的方法，该方法包括使样品与本发明的分子接触以及检测样品中存在的维生素D的量。这种方法在确定维生素D水平时，消除了对于从DBP上离解维生素D的需要，且因此允许更快和更简单地测定分析维生素D。样品中holo-DBP的量与维生素D的数量有直接关系。该方法也可根据所使用的识别分子而用来检测不同形式的维生素D。例如，如果要评估肾脏处理维生素D的功能，则可使用1，25 (OH) 2D的识别分子；或者如果要评估血液中维生素D的量，则要么使用识别结合DBP的所有维生素D的通用识别分子，要么使用识别结合到DBP的血液中维生素D的主要形式Q5(0H)D)的识别分子。方便地，样本可以是任何组织样本或体液，优选为血液、血清或血浆。本领域技术人员将理解，这样的方法可以大量不同方式并依赖于不同的原理实施。例如，使用中识别分子可以是，或能够被固定从而使得holo-DBP能够从样本其余部分中分离。如果所述识别分子被固定，则识别分子可以直接或间接地偶联(coupled to)到固体表面，如滤器或管壁，或作为进一步的实例，偶联到液体色谱法使用的载体(support) 或基质(matrix)(可装载到柱子中)。如果识别分子能够被固定，则可通过下面的方法实现，即将该分子偶联到特异性结合配对物(specific binding partnership)(例如， 生物素/抗生蛋白链菌素)的一个成员，并且随后用该配对物的另一成员来固定或聚集 (agglomerate)来自样本其余部分的分子。本领域技术人员将进一步理解，该方法可以有可能作为竞争性或替代性分析实施，因而，例如，可使用可以是可选标记的并与holo-DBP竞争结合识别分子的分子(即， holo-DBP竞争性分子)。而且，应理解，在本发明的某些实施方式中也可以使用与holo-DBP 识别分子和/或holo-DBP识别分子复合物相互作用的其他分子。
在本发明不同实施方式中，在溶液或沉淀物中测定识别分子和/或holo-DBP竞争分子(二者之一或二者都可被固定)是理想的，。在进一步的实施方式中，测量适当标记的 holo-DBP竞争分子和适当标记的识别分子之间的空间相互作用是方便的。大量检测技术可用于本发明的不同实施方式中。可使用直接评估如质谱分析或高效液相色谱(HPLC)，或方便地使用的成分可偶联到信号分子或标记物，例如是发冷光的、化学发光的、放射活性的、发荧光的、适合用于比色检测的结合蛋白质(binding protein)、表位或酶或底物的那些。而且，成分中可选地并入放射标记物或电化学标记物。实际上，本发明的实施方式中可并入本领域已知的任何信号分子或标记物。本领域技术人员将理解，本发明的方法可利用各种各样的系统实施，例如 放射性免疫计量分析(IRMA)和酶联免疫吸附分析(ELISA)、微粒子酶免疫测定法 (MEIA)、免疫沉淀反应和液相色谱，以及直接测定分析形式如表面等离激元(Surface Plasmon Resonance)、表面声波禾口石英晶体微天平法(Quartz Crystal Microbalance methodologies)。方便地，识别分子被固定在微滴定板(microtitre plate)或微粒如珠粒上，其中珠粒包括胶乳、聚苯乙烯、二氧化硅、螯合琼脂糖和/或是磁性的。根据本发明进一步的方面，提供了一种利用本文中描述的识别分子从apo-DBP中分离holo-DBP的方法。根据本发明进一步的方面，提供了一种包括本文中描述的分子的试剂盒，该分子用于上文描述的检测维生素D的方法或从apo-DBP中分离holo-DBP的方法。本发明将通过以下非限制性实施例进行举例说明。在以下实施例中，holo-DBP是 25-0H-D3(获自 Merck Chemicals Ltd.，目录号为 679102)和混合型 DBP (也获自 Merck Chemicals Ltd.，目录号为；345802)的复合物，但holo-DBP可等同地涉及任何形式维生素 D和任何形式DBP的复合物、特定形式的维生素D和非特定形式DBP或非特定形式维生素D 和特定形式DBP。
本发明将参考附图进行描述，其中图1示出了抗体产生脾细胞与骨髓瘤细胞初始融合后，holo-DBP抗体对 holo-DBP (1 μ g/mL)和 apo-DBP (1 μ g/mL)的差异结合。图2示出了第一轮有限稀释(limiting dilution)后holo-DBP抗体对 holo-DBP (1 μ g/mL)和 apo_DBP(l μ g/mL)的差异结合。图3示出了第二轮有限稀释后holo-DBP抗体对holo-DBP (1 μ g/mL)和 apo-DBP(1 μ g/mL)的差异结合。图4示出了 SELEX工艺过程。
具体实施例方式实施例1单克隆抗体的制备holo-DBP (维生素D复合于DBP)的鼠科单克隆抗体通过改进的Kohler和Milstein 方法(G. Kohler 和 C. Milstein，Nature，1975256，495)制备。雌性 BaLb/C 小鼠通过皮下注射未轭合的holo-DBP (每鼠50μ g)进行免疫。免疫原在弗氏完全佐剂(complete Freund's adjuvant)中提供。弗氏不完全佐剂中提供的抗原加强(antigen boosts)用来增强抗体响应(每次加强每只小鼠20yg)。通过holo-DBP的固相免疫分析监视免疫响应。 在收获脾细胞及脾细胞与鼠科骨髓瘤细胞的融合体之前，小鼠经过四次或五次加强。脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合在PEG存在下，免疫小鼠脾细胞和NSO小鼠骨髓瘤细胞融合。将细胞接种于培养皿的孔中，并在选择性HAT (次黄嘌呤、氨蝶呤和腺嘧啶脱氧核苷)培养基存在下进行培养， 该培养基允许选择融合的脾和骨髓瘤细胞。通过标准固相免疫分析技术，测试来自融合细胞的上清液对holo-DBP和/或apo-DBP的反应性(见后面的实施例)。腹水中免疫球蛋白组分(immunoglobulin fraction)的分离为了从腹水中分离免疫球蛋白组分，免疫球蛋白组分首先通过加入等体积饱和硫酸铵溶液在4°C从腹水中沉淀。将沉淀物离心，再用与原腹水等体积的Tris缓冲液溶解，然后从同样的iTris缓冲液进行透析。免疫球蛋白溶液用单Q柱(mono Q column)和盐梯度洗脱免疫球蛋白进行进一步纯化。然后测试免疫球蛋白组分对于抗原的免疫响应。实施例2多克隆抗血清(polyclonal antisera)的制备根据 Methods in Enzymology, H. Van Vunatis and J.J.Langone(Eds)1981, (729b) and 1983，92 (E)中描述的方法，holo-DBP的多克隆抗血清可通过使用holo-DBP在羊或兔体内进行培养。本领域已知的其他物种也可被用于产生多克隆抗体。对holo-DBP具有选择性的多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的技术，如亲合纯化进行分离。例如，多克隆抗血清可与涂覆有holo-DBP的固相孵育，孵育后不与该固相结合的材料(物质)可被洗去，只留下能与holo-DBP结合的分子，通过包括使用离液离子 (chaotropic ion)在内的多种技术，这些分子本身可以从该固相释放出来。释放的抗体然后可以与涂覆apo-DBP的固相孵育，由此在溶液中只留下相对于apo-DBP对holo-DBP表现出特异性的那些抗体。实施例3噬菌体显示文库的淘选可在噬菌体表面上利用组合免疫球蛋白文库实施具有可结合复合于DBP的维生素D而非仅识别维生素D或DBP的前述特性的抗体筛选，如在Bartas C. F. and Lerner, R. Α. (1991)Combinatorial immunoglobulin libraries on the surface of phage (phabs)中描述的。抗原特异性Fabs的快速选择。方法(METHODS) =A Companion to Methods in Enzymology2 :119-124。显示所期望抗体的噬菌体通过“噬菌体淘选(phage panning) ”进行选择，“噬菌体淘选”是一种与固相免疫分析具有相似性的技术。将Holo-DBP固定在固体表面上，如微滴定板、珠粒如但不限于磁性珠粒、或柱子。然后将噬菌体加入并允许与holo-DBP相互作用。 在洗涤以去除所有未相互作用的材料后，将结合的噬菌体洗脱并通过在新的细菌性宿主细胞中复制而进行扩增。为了增强holo-DBP抗体的选择，当与holo-DBP相互作用时，向该相溶液中加入提高浓度的apo-DBP。这种选择工艺重复几次，从而选择只表达结合holo-DBP的抗体的噬菌体种群。随后分离抗体基因，并插入表达载体从而产生可溶性抗体片段，因为抗体基因必须在无噬菌体外壳蛋白的情况下表达。这可通过使用标准聚合酶链式反应(PCR)扩增或限制酶来实现，其中轻链和重链的Fab基因被分离并被克隆入新载体。测试该fab片段对以 5 μ g/mL磷酸盐缓冲液(PBQ涂覆在平板上的apo-DBP或holo-DBP的差异结合。Fab在 0. 1 μ g/mL或0. 2 μ g/mL的PBS溶液中的浓度下进行测定分析。为了产生单克隆抗体，将载体-Fab基因转化到新的宿主中并以单克隆菌落分离。 分离几个克隆菌落并诱导抗体表达，在通过细胞溶解而释放单克隆抗体后，通过酶联免疫吸附分析(ELISA)测试溶解产物中holo-DBP抗体的存在。实施例4抗体结合测定分析和克隆选择NUNC maxisorb平板用浓度为1 μ g/mL的holo-DBP或apo-DBP碳酸盐缓冲液(pH 为9. 5)涂覆过夜，每孔100 μ L。次日，丢弃涂覆混合物，并用BSA Omg/mL磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7. 5)在室温下阻断平板60分钟。用PBS+0. 吐温20 (PBST)洗涤平板一次。 样本，即在PBS中稀释的血液/细胞上清液材料，用holo-DBP或apo-DBP室温孵育60分钟。为了促使对holo-DBP而不是apo-DBP的特异性抗体的选择，在涂覆holo-DBP的孔中孵育前，也可以将递增过量浓度(即相比蛋白质的相关涂覆浓度过量10至100倍，即每样本 IugMlOyg)的apo-DBP (即缺乏结合的维生素D的DBP)加入抗体溶液进行1小时预孵育。然后丢弃上清液并用PBST洗涤该板三次。将在PBS中以1 5000稀释度使用的第二抗体(共轭结合于辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠抗体，Bio-Rad目录号170-6516)与平板室温下孵育60分钟。在加入四甲基联苯胺(TMB)底物(从Biopanda Diagnostics获得， 目录号TMB Solution II)前，用PBST洗涤平板三次。通过加入2M H2SO4终止反应。然后在分光光度计上测定450nM处样本的吸光率/光密度值。图1示出了来自抗体产生脾细胞与骨髓瘤细胞初始融合后产生的抗体一组实验的对holo-DBP和apo-DBP的典型差异结合。 表1示出了 holo-DBP抗体上清液与apo-DBP的交叉反应性。
融合克隆体与apo-DBP的交叉反应性1B584. 2%1B978. 0%2F1277. 0%4E173. 1%10A1233. 9%表1 融合后鉴定的holo-DBP抗体与克隆体的apo-DBP的交叉反应性。进一步筛选了所有相对于apo-DBP对holo-DBP具有更大特异性的孔(样本)。 移去得到抗体产生细胞的所有孔中的样本并通过至少两个回合的标准有限稀释克隆程序进行克隆。在每回合的有限稀释后，如上文指出的，测试克隆上清液中相对于apo-DBP对 holo-DBP显示更大特异性的抗体表达。参见图2和3，其分别示出第一和第二回合有限稀释后，holo-DBP抗体克隆体对 holo-DBP和apo-BDP的差异结合的一组实验的结果，并且表2和表3示出了 holo-DBP抗体上清液与apo-DBP的交叉反应性(表2涉及图2的样本，而表3涉及图3的样本)。
权利要求
1.一种识别holo-DBP但不识别apo-DBP的分子。
2.一种识别holo-DBP且对apo-DBP具有相对较低亲合力的分子。
3.根据权利要求2所述的分子，其中，与apo-DBP的交叉反应性小于10%。
4.根据权利要求3所述的分子，其中，与apo-DBP的交叉反应性小于1%。
5.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其进一步包括信号成分。
6.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述分子不识别维生素D。
7.根据权利要求1到5中任一项所述的分子，其中，所述分子识别维生素D。
8.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述holo-DBP包括与DBP相关联的 25(OH)D。
9.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述DBP是混合型DBP。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述分子是抗体或其片段。
11.一种与根据前述权利要求中任一项所述的分子竞争的分子。
12.一种用于检测样本中的维生素D的方法，所述方法包括使所述样本与根据前述权利要求中任一项所述的分子接触以及确定所述样本中存在的维生素D的量。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，结合的holo-DBP的量是所述样本中维生素D 的量的指示。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述样本是体液。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述体液是血浆或血清。
16.一种使用根据权利要求1到11中任一项所述的分子从apo-DBP中分离holo-DBP 的方法。
17.—种试剂盒，包括根据权利要求1到11中任一项所述的分子，用于根据权利要求 12到15中任一项所述的检测维生素D的方法或根据权利要求16所述的从apo-DBP中分离 holo-DBP的方法。
全文摘要
本发明涉及一种识别holo-DBP但不识别apo-DBP或对apo-DBP具有相对较低亲合力的分子。
文档编号C07K16/44GK102333790SQ201080009231
公开日2012年1月25日 申请日期2010年3月2日 优先权日2009年3月2日
发明者戴维·普里查德, 拉尔斯·奥尔宁, 玛格丽特·劳洛尔, 穆尔多·布莱克 申请人:埃克西斯-希尔德诊断有限公司