专利名称：用辛德毕斯病毒包膜糖蛋白假型化的慢病毒载体的制作方法
技术领域：
本专利申请一般涉及靶基因递送，并且更具体地说涉及假型化慢病毒的用途，所述假型化慢病毒包含靶向树突状细胞并因此能用于树突状细胞接种的包膜。
背景技术：
树突状细胞(DC)是用于起始和控制免疫反应的基本抗原呈递细胞。DC可俘获和加工抗原，从外周器官迁移到淋巴器官，并以主要组织相容性复合体(MHC)限制性方式将抗原呈递至静止T细胞。这些细胞来源于骨髓(BM)并且显示树突状形态和高迁移率。 DC作为特化的抗原呈递细胞(APC)的发现已促进了在基于DC的免疫/接种策略方面的尝试，所述策略涉及用特异抗原体外加载DC (Banchereau和I^alucka，Α. K. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5 :296-306 ；Figdor 等 2004. Nat. Med. 10 :475-480)。然而，所有这些尝试都涉及患者特定治疗的劳动强度大的准备，所述治疗包括了用特异抗原离体加载自体DC，然后将其施用于患者。替代策略是利用基于重组病毒的载体作为将编码指定抗原的基因直接递送至宿主细胞的机理。在这种情况下，经由引入所需的适应性免疫反应，所表达的基因产物提供了治疗益处。然而，实现安全和有效的系统却面临许多挑战。这些挑战中的一些包括设计靶向所需宿主细胞组的载体、提供合适的递送系统、表达引起有效免疫反应的所需抗原以及一致地制造重组病毒载体病毒的效价足够高的药物组合物以便所述病毒可广泛用于指定的人受试者群。后者是将实验室规模系统开发为可由制药工业生产的产品的特定挑战。在实验室中，用VSV-G包膜蛋白质对许多慢病毒载体进行假型化。这被广泛地用作模型系统，因为VSV包膜蛋白质能够靶向许多细胞类型(“泛嗜性％膜)，并且产生系统一般提供高的效价。本文公开的辛德毕斯病毒和其它甲病毒的包膜糖蛋白并入病毒粒子膜的脂双层中。通常，病毒膜(包膜)包含由单个前体蛋白质的裂解产生的两种糖蛋白异源二聚体El 和E2的三聚体的多个拷贝。从其N末端至C末端，前体蛋白质包含E3、E2、6K和El蛋白质。小的E3糖蛋白充当E2蛋白质易位到膜中的信号序列，并且是通过弗林蛋白酶(furin) 或一些其它Ca2+依赖性丝氨酸蛋白酶从E2裂解。6K蛋白质充当El蛋白质易位到膜中的信号序列，并且随后从前体蛋白质裂解。El和E2糖蛋白各自具有跨膜区；E2具有约33个残基的细胞质域，而El的细胞质尾极短(约2个残基)。El和E2都在跨膜区内或附近连接有棕榈酸。本领域中描述的辛德毕斯病毒的分离物被认为是经由与硫酸乙酰肝素0B)的相互作用来感染细胞。WO 2008/011636中描述了慢病毒包装系统，其中E3/E2包膜融合蛋白 (称为SVGmu)含有许多修饰，以期经由DC-SIGN表面分子而使蛋白质与HS的结合降低，但保留与DC的结合并感染DC。在W02008/011636中，野生型SVG的cDNA是从加州理工学院的Dr. J. H. Strauss实验室的实验室获得，并通过PCR克隆到pcDNA3载体(Invitrogen)中以产生质粒PSVG。通过PCR诱变，将10个残基的标签序列插入E2蛋白质中的氨基酸71与74之间，以破坏HS结合位点。将额外的缺失引入SVG的E3糖蛋白中以去除氨基酸61-64。 将这种修饰的 SVG 称为 SVGmu (W02008/011636 的 SEQ ID NO :11)。将 SVGmu 的 cDNA 克隆到 pcDNA3 载体(称为 pSVGmu, W02008/011636 的 SEQ ID NO 3)中的 CMV 启动子下游。本发明的一些实施方案虽然SVGmu假型化病毒粒子能够选择性地转导表达DC-SIGN抗原的细胞，但是系统的若干方面都使它不适于用于治疗用途。举例来说，E3/E2融合蛋白展示流感血球凝集素的抗原表位，病毒基因组整合到宿主染色体中，这可活化有害的宿主基因，并且发明者已经发现与用VSV-G包膜假型化的粒子的效价相比，所述病毒的效价低。显著地，具有阻止E3从 E2糖蛋白的正确加工的突变(所谓的“pE2突变株”)的辛德毕斯病毒菌株(诸如SVGmu) 在受纳细胞系中生长较差并且在小鼠病原性方面严重减弱。在W02008/011636中用于假型化慢病毒载体的SVGmu E3-E2蛋白质与本发明的三种示例性E蛋白质变体的比对示于图1中。图1中标明的编号是参考辛德毕斯病毒包膜蛋白质的HR菌株。除非另外指明，否则本文使用的编号是参考辛德毕斯病毒的这种菌株。发明者已将SVGmu蛋白质修饰来提供改进的慢病毒产生系统。本发明的病毒粒子是以比使用 SVGmu的那些病毒粒子显著更高的效价来制备，并且还刺激更强的免疫反应。此外，假型化慢病毒粒子的效价提高并且感染性改善，同时保留了对DC的选择性。在一个实施方案中，本发明提供一种逆转录病毒(诸如，慢病毒)载体粒子，其包含(a)包膜，其包含SEQ ID N0:1的辛德毕斯病毒E2糖蛋白，其中160X不存在或为非酸性氨基酸，或SEQ ID NO :1的变体，其能够感染树突状细胞；其中所述E2糖蛋白或其变体未与E3融合；和(b)慢病毒基因组，其包含目标序列。变体可能能够与DC-SIGN结合。与来自HR菌株的参考蛋白相比，也优选变体与硫酸乙酰肝素的结合降低。HR菌株的E2蛋白质示为SEQ ID N0:18o优选地，160X是小氨基酸或脂肪族氨基酸中的一种，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、 亮氨酸或异亮氨酸。在一方面，160X不存在或为甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在一实施方案中，X是甘氨酸。SEQ ID NO :1的变体是定义为包含与SEQ ID NO :1具有至少80%序列同一性或至少82%、85%、87%、90%、92%、95%或98%序列同一性的序列，其中160X被保留并如上文所定义。变体可能在横跨残基50至180的区中具有赖氨酸和精氨酸中的一个或多个，其独立地缺失或由非碱性氨基酸取代。在一实施方案中，非碱性氨基酸是谷氨酸或天冬氨酸。在一方面，残基X选自缺失、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸异亮氨酸，且横跨残基50至180的区中的赖氨酸和精氨酸中的一个或多个独立地缺失或由非碱性氨基酸取代。在另一方面，X选自缺失、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，且横跨残基 50至180(优选至少包括位置159)的区中的赖氨酸和精氨酸中的一个或多个独立地缺失或由谷氨酸或天冬氨酸取代。可取代或缺失的候选带正电氨基酸包括残基63、70、76、84、97、104、129、131、133、 139、148、149和159处的赖氨酸和残基65、92、128、137、157、170和172处的精氨酸(编号
参考SEQ ID NO :1)。在取代时，取代可独立地选自谷氨酸或天冬氨酸。在特定实施方案中，赖氨酸残基70、76和159中的一个或多个缺失或被取代。在
5被取代时，取代可独立地选自谷氨酸或天冬氨酸。因为辛德毕斯病毒具有RNA基因组，所以可在上文界定的与SEQ ID NO 1的同源性百分比范围内，对SEQ ID NO :1的E2序列的部分进行除上文提及的那些变化之外的变化-包括取代、插入或缺失。举例来说，存在SEQ ID N0:1的变体，其中位置3是T或V，23 是V，209是R，264是G且393是H。可以对SEQ ID NO 1进行这些改变的一种或多种或其它变化，前提是变体保留感染DC的能力。在一实施方案中，变体在SEQ ID NO 1的介于残基70与76之间的区中不含有任何插入。在这个实施方案中，SEQ ID NO :1的残基71-75的序列可以无改变，或可包含不影响变体感染DC的能力的一个或两个取代。在某些情况下，E2蛋白质首先表达为至少与E3融合的或与前导序列融合的多聚蛋白。在某些实施方案中，E2表达为E3-E2-6K-E1多聚蛋白的部分。辛德毕斯病毒将E2天然地表达为多聚蛋白的部分，并且E3/E2、E2/6K和6K/E1的接合区具有由内肽酶识别并裂解的序列。将E3/E2多聚蛋白序列列为SEQ ID NO :20。通常，在E3/E2多聚蛋白的残基65 与66之间，由弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样丝氨酸内肽酶裂解E3/E2接合区。弗林蛋白酶对由两个氨基酸分隔的成对精氨酸残基具有特异性。为保持由弗林蛋白酶的E3/E2裂解，残基62-66(RSKRS;SEQ ID NO :26)应保持由两个氨基酸分隔的两个精氨酸残基和丝氨酸残基。在本发明的一个实施方案中，多聚蛋白包含对应于SEQ ID NO 20的残基1_65的 E3序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO :20的残基1-65具有至少80%序列同一性或至少 82%、85%、87%、90%、92%、95% 或 98% 序列同一性，其中残基 62-65 是 RSKR(SEQ ID NO: 27)并且变体能够并入假型化病毒包膜中。优选地，多聚蛋白的E2部分是如本文以上所定义的任何实施方案。或者，可使用不同的裂解序列来替换E3/E2弗林蛋白酶裂解序列或任何其它的裂解序列。可并入内肽酶的识别和裂解位点，所述内肽酶包括而不限于天冬氨酸内肽酶(例如，组织蛋白酶D、凝乳酶、HIV蛋白酶)、半胱氨酸内肽酶(菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、钙蛋白酶)、金属内肽酶(例如，胶原蛋白酶、嗜热菌蛋白酶)、丝氨酸内肽酶(例如，糜蛋白酶、 因子IXa、因子X、凝血酶、胰蛋白酶)、链激酶。已熟知这些酶的识别和裂解位点序列。在使用此类裂解位点的情况下，其可以引入到E3多聚蛋白中，所述E3多聚蛋白包含至少SEQ ID NO 20的残基1_60(诸如残基1_61或1_62)或其变体，所述变体与SEQ ID NO 20的对应数目的残基具有至少80%序列同一性或至少82%、85%、87%、90%、92%、 95%或98%序列同一性，所述E3多聚蛋白直接在C端与所述裂解序列融合，所述裂解序列又与多聚蛋白的E2部分融合。优选地，多聚蛋白的E2部分是如本文以上定义的任何实施方案。本发明的E2蛋白质序列包括SEQ ID NO 1的变体，其中160X如下表中的定义，并且蛋白质如SEQ ID N0:1中所列，以下残基70、76和159以及160除外，它们如下SEQID 70 76 159 WOX No:_____
3__E__K__E__G
4__E__E__E__G
5EHIE
6EEEzl
7__K__K__E__G
8K K E J
-----
9K E E G _10__K__E__E__Zl
11__K__E__K__G
12__K__E__K__,:1
λ OCLTMP
10CPkr\Ijr
14__E__K__K__zl
15__E__E__K__G
1 β f^* ￡** /\任选地，以上序列中每一序列可包含对SEQ ID NO 1的一个或多个其它改变，但具有尚无改变的SEQ ID NO :1的残基71-75，或可具有不影响变体感染DC的能力的一个或两个取代，但不改变这个区中的氨基酸数目。本发明的其它E2 蛋白质序列包括 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO :15，其中残基 160 是 Ala、lie、Leu 或Val而不是Gly。此类变体也可包含尚无变化的SEQ ID NO 1的残基71-75，或可具有不影响变体感染DC的能力的一个或两个取代，但不改变这个区中的氨基酸数目。任选地，以上两段中描述的SEQ ID NO :3_15的E2序列或其它变体可在其它位置变化以提供与SEQ ID NO :1具有至少80%序列同一性的E2序列。“至少80%序列同一性” 包括至少82%、85%、87%、90%、92%、95%或98%序列同一性中任一序列同一性。在以上实施方案中，对应于SEQ ID NO 20的位置66的第一个E2残基可为Ser。如上文所指，本发明的E2序列，包括前述三段中所述的SEQ ID N0:3_15中任何序列和其变体，可由包含至少E3/E2序列并优选辛德毕斯E3/E2/6K/E1多聚蛋白序列的多聚蛋白来表达。每一个实施方案中的E3多聚蛋白序列可为以上所述的SEQ ID N0:20的残基 1-65的E3多聚蛋白序列或其任何变体，包括具有非天然裂解位点的变体。
发明内容
本专利申请涉及假型化慢病毒载体，其包含具有目标序列的基因组和包含虫媒病毒的糖蛋白的包膜。虫媒病毒糖蛋白可来自辛德毕斯病毒、登革热病毒和委内瑞拉马脑炎
7病毒。具体来说，当糖蛋白是来自辛德毕斯病毒的E2蛋白质时，与SEQ ID N0:1相比，E2 蛋白质在残基160处具有至少一个氨基酸改变。氨基酸改变可为缺失或为不同于谷氨酸的氨基酸。或者，E2糖蛋白可为变体蛋白质，其与SEQ ID NO :1具有至少80%序列同一性并且也具有残基160的改变，所述改变是缺失或不同于谷氨酸的氨基酸。糖蛋白促进树突状细胞的感染。就所有情况来说，E2糖蛋白不是具有辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的部分。在一些实施方案中，E2糖蛋白或变体与DC-SIGN结合。慢病毒载体也包含慢病毒基因组，其包含所目标序列。在某些实施方案中，残基160不存在或为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在一个实施方案中，残基160是甘氨酸。此外，E2糖蛋白的其它改变可与残基160的所提及的改变组合发生。一种此类的改变是减少E2的净正电荷的氨基酸变化。减少净正电荷的一种方式是将一个赖氨酸变成非碱性的氨基酸。在特定的实施方案中，改变赖氨酸 70、赖氨酸76或赖氨酸159中的一个或多个。在某些实施方案中，将这些赖氨酸中的一个或多个变为谷氨酸或天冬氨酸。在特定实施方案中，E2糖蛋白是SEQ ID NO :3-16中的一个。改变的组合的实例包括而不限于将位置160处的谷氨酸改变为非碱性残基，和将赖氨酸70、赖氨酸76或赖氨酸159中的一个或多个改变为非碱性残基。也可以进行其它改变， 与残基160的改变和任选本文公开的其它改变中的任何改变相组合。举例来说，任何先前提及的E2糖蛋白可任选地包含一个或多个进一步取代、插入或缺失。作为一个特定的实施例，E2与E3之间的蛋白质裂解位点可为天然序列或由不同的内肽酶裂解的改变序列。在可与上述任何一个组合的其它实施方案中，SEQ ID NO :1的残基71-75的序列无变化，或可具有不影响变体感染DC的能力的一个或两个氨基酸取代。在某些实施方案中，任何上述的病毒粒子的慢病毒载体基因组包含所目标序列， 所述目标序列编码肿瘤特异性抗原或病毒衍生抗原，如HIV或SIV抗原。在一些实施方案中，任何所述的载体粒子以至少105/mL IU的效价来制备。在另一方面，提供一种用于制备假型化慢病毒载体粒子的慢病毒载体包装系统， 其包含第一核酸分子，其编码SEQ ID NO :1的辛德毕斯病毒E2糖蛋白，其中残基160不存在或为不同于谷氨酸的氨基酸，或能够感染树突状细胞的辛德毕斯病毒E2糖蛋白的变体， 所述变体与SEQ ID NO 1具有至少80%序列同一性且其中残基160不存在或为不同于谷氨酸的氨基酸；第二核酸分子，其编码gag和pol蛋白质；第三核酸分子，其编码rev ；以及慢病毒载体基因组，其包含目标序列。包装系统的E2糖蛋白或变体具有如上文任何实施方案中定义的氨基酸序列。在某些实施方案中，pol蛋白质具有非功能性整合酶。在特定实施方案中，非功能性整合酶具有D64V突变。在一些实施方案中，第二核酸分子是非整合的慢病毒基因组。在特定的实施方案中，使att部位突变或缺失或使PPT部位突变或缺失或两者兼而有之。非整合的慢病毒基因组可与非功能性整合酶组合使用和与E2蛋白质或变体的任何一者组合使用。优选所制备的慢病毒载体粒子的效价为至少105IU/mL。在一些情况下，用上述的第一核酸分子和第四核酸分子转染细胞。细胞可能已包含稳定转化的第二核酸分子和第三核酸分子。提供一种分离核酸分子，其编码如上所述的糖蛋白，或任选地呈辛德毕斯E3/ E2/6K/E1多聚蛋白形式的E3/E2糖蛋白，或其中E3序列对应于SEQ ID NO :20的残基1_65 的E3/E2糖蛋白，或其变体，所述变体与SEQ ID NO 20的残基1_65具有至少80%序列同一性，其中残基62-65是RSKR(SEQ ID NO :27)并且所述变体能够并入假型化病毒包膜中， 任选进一步地，其中E2多聚蛋白的残基1是kr。E2糖蛋白可为上述任何变体，其包括改变的组合。此外，提供一种包含核酸分子的表达载体，以及一种包含所述表达载体的宿主细胞。提供一种制备具有上述任一变体或组合的慢病毒载体粒子的方法，其包括在细胞中表达第一核酸分子，所述第一核酸分子编码SEQ ID NO :1的辛德毕斯病毒E2糖蛋白， 其中残基160不同于谷氨酸，或编码能够感染树突状细胞的辛德毕斯病毒E2糖蛋白的变体，所述变体与SEQ ID NO 1具有至少80%序列同一性且其中残基160不存在或为不同于谷氨酸的氨基酸，和；(ii)表达第二核酸分子，其中可转录所述第二核酸分子并且可将转录物装配到假型化慢病毒载体粒子中。任何慢病毒载体粒子可用于人或动物受试者的治疗方法中。治疗可为用于免疫的疫苗，其中疫苗是预防性的或治疗性的。疫苗包含慢病毒载体粒子与可药用的赋形剂。或者，慢病毒载体粒子可体外施用于细胞，包括将细胞与上述任何慢病毒载体粒子混合。参阅以下详细说明和附图后，本发明的这些方面和其它方面将显而易见。此外， 2009年7月M日提交的美国申请第61/2 ，491号的全部内容出于所有目的以引用方式并入本文。
图1是四个辛德毕斯病毒包膜(SVGmu、SIN-VarU SIN-Var2和SIN_Var3)的包膜蛋白质的序列比对。比对是相对于先前所述的辛德毕斯包膜SVGmu来显示。与SVGmu的主要不同包括在E3与E2之间的弗林蛋白酶样蛋白酶裂解位点(RSKR;SEQ ID NO :27)的再生，除去HA表位标签，以及一系列的赖氨酸取代以降低肝素结合。图2是用于包装病毒粒子中的示例性载体的示意图。图3呈现慢病毒载体粒子制剂的粗上清液效价的图，其中所述载体基因组由三种不同的辛德毕斯病毒包膜蛋白质(SVGmu和SIN-HR)假型化。病毒上清液是使用标准方法通过瞬时转染来产生，并在转染后48小时收集。在表达人DC-SIGN的细胞 (293T-DC-SIGN)上测定效价。效价表示为每毫升上清液的GFP表达单位的数目，并为三独立转染的平均值。误差线表示与平均值的标准偏差。图4Α、4Β和4C是显示施用假型化慢病毒载体粒子之后小鼠中的T细胞的免疫学反应的图。(A)用编码OVA的整合缺陷型慢病毒载体的两种剂量中的一种(以ng pM标明)对C57BL/6小鼠进行皮下免疫。在第9天，通过MHC-I/肽多聚体和细胞内细胞因子染色来测定脾脏中的0VA257特异性CD8T细胞的数目和功能。(B)用一定剂量范围的编码 OVA的整合缺陷型慢病毒载体对C57BL/6小鼠进行皮下免疫。在第11天，通过MHC-I/肽多聚体染色来测定脾脏中的0VA257特异性CD8T细胞的百分比。(C)用一定剂量范围的编码OVA的整合缺陷型慢病毒载体对C57BL/6小鼠进行皮下免疫。在第9天，通过细胞内细胞因子染色来测定脾脏中的0VA257特异性CD8T细胞的百分比。图5A呈现示例性慢病毒基因组的图。图5B呈现三种载体构建体的U3区的序列。 (A)所有慢病毒载体中含有的元件在顶部显示在示例性载体基因组内。所使用的启动子包括人泛素-C启动子⑴biC)、巨细胞病毒早期瞬时启动子(CMV)或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。除标准SIN U3区之外，显示了一系列延长的缺失。来自所有3种载体的U3区的序列比对显示在(B)中。所显示的序列包括在构建体704中缺失的多嘌呤通道(PPT)，和存在于 703和704构建体中的延伸的U3缺失。图6A和6B显示在细胞转导之后，从慢病毒载体的GFP表达。在图6Α中， GFP与W^iC启动子可操作地连接，并且在图6Β中，GFP与CMV启动子可操作地连接。在表达 DC-SIGN的细胞转导之后48小时，由整合酶缺陷慢病毒载体测定GFP表达水平。通过标准的流式细胞计数方法测定转导细胞中的GFP表达；从每一转导细胞池收集总共50，000 次事件以测定平均表达水平。图7显示5次传代期间的GFP阳性细胞的数目。用不同载体制剂来转导细胞并且每72小时传代一次。测定用不同NILV构建体转导的细胞培养物中的相对GFP效价。 使用野生型整合酶(IN+)或D64V突变整合酶(IN-)来包装载体，并将所述载体用于转导表达DC-SIGN的293细胞。然后，将转导的细胞培养物每72小时传代一次，进行15天。在每次传代时，使用标准的流式细胞计数方法来测定培养物中的GFP+细胞的数目。GFP表达随传代的损失表明载体附加体随时间的损失。图8显示施用整合型antwt)或非整合型antD64V)慢病毒载体之后的⑶8T细胞反应。用编码来自猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的Gag抗原的整合型antwt)或非整合型 (IntD64V)慢病毒载体的2. 5X1010基因组使C57BL/6对小鼠进行皮下免疫。在第10天， 通过细胞内细胞因子染色来测定脾脏中的抗原特异性T细胞的数目和它们的细胞因子分泌概况。图9呈现的图显示了单独接受媒介物或接受编码肿瘤抗原的病毒粒子的小鼠的肿瘤大小(左图)和存活百分比(右图)。对BALB/c小鼠通过皮下注射2X104fCD6 结肠癌瘤细胞。一天之后，以皮下方式，用媒介物或3.2yg(pM衣壳)编码AH1A5肽 (SPSYAYHQF ；SEQ ID NO 25)的靶向DC的非整合型慢病毒载体(DC-NILV)治疗小鼠，所述 AH1A5肽是一种经过修饰的CD6 CD8T细胞表位。描绘了接种小鼠相比对照小鼠的初始肿瘤生长和长期存活。
具体实施例方式本公开提供通过使用慢病毒载体粒子(例如，病毒粒子、慢病毒粒子)来将目标序列递送至DC而靶向树突状细胞(DC)的方法和组合物。慢病毒载体粒子包含来源于辛德毕斯病毒E2的包膜糖蛋白变体和包含目标序列的基因组，以及任选其它组分。与HR(—种参考辛德毕斯病毒菌株)相比，糖蛋白变体显示与硫酸乙酰肝素的结合降低。包膜糖蛋白促进树突状细胞被慢病毒载体粒子的感染。如本文所使用的“促进”感染与促进转导相同，并且指的是包膜糖蛋白单独或与其它分子一起在促进或增强假型化逆转录病毒或慢病毒粒子向靶细胞的受体介导的进入中所起的作用。一般来说，慢病毒载体粒子是通过含有一个或多个质粒载体和/或整合元件的细胞系来产生，所述整合元件一起编码产生功能载体粒子所必需的组分。这些慢病毒载体粒子通常不具复制能力，也就是说，它们仅能够进行单轮感染。最通常，使用稳定整合到产生者细胞染色体中的多个质粒载体或独立的表达盒来分隔产生慢病毒载体粒子的各种遗传组分，然而，可使用具有所有慢病毒组分的单个质粒载体。在一个范例中，包装细胞系是用以下质粒来转染含有病毒载体基因组的一个或多个质粒，所述病毒载体基因组包括 LTR(—种顺式作用型包装序列)和目标序列；编码病毒酶促性和结构性组分(例如gag和 pol)的至少一个质粒；和编码虫媒病毒包膜糖蛋白的至少一个质粒。病毒粒子穿过细胞膜出芽并包含通常含有两个RNA基因组的核，所述RNA基因组含有目标序列和靶向树突状细胞的虫媒病毒包膜糖蛋白。当虫媒病毒糖蛋白是辛德毕斯病毒E2糖蛋白时，将糖蛋白工程化改造以与参考菌株HR相比降低与硫酸乙酰肝素的结合。与HR E2糖蛋白序列相比，这通常涉及至少一种氨基酸变化。在不希望受理论约束的情况下，认为病毒粒子与细胞表面的结合诱导内吞作用， 使病毒进入内涵体，触发膜融合并使病毒核进入细胞溶质中。对于利用整合型慢病毒载体粒子的某些实施方案来说，在产物逆转录并迁移至核之后，病毒的基因组整合到靶细胞基因组中，从而将目标序列并入靶细胞的基因组中。然而，为减小指定抗原的插入诱变发生的机会并促进其瞬时表达，其它实施方案利用非整合型慢病毒载体粒子，其不整合到靶细胞基因组中，但取而代之从附加体来表达目标序列。无论哪种方式，受感染DC随后表达目标序列，例如抗原、刺激分子。然后，抗原可通过树突状细胞加工并呈递给T和B细胞，产生抗原特异性免疫反应。只要树突状细胞能够刺激抗原特异性免疫反应，那么就并不需要上文所述的特定途径。病毒粒子可施用于受试者以便提供预防或治疗效果。目标序列的产物通常是弓I起疾病的因子或患病细胞(例如，肿瘤细胞)的抗原。在树突状细胞的感染和产物的表达之后，产生对产物的免疫反应。免疫反应可以是体液免疫反应或细胞免疫反应或两者兼有。A.病毒载体包膜节肢动物传播病毒(虫媒病毒)是由受感染的节肢动物载体(诸如蚊子)传给宿主(诸如人、马或禽类)的病毒。虫媒病毒进一步分为包括甲病毒和黄病毒的病毒亚科，所述病毒具有阳极性的单链RNA基因组和含有糖蛋白的包膜。举例来说，登革热病毒、 黄热病毒和西尼罗河病毒(West Nile virus)属于黄病毒科，而辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)和委内瑞拉马脑炎病毒都是甲病毒科的成员(Wang等 J.Virol. 66,4992(1992)).辛德毕斯病毒的包膜包含两种跨膜糖蛋白(MuWiopadhyay等 Nature Rev. Microbio. 3,13(2005)) :E1，认为其对融合起作用；和E2，认为其对细胞结合起作用。已知辛德毕斯病毒包膜糖蛋白使其它逆转录病毒(包括致癌逆转录病毒和慢病毒)假型化。如上所述，虫媒病毒包膜糖蛋白可用于使基于慢病毒的载体基因组假型化。“假型化”慢病毒是具有由区别于慢病毒基因组的病毒编码的一种或多种包膜糖蛋白的慢病毒粒子。包膜糖蛋白可如本文所述来修饰、突变或工程化改造。辛德毕斯病毒和其它甲病毒的包膜并入病毒粒子膜的脂双层中，并通常包括两种糖蛋白El和E2的多个拷贝。各种糖蛋白都具有跨膜区；E2具有约33个残基的细胞质域， 而El的细胞质尾极短(约2个残基)。El和E2在跨膜区内或附近连接有棕榈酸。E2最初以前体蛋白质合成，所述前体蛋白质通过弗林蛋白酶或其它Ca2+依赖性丝氨酸蛋白酶来裂解成E2和称为E3的小糖蛋白。位于编码E2和El的序列之间的是编码称为6K的蛋白质的序列。E3和6K是用来将E2和El糖蛋白分别移位到膜中的信号序列。在辛德毕斯病毒基因组中，辛德毕斯包膜蛋白质的编码区包含编码E3、E2、6K和El的序列。如本文所使用，虫媒病毒的“包膜”至少包含E2，并也可包含E1、6K和E3。辛德毕斯病毒(菌株HR)的包膜糖蛋白的示例性序列呈现为SEQ ID No. 17。其它虫媒病毒的包膜糖蛋白的序列可见于 (例如)基因库中。举例来说，编码登革热病毒糖蛋白的序列可见于登录号GQ25^577(尤其在基因库中)并见于NCBI的病毒变异数据库中(基因库登录号和病毒变异数据库以引用方式并入以说明包膜糖蛋白序列)，并且编码委内瑞拉马脑炎病毒包膜糖蛋白的序列可见于登陆号NP 040824(其以引用方式并入以说明包膜糖蛋白的序列)。虽然，迄今为止还未最终鉴别出尤其是甲病毒和辛德毕斯病毒的树突状细胞上的细胞受体，但是一个受体似乎是DC-SIGN(Klimstra等，J Virol 77:12022,2003)。使用的术语“连接”、“结合”、“靶向”等可交换地使用，并且不意欲表明辛德毕斯病毒包膜糖蛋白与细胞组分之间的相互作用机理。DC-SIGN(捕获树突状细胞特异性ICAM-3(细胞内黏附分子3)的非整合蛋白；又称为CD209)是一种能够迅速结合并内吞物质的C型凝集素样受体 (Geijtenbeek，T. B.等 Annu. Rev. Immunol. 22 :33_54，2004)。E2 似乎是经由 DC-SIGN 来将病毒靶向树突状细胞。如本文所示，表达DC-SIGN的细胞是通过用辛德毕斯病毒E2假型化的病毒载体粒子来转导，这比不表达DC-SIGN的等基因细胞要好(至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍)。E2糖蛋白如何促进病毒感染的机理似乎涉及DC-SIGN，可能是经由与DC-SIGN的直接结合，或引起构型上的变化或一些其它机理。不考虑实际机理，通过E2的靶向是表达DC-SIGN的细胞(即树突状细胞)所首选的。辛德毕斯病毒似乎也经由硫酸乙酰肝素与细胞结合(Klimstra等，J Virol 72: 7357,1998 ;Burmes 和 Griffin，J Virol 72:7349,1998)。因为硫酸乙酰肝素和其它细胞表面粘多糖见于大多数细胞类型的表面上，所以希望减小硫酸乙酰肝素与辛德毕斯包膜糖蛋白之间的相互作用。这可通过减少辛德毕斯病毒包膜与硫酸乙酰肝素的结合或增加辛德毕斯病毒包膜与树突状细胞的结合(例如，增加亲合力)或两者兼有来实现。因此，降低了与其它分子的非特异性结合，所述其它分子可通过其它细胞类型表达并即使在包膜对 DC-SIGN特异的情况下也可能出现，并且所改善的特异性可用以避免不希望的副作用，诸如可能降低所需免疫反应的副作用或与其它细胞类型的脱靶转导相关的副作用。或者或除表达DC-SIGN的细胞的相对特异的转导的优点之外，用辛德毕斯病毒包膜E2糖蛋白假型化的病毒粒子可能提供优于由糖蛋白(诸如VSVG)假型化的病毒粒子的其它优点。此等优点的实例包括降低的补体介导的溶解和/或降低的神经元细胞靶向，认为这两者都是与VSV-G 假型化病毒粒子的施用相关。在各种范例中，慢病毒载体粒子特异地与表达DC-SIGN的细胞结合并与硫酸乙酰肝素的结合降低或消除。也就是说，相对于其它细胞类型，辛德毕斯病毒包膜E2糖蛋白可被修饰以将病毒优先引导至表达DC-SIGN的树突状细胞。基于从结构研究和其它研究中的分子建模获得的信息，设计和产生了包膜蛋白质(尤其是E2和El糖蛋白)的变体序列以使得糖蛋白保持它们作为包膜蛋白质的功能，但具有所需的结合特异性、亲合力或结合水平。可产生各种糖蛋白的候选变体序列并且使用以下所述的方法或本领域中已知的其它方法来测定，以鉴别出具有最合乎需要的特征的包膜糖蛋白。辛德毕斯E2的某些变体序列与SEQ ID NO 1相比在残基160处具有至少一个氨基酸改变。残基160缺失或变为不同于谷氨酸的氨基酸。改变最通常是至少一个氨基酸的取代，但或者可为一个或多个氨基酸的添加或缺失。优选地，任何额外的氨基酸的数目很少并且不包括可能损害安全性的抗原表位(例如，血球凝集素标签序列)。当存在两个或两个以上的改变时，它们可为相同类型(例如，取代)或不同类型(例如，取代和缺失)。多个改变可散布或连续定位在蛋白质序列中。在第一种情况下，变体序列包含在约残基50至约残基180的区内的至少一个氨基酸改变。这个区域内的氨基酸涉及与硫酸乙酰肝素的结合。通过减少E2的净正电荷，可减少与硫酸乙酰肝素的静电相互作用，从而导致与硫酸乙酰肝素结合的降低。这个区内的候选带正电氨基酸包括在残基63、70、76、84、97、104、129、131、133、139、148、149、159 处的赖氨酸和在残基 65、92、128、137、157、170、172 处的精氨酸(Bear 等，Virology 347 =183-190, 2006)。这些氨基酸中的至少若干直接参与E2与硫酸乙酰肝素的结合。净正电荷可通过缺失赖氨酸或精氨酸或用中性或带负电荷的氨基酸取代赖氨酸或精氨酸来减少。举例来说， 这些赖氨酸和精氨酸中的一个或多个可由谷氨酸或天冬氨酸来置换。某些实施方案具有对赖氨酸70、76或159中的至少一个取代。在E2表达为具有E3的多聚蛋白的情况下，与天然E3/E2裂解位点定位邻近的赖氨酸被保留-也就是说，识别序列和裂解位点并未改变。或者，天然内肽酶裂解位点序列由不同内肽酶的识别序列所置换。E2的某些变体也是以积极影响与树突状细胞结合的方式来被修饰。在参考HR中的残基160处所见的谷氨酸改变可提高与树突状细胞的结合(参见，Gardner等，J Virol 74，11849，2000，将其全部内容并入)。在某些变体中，发现诸如缺失残基160或取代残基 160的改变。在特定变体中，不带电荷的氨基酸由Glu取代，在其它变体中，非酸性氨基酸由 Glu取代。通常，G1U160由小氨基酸或脂肪族氨基酸中的一个置换，所述小氨基酸或脂肪族氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。其它变体包含两个或两个以上的氨基酸改变。通常在这些变体中，改变之一是 Glul60，而其余改变是横跨残基约50至约180的区内的一个或多个赖氨酸和精氨酸的变化。某些变体包含G1U160到非酸性残基的改变或缺失，以及赖氨酸70、赖氨酸76或赖氨酸159由非碱性氨基酸的一个或多个改变。一些特定的变体包含Glul60到Gly、Lys 70到 Glu 和 Lys 159 到 Glu;Glu 160 到 Gly、Lys 70、76 和 159 到 Glu ;Glu 160 的缺失和 Lys 70 禾口 159到Glu ；以及Glu 160的缺失和Lys 70,76和159到Glu。在某些情况下，E2蛋白质首先表达为至少与E3融合的或与前导序列融合的多聚蛋白。不考虑前导序列是否是E3还是另一序列，病毒包膜中的E2应不具有E3或其它前导序列。换句话说，E2优选不是E3/E2融合蛋白(例如，称为SVGmu的E3/E2融合蛋白)。在某些实施方案中，E2表达为E3-E2-6K-E1多聚蛋白的部分。辛德毕斯病毒将E2天然地表达为多聚蛋白的部分，并且E3/E2、E2/6K和6K/E1的接合区具有由内肽酶识别并裂解的序列。通常，E3/E2接合区在残基65与66之间由弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样丝氨酸内肽酶裂解。弗林蛋白酶对由两个氨基酸分隔的成对精氨酸残基具有特异性。为保持由弗林蛋白酶的E3/E2裂解，残基62-66 (RSKRS ；SEQ ID NO 26)应保持由两个氨基酸分隔的两个精氨酸残基和丝氨酸残基。或者，可使用不同的裂解序列来替换E3/E2弗林蛋白酶裂解序列或任何其它的裂解序列。可并入内肽酶的识别和裂解位点，所述内肽酶包括但不限于天冬氨酸内肽酶(例如，组织蛋白酶D、凝乳酶、HIV蛋白酶)、半胱氨酸内肽酶(菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、钙蛋白酶)、金属内肽酶(例如，胶原蛋白酶、嗜热菌蛋白酶)、丝氨酸内肽酶(例如，
13糜蛋白酶、因子IXa、因子X、凝血酶、胰蛋白酶)、链激酶。已熟知这些酶的识别和裂解位点序列。也可改变不同于已经提及的那些氨基酸的E2中的氨基酸。通常，变体E2序列将与参考E2序列具有至少80%序列氨基酸同一性，或它可具有至少82%、至少85%、至少 87%、至少90%、至少92%、至少95%或至少98%序列同一性。变体糖蛋白应显示生物功能，诸如通过具有包含E2的包膜的病毒粒子促进感染树突状细胞的能力。实验已经鉴别出似乎在病毒装配、连接至细胞表面和感染的各种方面中起重要作用的包膜糖蛋白的区。 在制备变体时，以下信息可用作指导原则。E2的细胞质尾-大约残基408至415-对病毒装配来说是重要的(West等J Virol 80 :4458_4468，2006 ；将其全部内容并入)。其它区参与形成二级结构(大约残基33-53)；和参与转运和蛋白质稳定性(大约残基86-119) (Navaratmarajah等，J Virol 363 1M-147，2007 ；将其全部内容并入)。变体可保留横跨膜的大约残基370-380的区的疏水特性。变体可保留N连接糖基化位点残基OTT (残基196-198)和NFT(残基318-320)之一或两者，并可保留棕榈酰基化的一个或多个位点 (C-396、C416 和 C417) (Strauss and Strauss Microbiol Rev 58，491-562，1994 ；将第 499-509页并入)。另一方面，可改变E2的许多区而不出现有害事件。举例来说，在E2中的许多不同部位处插入转座子仍产生有活力的病毒(Navaratmarajahjni )。在某些实施方案中，标签肽可并入E3、6K或El蛋白质中。为达一些目的，标签可并入E2中，但标签对用于施用于人患者的产品来说并不是理想的。为短序列(例如，5-30个氨基酸)的标签肽可用于促进对包膜表达和其在病毒粒子中的存在的检测。为达到检测目的，标签序列通常通过抗体或化学品将是可测的。标签的另一用途是促进病毒粒子的纯化。 含有标签的结合配偶体的底物可用于吸附病毒。病毒的洗脱可通过以下实现用将标签从结合配偶体置换的部分处理，或当标签序列与裂解序列形成键合时，用适当内肽酶的处理将便利地允许病毒的释放。(参见，例如Qiagen catalog, Factor Xa Protease System)。 标签肽的除去通常是达到病毒粒子在动物受试者中使用的安全性目的所需要的。如果标签没有去除，那么可能发生对标签的免疫反应。合适的标签尤其包括但不限于FLAG (DYKDDDDK)(美国专利第4，703，004号， 将其全部内容并入)(它的抗体可商购)，几丁质结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、多聚组氨酸(美国专利第4，569，794号，将其全部内容并入)、硫氧还蛋白 (thioredoxiinhHA(血球凝集素)-标签。多聚组氨酸可被吸附到含有结合金属离子(例如，镍或钴)的亲和介质上，并且可用低PH介质来洗脱。可评估病毒粒子以确定并入靶向树突状细胞的病毒中的包膜糖蛋白的特异性。举例来说，混合骨髓细胞群可从受试者获得并且在体外培养。或者，可获得和使用表达或不表达DC-SIGN的等基因细胞系。重组病毒可施用于混合骨髓细胞群或等基因细胞系，并且可测定培养细胞中的并入病毒中的报告基因的表达。某些实施方案可使用有限稀释分析，其中将混合细胞群分成独立的部分，然后与递减量的病毒(例如，各部分用2倍、5倍、10倍较少的病毒)来独立地孵育。在一些实施方案中，混合细胞群中至少约50%，更优选至少约 60 %、70 %、80 %或90 %，更加优选至少约95 %的受感染细胞是表达DC-SIGN的树突状细胞。在某些实施方案中，受感染树突状细胞与受感染非树突状细胞(或非表达DC-SIGN的细胞)的比率是至少约2 1、至少约3 1、至少约4 1、至少约5 1、至少约6 1、
14至少约7 1、至少约8 1、至少约9 1、至少约10 1、至少约20 1、至少约30 1、 至少约40 1、至少约50 1、至少约100 1、至少约200 1、至少约500 1、至少约 1000 1、至少约5000 1、至少约10，000 1或更大。对有限稀释来说，通常以较高稀释
度(即，降低量)的输入病毒可见较大的选择性。假型化病毒粒子的活性可通过多种技术中的任何技术来测定。举例来说，测量感染效率(IU，感染单位)的优选方法是通过对细胞施用病毒粒子并测量编码于载体基因组中的产物的表达。可使用可测定的任何产物。一种方便的产物类型是荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)。实施例(诸如实施例3)中例证了 GFP和测定。可使用的其它产物包括表达于细胞表面上的蛋白质(例如，通过抗体结合来检测)、酶等。如果产物是抗原并且细胞是树突状细胞，那么可通过测定免疫反应来评估感染性/活性。此外，可能确定在哺乳动物中的副作用。如以下所述，也可直接(例如)在细胞培养物中测试特异地靶向树突状细胞的能力。也可制备病毒粒子并测试它们的选择性和/或它们促进靶细胞膜的穿透的能力。 具有带未修饰糖蛋白的包膜的病毒粒子可用作对照来进行比较。简单地说，使用标准感染试验，通过病毒来感染表达包膜糖蛋白的受体的细胞。规定的时间之后，例如感染后48小时，可收集细胞并可通过(例如)流式细胞术来测定由病毒感染的细胞的百分比。可通过计算由病毒感染的细胞的百分比来对选择性进行评分。类似地，可通过将由包含变体包膜的病毒感染的细胞的百分比除以由包含对应野生型(未修饰)包膜糖蛋白的病毒感染的细胞的百分比来量化变体包膜糖蛋白对病毒效价的作用。尤其合适的变体将具有选择性和感染效价的最佳组合。一旦选定变体，就可进行病毒浓度试验来确认这些病毒可被浓缩而不损害活性。通过超离心法来收集和浓缩病毒上清液。病毒效价可通过以下测定病毒储备溶液的有限稀释和表达包膜糖蛋白的受体的细胞的感染，并测量由如上所述的病毒表达的产物的表达。慢病毒载体粒子进入靶细胞中是另一类型的活性评估。BlaM-Vpr(β -内酰胺酶Vpr)融合蛋白已用于评估HIV-I病毒穿透；BlaM和辛德毕斯病毒包膜糖蛋白的融合物 (诸如El或Ε2/Ε1融合蛋白)可用于评估包膜蛋白质在促进融合和穿透到靶细胞中的效力。病毒粒子可(例如)通过用一个或多个包含病毒元件、BlaM-Vpr和目标变体包膜(和任选的亲和力分子)的载体瞬时转染包装细胞来制备。所得病毒可用于感染表达其中靶分子(或亲和力分子)在游离的结合抑制剂(诸如抗体)不存在或存在的情况下会特异结合的分子的细胞。然后，可用C02非依赖性培养基来洗涤细胞并上样CCF2染料(Aurora Bioscience)。在室温下孵育以使裂解反应完成之后，可通过多聚甲醛将细胞固定并通过流式细胞术和显微术来分析细胞。蓝色细胞的存在表明病毒穿透到了细胞质中；当添加阻断抗体时，将预计蓝色细胞较少(Cavrois等Nat Biotechnol 20 :1151-1154,2002 ；将其全部内容并入)。为研究穿透是否取决于低的pH值并鉴别具有所需pH值依赖性的包膜糖蛋白，可在感染步骤添加改变PH值的NH4C1或其它化合物(NH4C1会中和内涵体的酸性隔腔)。在 NH4C1的情况下，蓝色细胞的消失将表明病毒的穿透是低pH值依赖性的。此外，为确认活性是PH值依赖性的，可将趋溶酶体剂添加到孵育缓冲液中，所述趋溶酶体剂诸如氯化铵、 氯喹、刀豆素(concanamycin)、巴弗洛霉素招(bafi Iomycin Al)、莫能菌素(monensin)、尼日利亚菌素(nigericin)等。这些药剂提高内涵体隔腔内的pH值(例如，Drose and Altendorf，J. Exp. Biol. 200，1-8,1997)。这些药剂的抑制作用将揭示pH值对病毒融合和进入的作用。可比较展示不同融合基因分子的病毒间的不同进入动力学，并且对特定应用选择最合适的病毒。基于PCR的进入试验可用于监测逆转录并测量作为病毒进入动力学迹象的病毒 DNA合成的动力学。例如，将包含特定包膜蛋白质分子的病毒粒子与靶细胞，诸如细胞、DC或已工程化改造来表达或天然地表达包膜蛋白质分子的适当结合配偶体(受体)的任何其它细胞一起孵育。立即或一段时间量之后(使感染发生)去除未结合的病毒并分析细胞的等分试样的病毒核酸。从这些等分试样中提取DNA并进行扩增分析，所述扩增分析通常在半定量测定中以LTR特异性引物来引发。LTR特异DNA产物的出现表明病毒进入的成功。B.慢病毒载体基因组病毒载体粒子包含含有目标序列的基因组。其它序列可包括(诸如)允许使基因组包装到病毒粒子中的序列和促进目标序列在靶细胞的转导后表达的序列。基因组可来源于很多合适、可用的基于慢病毒基因组的载体中的任何载体，包括已鉴别用于人基因疗法应用的那些载体，诸如由Pfeifer和Verma描述(Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2 177-211,2001 ；其全部内容以引用方式并入本文)的那些载体。为简化起见，基因组也称为 “病毒载体基因组”或“载体基因组”。1.骨架合适的慢病毒载体基因组包括基于以下病毒的那些基因组人免疫缺陷病毒 (HIV-I)、HIV-2、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和梅迪/维斯那病毒(maedi/visna virus) 0慢病毒的理想特征在于它们能够感染分裂细胞和非分裂细胞，靶细胞不必为分裂的(或不必刺激靶细胞分裂)。通常，基因组和包膜糖蛋白将基于不同的病毒以使得所得病毒载体粒子是假型化的。载体基因组的安全性特征得以理想地并入。安全性特征包括自灭活LTR和非整合型基因组。示例性载体在实施例5和图5 中进一步论述，并且此类载体可用于本发明的实施方案中以便表达目标抗原。在某些示例性实施方案中，病毒载体基因组包含来自慢病毒基因组(诸如HIV-I 基因组或SIV基因组)的序列。病毒基因组构建体可包含来自慢病毒的5'和3' LTR的序列，并且具体来说，可包含来自慢病毒的5' LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的灭活的或自灭活3' LTR0 LTR序列可为来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。举例来说，它们可为来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。载体基因组可包含灭活或自灭活3' LTRGufferey等J Virol 72 :9873，1998 ； Miyoshi等，J Virol 72 :8150，1998 ；将两者的全部内容都并入)。自灭活载体通常具有增强子和启动子序列从3'长末端重复序列(LTR)的缺失，所述3'长末端重复序列在载体整合期间被复制进入5' LTR中。在一种情况下，3' LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA 盒、Spl和NF-κ B位点的缺失。作为自灭活3' LTR的结果，在进入和逆转录之后产生的原病毒将包含灭活的5' LTR0基本原理是通过降低载体基因组的活动风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。自灭活3' LTR可通过本领域中已知的任何方法来构建。任选地，来自慢病毒5' LTR的U3序列可用病毒构建体中的启动子序列(诸如异源启动子序列)来置换。这样可增加从包装细胞系回收的病毒的效价。也可包括增强子序列。可使用增加包装细胞系中的病毒RNA基因组的表达的任何增强子/启动子组合。在一个实施例中，使用CMV增强子/启动子序列(US5385839和US 5168062，将每一专利的全部内容并入)。在某些实施方案中，通过构建整合缺陷的慢病毒载体基因组来使插入诱变发生的风险最小化。可寻求各种方法来产生非整合型载体基因组。这些方法需要将突变工程化改造为pol基因的整合酶组分，以使得其编码具有灭活整合酶的蛋白质。可通过(例如)突变或缺失连接位点之一或两者，或经由缺失或修饰使3' LTR近端多嘌呤通道(PPT)不具功能性来修饰载体基因组本身以防止整合。此外，非基因方法是可用的；这些方法包括抑制整合酶的一种或多种功能的药剂。所述的方法并不互相排斥，也就是说，每次可使用这些方法中的不止一种。举例来说，整合酶和连接位点两者都可为非功能性的、或整合酶和PPT位点可为非功能性的、或连接位点和PPT位点可为非功能性的或它们全部可为非功能的。如上所述，一种方法是制备和使用非功能性整合酶。整合酶参与病毒双链平末端DNA的裂解和所述末端与染色体靶位点的两条链中5'磷酸的接合。整合酶具有三个功能域:N端域，其含有锌结合基序(HHCC)；中心域核，其含有催化核和保守DD35E基序 (HIV-1中的D64、D116、E152)；和C末端域，其具有DNA结合性质。引入整合酶中的点突变足以破坏正常功能。已构建并表征了许多整合酶突变(参见，Philpott和Thrasher， Human Gene Therapy 18 :483,2007 ；Apolonia,Thesis submitted to University College London, 2009 年 4 月，第 82-97 页；Engelman 等 J Virol 69 :2729,1995 ；Nightingale 等 Mol Therapy，13 :1121，2006 ；将所有这些参考文献的全部内容并入)。可缺失或突变编码整合酶蛋白质的序列以使蛋白质失活，优选不会使逆转录酶活性或核靶向受损，从而仅防止原病毒整合到靶细胞基因组中。可接受的突变可降低整合酶催化功能，链转移功能、与 att位点的结合、与宿主染色体DNA的结合和其它功能。举例来说，HIV或SIV整合酶的残基35处的单个天冬氨酸至天门冬酰胺的取代完全消除了病毒DNA整合。整合酶的缺失将通常限于C端域。残基235488的编码序列的缺失产生有用的非功能性整合酶(Engelman等 J Virol 69 :2729,1995) ο作为另外的实施例，可产生突变，例如Asp64 (对HIV-I进行残基编号，来自其它慢病毒或逆转录病毒的整合酶的对应残基编号可由一般技术人员容易地确定)(例如，D64E、D64V)、Aspll6 (例如，D116N)、Asnl20 (例如，m20K)、Glul52、Glnl48 (例如，Q148A)、Lysl56、Lysl59、Trp235 (例如，W235E)、Lys264 (例如，K264R)、Lys266 (例如， K266R)、Lys273(例如，K273R)。可构建其它突变并测试其整合、转基因表达和任何其它所需的参数。这些功能的测定是熟知的。可通过多种技术中的任何技术来产生突变，所述技术包括核酸序列的定点诱变和化学合成。可进行一种突变，或整合酶中可存在这些突变中的不止一种。举例来说，整合酶可在两个氨基酸、三个氨基酸、四个氨基酸等处具有突变。或者或与整合酶突变体的使用组合，也可突变U3和U5中的连接位点(att)。整合酶与这些位点结合，并且3'端二核苷酸在载体基因组的两个末端裂解。CA 二核苷酸位于3'凹端；CA是加工必需的，核苷酸的突变阻断了向宿主染色体的整合。CA 二核苷酸的 A是用于整合的最临界核苷酸，并且基因组的两个末端处的突变将得到最佳结果(Brown等 J Virol 73:9011(1999))。在一个范例中，将各末端处的CA变为TG。在其它范例中，将各末端处的CA在一末端处变为TG而在另一末端处变为GT。在其它范例中，将各末端处的CA缺失；在其它范例中，将各末端处的CA的A缺失。整合也可通过突变或缺失定位于3' LTR近端的多嘌呤通道(PPT)来抑制(TO 2009/076524 ；将其全部内容并入)。PPT是具有约15个核苷酸的多嘌呤序列，其可用作用于正链DNA合成的引物结合位点。在这种情况下，PPT的突变或缺失靶向逆转录过程。在不希望限于突变或缺失PPT的某一机理的情况下，主要是减少了直链DNA的产生并且基本上仅产生I-LTR DNA环。整合需要直链的双链DNA载体基因组，并且基本上消除了没有直链双链DNA载体基因组的整合。如上所述，可通过突变或通过缺失而使PPT为非功能性的。通常，缺失整个约15nt的PPT，但是在一些实施方案中，可进行14nt、13nt、12nt、llnt、 10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3nt和2nt的较短缺失。当进行突变时，虽然前四个碱基中的单次和双重突变仍降低转录，但是通常进行多种突变，特别是在PPT的5' —半中进行 (McWilliams等，J Virol 77 :11150，2003)。在PPT的3'末端处进行的突变通常具有更显著的效果(Powell and Levin J Virol 70 :5288,1996) 这些使载体基因组非整合的不同方法可单独使用或以组合来使用。使用一种以上的方法可用以经由冗余机理建构可靠载体(fail-safe vector) 0因此，PPT突变或缺失可与att位点突变或缺失组合或与整合酶突变组合，或PPT突变或缺失可与att位点突变或缺失和整合酶突变两者组合。类似地，att位点突变或缺失和整合酶突变可彼此组合与PPT 突变或缺失组合。2.调控元件如本文所论述，病毒载体基因组包含希望在靶细胞中表达的目标序列。通常，目标序列位于5' LTR与3' LTR序列之间。另外，目标序列优选与其它遗传元件(例如，包括启动子或增强子的转录调控序列)成功能关系以便以特定方式来调控目标序列的表达。在某些情况下，有用的转录调控序列是就活性而言在时间和空间上受高度调控的那些调控序列。可用于调控组分的表达的表达控制元件是本领域中已知的并且包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号序列、增强子和其它调控元件。目标序列和任何其它可表达序列通常与内部启动子/增强子调控序列成功能关系。“内部”启动子/增强子是定位在病毒载体构建体的5' LTR序列与3' LTR序列之间并且与目标序列可操作地连接的启动子/增强子。内部启动子/增强子可为已知增加与其成功能关系的基因的表达的任何启动子、增强子或启动子/增强子组合。“功能关系”和“可操作地连接的”意指但不限于序列处在相对于启动子和/或增强子的在启动子和/或增强子与适当分子接触时目标序列得以表达的正确位置和定位中。内部启动子/增强子的选择基于目标序列的所需表达模式和已知启动子/增强子的特定性质。因此，内部启动子可为组成性活性的。可使用的组成型启动子的非限定性实例包括以下物质的启动子泛素(US 5510474 ；WO 98/32869，每个专利的全部内容以引用方式并入本文)、CMV(Thomsen等，PNAS 81 =659,1984 ；US 5168062，每个参考文献的全部内容以引用方式并入本文)、β-肌动蛋白(Gunning等1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4831-4835，其全部内容以引用方式并入本文)和pgk(参见，例如Adra等1987 Gene 60: 65-74 ；Singer-Sam 等 1984 Gene 32 :409-417 ；和 Dobson 等 1982 Nucleic Acids Res. 10 沈35-2637，前述每个参考文献的全部内容以引用方式并入本文)。或者，启动子可以是组织特异性启动子。在一些优选实施方案中，启动子是靶细胞特异性启动子。举例来说，启动子可来自由树突状细胞表达的任何产物，包括CDllc、CD103、 TLR、DC-SIGN、BDCA-3、DEC-205、DCIR2、甘露糖受体、Dectin-l、Clec9A、MHC 类别 II。此外， 可选择启动子以允许目标序列的诱导型表达。用于诱导型表达的许多系统是本领域中已知的，包括四环素反应系统、Iac操纵子-抑制子系统以及对多种环境或生理变化起反应的启动子，所述环境或生理变化包括热休克、金属离子(诸如，金属硫蛋白启动子)、干扰素、低氧、类固醇(诸如黄体酮或糖皮质激素受体启动子)、辐射(诸如VEGF启动子)。也可使用启动子的组合来获得目标基因的所需表达。本领域的一般技术人员将能够基于目标有机体或靶细胞中的所需的基因表达模式来选择启动子。病毒基因组可包含至少一个RNA聚合酶II或III反应性启动子。这种启动子可与目标序列可操作地连接并且也可与终止序列连接。此外，可并入一个以上的RNA聚合酶 II或III启动子。RNA聚合酶II和III启动子是本领域技术人员所熟知的。RNA聚合酶 III启动子的合适范围可(例如)见于Paule和White，Nucleic Acids Research.，第28 卷，第U83-1298页O000)中，此参考文献的全部内容以引用方式并入本文。RNA聚合酶 II或III启动子也包括可引导RNA聚合酶II或III转录下游RNA编码序列的任何合成或工程化改造的DNA片段。另外，用作病毒载体基因组的部分的RNA聚合酶II或III (Pol II 或III)启动子可为诱导型的。任何合适的诱导型Pol II或III启动子可与本发明的方法一起使用。尤其合适的Pol II或III启动子包括提供于Ohkawa和Taira，Human Gene Therapy，第 11 卷，第 577-585 页(2000)和 Meissner 等 Nucleic AcidsResearch，第四卷， 第1672-1682页Q001)中的四环素反应性启动子，每个参考文献的全部内容以引用方式并入本文。内部增强子也可存在于病毒构建体中以便增强目标基因的表达。举例来说，可使用CMV增强子(Boshart等Cell，41 :521，1985 ；其全部内容以引用方式并入本文)。已鉴别并表征了病毒基因组(诸如HIV、CMV)和哺乳动物基因组中的许多增强子(参见基因库)。 增强子可与异源启动子组合使用。本领域的一般技术人员能够基于所需的表达模式来选择适当的增强子。病毒载体基因组将通常含有由靶细胞识别并与本文论述的目标序列、病毒组分和其它序列可操作地连接的启动子。启动子是由核酸序列形成的允许RNA聚合酶的结合和转录发生的表达控制元件。启动子可为诱导型、组成型、时间活性或组织特异性的。诱导型启动子的活性是由生物或非生物因子的存在或缺失来诱导。诱导型启动子可为基因工程中的有用工具，因为它们可操作地连接的基因的表达可在有机体的特定发育阶段、在其制造时或在特定组织中被启动或停止。诱导型启动子可分为化学调控启动子和物理调控启动子。典型的化学调控启动子包括但不限于醇调控启动子(例如，醇脱氢酶I(alcA)基因启动子)、四环素调控启动子(例如，四环素反应性启动子)、类固醇调控启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体(GR)的启动子、基于人雌激素受体(ER)的启动子、基于蛾蜕皮激素受体的启动子和基于类固醇/视黄醇/甲状腺受体超家族的启动子)、金属调控启动子(例如， 基于金属硫蛋白基因的启动子)，以及病原相关启动子(例如，基于拟南芥(Arabidopsis) 和玉米病原体相关(PR)的蛋白质的启动子)。典型的物理调控启动子包括但不限于温度调控启动子(例如，热休克启动子)和光调控启动子(例如，大豆SSU启动子)。其它示例性启动子在别处描述于(例如)2009年5月18日访问的Intent Lens网址上的〃 Promotersused to regulate gene expression" on Patent Lens web site (其全部内容以弓|用方式并入本文)。本领域中的技术人员能够基于特定的环境来选择适当的启动子。本领域中熟知许多不同的启动子，以及用于将启动子与要表达的基因可操作地连接的方法。天然启动子序列和许多异源启动子两者都可用于指导在包装细胞和靶细胞中的表达。然而，优选异源启动子，因为与天然启动子相比，它们通常允许所需蛋白质的更大转录和更高产率。启动子可(例如)从病毒基因组中获得，所述病毒诸如多瘤病毒、禽豆病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒 40(SV40)。启动子也可为(例如)异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、热休克启动子，或通常与天然序列相关的启动子，前提是此类启动子可与靶细胞相容。在一实施方案中，启动子是病毒表达系统中的天然存在的病毒启动子。在某些实施方案中，启动子是树突状细胞特异性启动子。树突状细胞特异性启动子启动子可为(例如) CDllc启动子。转录可通过将增强子序列插入载体中来增强。增强子通常是DNA的顺式作用元件，长度通常是约10至300个bp，并作用于启动子以增强其转录。现在已知许多来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)和来自真核细胞病毒的增强子序列。实例包括复制起点(bp 100-270)的后侧上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的后侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可在抗原特异性多核苷酸序列的5'或3'位剪接到载体中，但优选位于启动子的5'部位。表达载体也可含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这些序列常常见于真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶而3'未翻译区中，并且在本领域中是熟知的。病毒载体基因组也可含有额外的遗传元件。可包括在构建体中的元件类型不受任何方式限制并且可选择来达到特定结果。举例来说，可包括促进靶细胞中的病毒基因组的核进入的信号序列。此信号序列的一个实例是HIV-Iflap信号序列。另外，可包括促进靶细胞中的原病毒整合位点的表征的元件。举例来说，tRNA琥珀抑制基因序列可包括在构建体中。来自(例如)鸡β-球蛋白的绝缘子序列也可包括在病毒基因组构建体中。这种元件减小由于甲基化和异染色质化作用而使靶细胞中的整合型原病毒沉默的机会。此外，绝缘子可防护内部增强子、启动子和外源性基因避免来自染色体上的整合位点处的环绕DNA的正面或负面位置影响。此外，载体基因组可含有设计来增强目标基因的表达的一个或多个遗传元件。举例来说，旱獭肝炎病毒反应性元件(WRE)可置入构建体中(^ifTerey等1999. J. Virol. 74 :3668-3681 ；Deglon 等 2000. Hum. Gene Ther. 11 179-190，每个参考文献的全部内容以引用方式并入本文)。病毒载体基因组通常是以可转染到包装或产生者细胞系的质粒形式来构建。质粒通常包含用于在细菌中复制质粒的序列。此类质粒在本领域中是熟知的。此外，包含原核复制起点的载体也可包含表达可赋予可检测或可选择标记(诸如药物抗性)的基因。典型的细菌药物抗性产物是赋予氨苄青霉素或四环素抗性的那些产物。含有一个或多个本文所述的组分的质粒容易使用本领域中熟知的标准技术来构建。为进行确认所构建质粒中的正确序列的分析，可在大肠杆菌(E.coli)中复制质粒、将其纯化并通过限制性内切核酸酶消化来分析或通过常规方法来测定其DNA序列。
也可使用构建用于在哺乳动物细胞中瞬时表达的载体。瞬时表达涉及表达载体的使用，所述表达载体能够在宿主细胞中有效复制，以使得宿主细胞累积表达载体的许多拷贝并接着合成高水平的由表达载体中的抗原特异多核苷酸编码的多肽。参见，Sambrook等， 同上，第16. 17-16. 22页。适用于适应多肽表达的其它载体和方法是本领域中熟知的，并且容易适应特定的环境。使用本文提供的教导内容，本领域中的技术人员将认识到，特定表达系统的效力可通过用包含编码报告蛋白的基因的载体转染包装细胞，并使用合适的技术(例如，测量绿色荧光蛋白偶联物中的荧光)测量表达来进行测试。合适的报告基因在本领域中是熟知的。3.目标序列的类型目标序列不受任何方式限制并且包括一般技术人员希望在靶细胞中整合、转录和表达的任何核酸。产物可为蛋白质或核酸。目标序列可编码蛋白质或核酸分子，包括siRNA、 微小RNA、互补区长度大于约20个核糖核苷酸的自补双链RNA或与信使RNA互补的RNA，其中所述互补(反义)RNA与信使RNA的结合阻断其被翻译为蛋白质的能力。在某些情况下， 目标序列可编码需要针对其的免疫反应的抗原。具体来说，来自疾病(诸如HIV、HSV、HCV、 HPV、疟疾或结核病)的肿瘤抗原和感染性疾病抗原是理想的。在某些情况下，目标序列可为编码下调分子表达的目标小抑制RNA(SiRNA)或微小RNA(miRNA)的基因。举例来说，编码siRNA或微小RNA的基因可用于下调细胞中的负调节子表达，所述负调节子包括抑制树突状细胞的活化或成熟的那些。siRNA和微小RNA 在本领域中是熟知的(Fire 等，Nature 391 :806，1998 ；也参见〃 The RNA Interference Resource“ of Applied Biosystems, Trang 等，Oncogene Suppl 2 :S52,2008 ；Taganov, K.等 2007. Immunity 26 :133-137 ；Dahlberg, J. Ε.和 Ε. Lund. 2007. Sci. STKE 387 :pe25 ； Tiemann and Rossi, EMBO Mol Med 1 :142,2009)。或者，目标序列可编码互补区长度大于约20个核糖核苷酸的自补双链RNA或长度大于约20个核糖核苷酸的反义RNA。本领域普通技术人员应了解，siRNA、mi RNA, dsRNA和反义RNA分子可由RNA聚合酶III启动子来表达，或可为由RNA聚合酶II启动子转录的非编码RNA的组分。此外，目标序列可编码一种以上的产物。在一些构型中，要递送的序列可包含编码至少一种蛋白质、至少一种siRNA、至少一种微小RNA、至少一种dsRNA或至少一种反义RNA 分子或其任何组合的多个基因。举例来说，要递送的序列可包括编码一个或多个需要针对其的免疫反应的抗原的一个或多个基因。一个或多个抗原可与单一疾病或病症相关，或它们可与多种疾病和/或病症相关。在一些情况下，编码免疫调控蛋白的基因可连同编码需要针对其的免疫反应的抗原一起被包括，并且这样的组合可引起免疫反应并将免疫反应调控到所要的方向和幅度上。在其它情况下，编码siRNA、微小RNA、dsRNA或反义RNA分子的序列可用编码需要针对其的免疫反应的抗原的基因来构建，并且这样的组合可调控免疫反应的范围。产物可作为初始融合产物来产生，融合产物中的编码序列与一个启动子成功能关系。或者，产物可被独立地编码并且各编码序列与启动子成功能关系。启动子可为相同或不同的。在某些构型中，载体含有编码树突状细胞成熟/刺激因子的多核苷酸序列。示例性刺激分子包括 GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、IL-21、IL-23、TNFa、B7. 1、Β7· 2、
214-1BB、⑶40配体(⑶40L)、药物诱导型⑶40 (i⑶40)等。这些多核苷酸通常受一个或多个调控元件的控制，所述调控元件指导树突状细胞中的编码序列的表达。树突状细胞的成熟有助于成功接种(Banchereau, J 禾口 Palucka，Α. K. Nat. Rev. Immunol. 5 :296-306 (2005)； Schuler, G.等 Curr. Opin. Immunol. 15 :138-147(2003) ；Figdor, C. G.等 Nat. Med. 10 475-480 (2004))。成熟可转化来自细胞的DC，所述细胞在活性上参与将抗原俘获于被特化用于T细胞引发的细胞中。举例来说，⑶40通过⑶40L结合于⑶4-辅助T细胞上是DC成熟的临界信号，产生CD8T细胞的有效活化。此类刺激分子也称为成熟因子或成熟刺激因子。免疫检查点表示癌症中功能性细胞免疫性活化的重要屏障，并且对T细胞上的抑制配体特异的拮抗性抗体(包括CTLA4和程序性死亡-I(PD-I)是临床上评估的靶向剂的实例。 慢性感染和癌症中的重要耐受性机理是表达高水平PD-I的Ag特异T细胞的功能性耗尽。 已显示出治疗性免疫的效力通过与免疫检查点控制(作为非限定性实例)的组合而显著增强，本领域普通技术人员应了解，抑制免疫检查点的替代方法是抑制程序性死亡(PD)配体 1和2(PD-L1/L2)的表达。实现抑制的一种方式是诸如本文所述的那些分子的RNA分子的表达，这抑制由编码一个或多个RNA分子的慢病毒载体转导的DC中的PD-L1/L2的表达。DC 的成熟或诸如免疫检查点(例如PD-I配体)的特定元件的表达可通过诸如MHC II的表面标记的上调的流式细胞术分析以及所表达的趋化因子和细胞因子的概况来表征。编码可检测产物(通常为蛋白质)的序列可被包括以允许鉴别表达所需产物的细胞。举例来说，将诸如绿色荧光蛋白(GFP)的荧光标记蛋白质连同目标序列(例如， 编码抗原的序列)一起并入构建体中。在其它情况下，蛋白质可通过抗体来检测，或蛋白质可为担当充当底物的酶，以便产生可检测产物或允许选择转染或转导靶细胞(例如赋予药物抗性，诸如潮霉素抗性)的产物。典型的选择基因所编码的蛋白质赋予对适用于真核细胞的抗生素或其它毒素(例如，尤其本领域中已知的新霉素、甲氨蝶呤、灭瘟素 (blasticidine))的抗性的蛋白质，或补充营养缺陷型缺陷，或供给从培养基中保留的关键养分。可选择标记物可任选地存在于单独的质粒上并通过共同转染来弓I入。可使用一个或多个多顺反子表达单位，其包括在包装细胞中产生所需病毒所必需的元件(例如，目标序列、包膜分子、DC成熟因子)中的两个或两个以上。多顺反子载体的使用降低所需的核酸分子的总数并因此避免与由多个载体基因组协同表达相关的可能的困难。在多顺反子载体中，要表达的各种元件与一个或多个启动子(和根据需要的其它表达控制元件)可操作地连接。在某些构型中，多顺反子载体包含目标序列、编码报告产物的序列和病毒元件。目标序列通常编码抗原并任选地编码DC成熟因子。有时，多顺反子载体包含编码抗原的基因、编码DC成熟因子的基因和病毒元件。在多顺反子表达载体中的要表达的各组分可(例如)由内部核糖体进入位点 (IRES)元件或病毒2A元件分隔，以便允许各种蛋白质由同一启动子的独立表达。IRES元件和2A元件是本领域中已知的(美国专利第4，937，190号；de Felipe等2004. Traffic 5 =616-626,每个参考文献的全部内容以引用方式并入本文)。在一个实施方案中，与来自口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A病毒(ERAV)和明脉扁刺蛾病毒(thosea asigna virus) (TaV) (Szymczak等2004. Nat. Biotechnol. 22 :589594,其全部内容以引用方式并入本文) 的2A样序列连接的编码弗林蛋白酶裂解位点序列的寡核苷酸(RAKR) (Fang等2005. Nat. Biotech 23 :584-590,其全部内容以引用方式并入本文)都是用来分隔多顺反子载体中的
22遗传元件。使用标准方案，通过检测每一基因的表达可容易地测试特定多顺反子载体的效力。在特定范例中，病毒载体基因组包含巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子序列；来自HIV 5' LTR的R和U5序列；包装序列(Ψ) ；HIV-I flap信号序列；内部增强子；内部启动子；目标基因；旱獭肝炎病毒反应性元件；tRNA琥珀抑制基因序列；缺失增强子序列的 U3元件；鸡β -球蛋白绝缘子；和3' HIV LTR的R和U5序列。在一些范例中，载体基因组包含完整的慢病毒5' LTR和自灭活3' LTR0 (Iwakuma等Virology 15 :120，1999，将其全部以引用方式并入)。载体基因组的构建可使用本领域中已知的任何合适的基因工程技术来实现，所述技术包括但不限于限制性内切核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序的标准技术，例如，如 Sambrook 等(1989. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.)> Coffin 等(Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. (1997))禾口 ‘’ RNA Viruses :A Practical Approach '’ (Alan J. Cann,Ed. , Oxford University Press, (2000))中所述的标准技术，前述每一个参考文献的全部内容以引用方式并入本文。4.病毒粒子的制备本领域中已知的多种方法中的任何方法都可用以制备基因组包含病毒载体基因组的RNA拷贝的感染性慢病毒粒子。在一种方法中，将病毒载体基因组引入含有包装病毒基因组RNA所必需的所有组分的包装细胞系中，将其由病毒载体基因组转录成病毒粒子。 或者，病毒载体基因组可包含编码除一个或多个目标序列之外的病毒组分的一个或多个基因。然而，为防止靶细胞中的基因组复制，通常要将复制所需的内源性病毒基因除去并独立地提供于包装细胞系中。一般来说，通过用含有产生粒子所必需的组分的一个或多个质粒载体转染细胞系来制备慢病毒载体粒子。这些慢病毒载体粒子通常不具复制能力，也就是说，它们仅能够进行单轮感染。最通常，使用多个质粒载体来分隔产生慢病毒载体粒子的各种遗传组分，这主要减小了可能另外产生具有复制能力的病毒的重组事件的机会。然而，在需要时，可使用具有所有慢病毒组分的单个质粒载体。作为使用多个质粒载体的系统的实例，将细胞系用以下转染含有病毒载体基因组的至少一个质粒(即载体基因组质粒)，包含LTR、顺式作用包装序列和常常与异源启动子可操作地连接的目标序列；编码病毒酶促和结构组分的至少一个质粒(即，编码诸如Gag和Pol的组分的包装质粒)；和编码虫媒病毒包膜糖蛋白的至少一个包膜质粒。如本文所述和本领域中已知的另外的质粒(例如，Rev表达质粒)可用于增强逆转录病毒粒子制备。病毒粒子穿过细胞膜出芽并包含含有基因组的核，所述基因组含有目标序列和靶向树突状细胞的虫媒病毒包膜糖蛋白。当虫媒病毒糖蛋白是辛德毕斯病毒E2糖蛋白时，将糖蛋白工程化改造为与参考菌株HR相比降低与硫酸乙酰肝素的结合。用本发明的质粒载体转染包装细胞可通过熟知的方法来实现，并且使用的方法不受任何方式限制。许多非病毒递送系统是本领域中已知的，包括(例如)电穿孔、包括脂质体的基于脂质的递送系统、“裸” DNA的递送和使用诸如khatzlein AG. (2001. Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy-Principles and Progresses. Anticancer Drugs,其全部内容以引用方式并入本文)中所述的那些化合物的聚环糊精化合物的递送。通常使用阳离子脂质或盐处理方法，参见，例如Graham等(1973. Virol. 52 :456) ；Wigler等(1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 :1373-76)，前述每个参考文献的全部内容以引用方式并入本文。最常用磷酸钙沉淀法。然而，也可使用将载体引入细胞中的其它方法，包括核微注射和细菌原生质体融合。包装细胞系提供包括病毒调控蛋白和结构蛋白的组分，需要将所述蛋白质反向用于将病毒基因组RNA包装到慢病毒载体粒子中。包装细胞系可为能够表达慢病毒蛋白质和制备功能性慢病毒载体粒子的任何细胞系。一些合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、 293T、HeLa(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK (ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)禾口 Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。包装细胞系可稳定表达必需的病毒蛋白质。此类包装细胞系 (例如)描述于美国专利第6，218，181号中，该专利的全部内容以引用方式并入本文。或者，可由编码一种或多种必需的病毒蛋白质的核酸分子连同病毒载体基因组一起来瞬时转染包装细胞系。收集所得的病毒粒子并将其用于感染靶细胞。通常将编码包膜糖蛋白的基因克隆到表达载体中，诸如，pcDNA3anvitrogen，CAUSA)。真核细胞表达载体在本领域中是熟知的并且可从许多商业来源获得。然后，用编码目标序列(通常为编码抗原的序列)的病毒载体基因组、编码病毒包装组分的至少一个质粒和用于表达靶分子的载体对包装细胞 (诸如细胞)进行共同转染。使包膜表达于包装细胞的膜上，并将其并入病毒载体中。在一种情形中，使用一个或多个载体以将多核苷酸序列引入包装细胞系中，以便制备用如本文所述的辛德毕斯病毒包膜糖蛋白(诸如，Ε2)假型化的慢病毒载体粒子。载体可含有编码病毒的各种组分(包括辛德毕斯病毒包膜)的多核苷酸序列、目标序列(通常为编码抗原的序列)和产生病毒所必需的不由包装细胞提供的任何组分。在其它情形中，用编码抗原的病毒载体基因组和一个或多个另外的载体来共同转染包装细胞。举例来说，除编码抗原的病毒载体之外，第二载体优选携带编码经过修饰的 (也称为变体)辛德毕斯病毒包膜的基因。在一些情况下，编码抗原的病毒载体基因组也包括编码选定的免疫调节因子的多核苷酸序列，所述选定的免疫调节因子包括的非限制性实例为趋化因子、细胞因子、DC成熟因子或调控免疫检查点机理的因子。在其它情形中，编码选定的免疫调节因子的多核苷酸序列包含在第三载体中，将所述第三载体与编码抗原的病毒载体和一个或多个另外的载体共同转染到包装细胞中。病毒的产生是如本文所述来测量并表示为每个体积的IU。IU是感染单位，或转导单位(TU) ；IU和TU可互换用作病毒载体粒子制剂的效价的定量量度。如本文所述，所制备的病毒中的基因组可表达可容易测量的产物。优选荧光蛋白，即绿色荧光蛋白。通常慢病毒载体是非整合型载体。然后，将病毒施用于靶细胞，并且诸如通过流式细胞术来测定表达GFP的靶细胞数目(参见实施例幻。然后，计算效价。优选地，效价尽可能高，但至少为 IX 105IU/mL细胞上清液、至少为3Χ 105IU/mL细胞上清液、至少为1 X 106IU/mL细胞上清液、至少为3X 106IU/mL细胞上清液或至少为IX 107IU/mL细胞上清液(任何浓缩之前)。 或者，效价是在相同细胞中用VSV-G包膜假型化的相同慢病毒载体的效价的至少80%、至少90%、至少95%、至少100%。C.病毒的递送可以将病毒以允许病毒与其中需要目标多核苷酸的递送的靶树突状细胞(DC)接触的任何方式递送至靶细胞。有时，(例如)经由注射入体内将合适量的病毒直接(体内)引入人或其它动物。合适的动物包括但不限于马、犬、猫、牛、猪、羊、兔、鸡或其它禽类。病毒粒子可通过许多途径来注射，所述途径诸如静脉内、真皮内、皮下、结内、腹膜腔内或粘膜。可使用真皮下注射装置来递送病毒，此类装置公开于美国专利第7，241, 275号、 第 7，115，108 号、第 7，108，679 号、第 7，083，599 号、第 7，083，592 号、第 7，047，070 号、 第 6，971，999 号、第 6，808，506 号、第 6，780，171 号、第 6，776，776 号、第 6，689，118 号、 第 6，670，349 号、第 6，569，143 号、第 6，494，865 号、第 5，997，501 号、第 5，848，991 号、第 5，328，483号、第5，279，552号、第4，886，499号中，将所有专利的全部内容以引用方式并入。其它注射位置也是合适的，诸如直接注射入包含靶细胞的器官中。举例来说，淋巴结内注射、脾脏内注射或骨髓内注射可用以将病毒分别递送至淋巴结、脾脏和骨髓。取决于特定环境和靶细胞的性质，可经由其它方式来进行引入，所述方式包括(例如)吸入或直接与上皮组织(例如眼睛、口或皮肤中的那些)接触。或者，提供靶细胞并使其与病毒体外接触，诸如在培养板中接触。靶细胞通常是包含从健康受试者或需要治疗或需要刺激对抗原的免疫反应的受试者获得的树突状细胞的细胞群。从受试者获得细胞的方法在本领域中是熟知的并且包括静脉切开术、外科切除术和活检。也可如其它地方所述，通过获得⑶34a+人造血祖细胞和使用体外培养方法来产生人DC(例如，Banchereau等Cell 106,271-274(2001)将其全部内容以引用方式并入)。可将病毒悬浮于培养基中并加入培养板的孔、管或其它容器中。可在接种细胞之前或已接种细胞之后含有病添加毒的培养基。细胞通常是在适当量的培养基中孵育以提供活力，并且允许培养基中合适浓度的病毒以使得宿主细胞的转导发生。优选使细胞与病毒一起孵育足够量的时间以允许病毒感染细胞。优选使细胞与病毒孵育至少1小时、至少5 小时或至少10小时。在体内和体外递送中，可使用含有感染所需靶细胞的足够数量的病毒粒子的等分试样。当要培养靶细胞时，病毒粒子的浓度通常是至少IIU/μ L、更优选至少IOIU/μ 1、甚至更优选至少300 υ/μ 、甚至更优选至少IX IO4IU/μ L、甚至更优选至少IX IO5IU/μ L、 甚至更优选至少1 X IO6IU/ μ L或甚至更优选至少1 X IO7IU/ μ L0用病毒体外感染之后，可将靶细胞引入(或重新引入)人或其它动物中。可将细胞引入真皮中，引入真皮下或引入周围血流中。引入动物中的细胞优选来源于动物的细胞以避免不利的免疫反应。也可使用来源于具有类似免疫背景的供体的细胞。也可使用的其它细胞包括设计来避免不利免疫反应的那些。举例来说，可分析靶细胞的目标序列或基因的整合、转录和/或表达，整合的基因的拷贝数目以及整合的位置。此类分析可在任何时间进行并可通过本领域中已知的任何方法来进行。可分析其中施用了病毒或病毒感染的树突状细胞的受试者的受感染细胞的位置、 目标病毒递送的多核苷酸或基因的表达、免疫反应的刺激，并通过本领域中已知的任何方法监测与疾病或病症相关的症状。以上公开的感染细胞的方法并不取决于细胞的个体特异性特征。因此，这些方法容易沿用到多个动物物种。在某些情况下，将病毒粒子递送至人或人树突状细胞，并且在其它情况下将它们递送至动物，诸如小鼠、马、狗、猫或小鼠或递送至禽类。如本文论述，使病毒载体基因组假型化以赋予其广泛的宿主范围以及靶细胞特异性。本领域中的技术人员也应明白在特定动物物种中实现目标序列的所需表达的适当内部启动子和其它元件。因此， 本领域中的技术人员能够修改感染来自任何物种的树突状细胞的方法。D.治疗性和预防性免疫可用如本文所述的慢病毒载体粒子感染树突状细胞以预防或治疗疾病或病症，尤其是患者体内的免疫反应活化有益的那些疾病或病症。许多此类疾病是熟知的。举例来说， 可通过本发明的方法治疗或预防的疾病或病症包括但不限于癌症、自身免疫疾病和感染， 包括病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染。在一种方法中，疾病通过本文所述的病毒粒子来治疗以便将目标序列递送至树突状细胞，其中目标序列的表达产生疾病特异抗原并引起对抗原特异细胞免疫反应和体液免疫反应的刺激。通常，目标序列编码需要针对其的免疫反应的抗原，但通常不在树突状细胞中表达。抗原是通过树突状细胞来表达和呈递。 病毒载体基因组可进一步编码DC成熟因子。在典型用法中，病毒粒子将编码需要针对其的免疫反应的抗原的序列递送至树突状细胞。递送可通过使树突状细胞与病毒体外接触来实现，于是，将受感染树突状细胞提供给患者。在其它时间，递送可通过将病毒递送至受试者以便体内感染树突状细胞来实现。然后，树突状细胞刺激患者体内的抗原特异性T细胞或B细胞以诱导对所表达抗原的细胞免疫反应和体液免疫反应。以此种方式，通过产生具有所需特异性的免疫细胞来治疗患有疾病或病症的患者。可使用如本文所述的病毒粒子将与疾病或病症相关的任何抗原递送至树突状细胞。鉴别与疾病或病症相关的抗原用于制备靶向树突状细胞的病毒粒子。与许多疾病和病症相关的抗原在本领域中是熟知的。抗原可能先前已知为与疾病或病症相关，或可通过本领域中已知的任何方法来鉴别。举例来说，患者所患有的癌症类型的抗原(诸如，肿瘤相关抗原)可为已知的，或可通过本领域中已知的多种方法中的任何方法从肿瘤自身鉴别出来。已知包括(例如)肾细胞癌瘤、前列腺癌、黑素瘤和乳癌的多种癌症的肿瘤相关抗原。举例来说，在一些乳癌中，Her-2受体在癌性细胞表面上过度表达。示例性肿瘤抗原包括但不限于MAGE、BAGE, RAGE和NY-ESO-l，它们均为睾丸的免疫特权区(immune-privileged area)和多种肿瘤细胞中表达的未突变抗原；系谱特异性肿瘤抗原，诸如黑色素细胞-黑色素瘤系谱抗原MART-l/Melan-A、gpl00、gp75、mda-7、酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白质、肾细胞癌瘤-5T4、SM22-a、碳酸酐酶I和IX(又名G250)、低氧诱导型因子(例如，HIF-I α和 HIF-2a)、VEGF或前列腺特异膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸式磷酸盐和前列腺的六跨膜上皮抗原(STEAP)NKX3. 1，它们均为来源于相同组织的正常细胞和赘生性细胞中表达的抗原；来源于肿瘤细胞中的突变基因或与正常细胞相比在肿瘤中以不同水平转录的基因的表位蛋白质/肽，诸如端粒酶、生存素、间皮素、突变的ras、bcr/abl重排、 Her2/neu、突变或野生型的p53、细胞色素P450 1B1，和异常表达的内含子序列，诸如N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶-V ；在骨髓瘤和B细胞淋巴瘤中产生独特个体基因型的免疫球蛋白基因的克隆性重排；来源于肿瘤病毒过程的表位蛋白质/肽，诸如人乳头状瘤病毒蛋白质 E6和E7 ；具有肿瘤选择性表达的非突变癌胚胎蛋白质，诸如癌胚抗原和甲胎蛋白。已综述了许多月中瘤相关抗原(参见，例如 Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes, “ Boon Τ, Cerottini J C, Vandeneynde B, Vanderbruggen P, Vanpel A, Annual Review OfImmunology 12 :337-365,1994 ； “ A listing of human tumor antigens recognized by T cells, " Renkvist N, Castelli C, Robbins P F, Parmiani G. Cancer Immunology Immunotherapy 50 :(1)3-15 MAR 2001，每个参考文献的全部内容以引用方式并入本文)。抗原也可以是与诸如(例如)HIV/AIDS的传染病相关的抗原。抗原可为(例如) gpl20(Klimstra,ff. B.等2003. J Virol 77 :12022-12032 ；Bernard,K. Α.等2000. Virology 276 :93-103 ；Byrnes, Α. P.等 1998. J Virol 72 :7349_7356，每个参考的全部内容以引用方式并入本文)。其它示例性抗原包括但不限于gag、pol、env、tat、nef和rev(Lieberman， J. φ 1997. AIDS Res Hum Retroviruses 13(5) :383-392 ；Menendez-Arias, L. φ 1998. Viral Immunol 11(4) :167_181，每个参考文献的全部内容以引用方式并入本文)。病毒抗原的实例包括但不限于腺病毒多肽、甲病毒多肽、杯状病毒多肽(例如，杯状病毒衣壳抗原)、冠状病毒多肽、瘟病毒多肽、伊波拉病毒(Ebola virus)多肽、肠道病毒多肽、黄病毒多肽、肝炎病毒(AE)多肽(例如，乙型肝炎核或表面抗原，或丙型肝炎病毒El 或E2糖蛋白、核或非结构蛋白质)、疱疹病毒多肽(例如，单纯疱疹病毒或水痘带状疱疹病毒糖蛋白)、免疫缺陷病毒多肽(例如，人免疫缺陷病毒包膜或蛋白酶)、感染性腹膜炎病毒多肽、流感病毒多肽(例如，流感A血球凝集素、神经氨酸酶或核蛋白)、白血病病毒多肽、马尔堡病毒(Marburg virus)多肽、正粘病毒多肽、乳头状瘤病毒多肽、副流感病毒多肽(例如，血球凝集素/神经氨酸酶)、副粘病毒多肽、细小病毒多肽、瘟病毒多肽、微小核糖核酸病毒多肽(例如，脊髓灰质炎病毒衣壳多肽)、水痘病毒多肽(例如，痘苗病毒多肽)、狂犬病毒多肽(例如，狂犬病毒糖蛋白G)、呼肠孤病毒多肽、逆转录病毒多肽和轮状病毒多肽。细菌抗原的实例包括但不限于放线菌属(Actinomyces)多肽、杆状菌属 (Bacillus)多肽、拟杆菌属(Bacteroides)多肽、包特菌属(Bordetella)多肽、巴尔通氏体属(Bartonella)多肽、伯氏体属(Borrelia)多肽(例如，伯氏疏螺旋体OspA(B. burgdorferi OspA))、布氏菌属(Brucella)多肽、弯曲菌属(Campylobacter)多肽、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)多肽、披衣菌(Chlamydia)多肽、梭菌属(Clostridium) 多肽、棒杆菌属(Corynebacterium)多肽、考克斯氏体属(Coxiella)多肽、嗜皮菌属 (Dermatophilus)多肽、肠球菌属(Enterococcus)多肽、埃里希氏体属(Ehrlichia)多肽、埃希氏菌属Escherichia)多肽、弗朗西丝氏菌属(Francisella)多肽、梭杆菌属 (Fusobacterium) $月太、inElil(Haemobartonella)Bfifil^M (Haemophilus) 多肽(例如，b型嗜血流感菌(H. influenzae)外部膜蛋白)、螺杆菌属(Helicobacter) 多肽、克氏杆菌属(Klebsiella)多肽、L形细菌多肽、钩端螺旋体属(Leptospira)多肽、 李斯特菌属(Listeria)多肽、分支杆菌属(Mycobacteria)多肽、枝原体属(Mycoplasma) 多肽、奈瑟菌属(Neisseria)多肽、新立克次氏体属(Neorickettsia)多肽、诺卡氏菌属 (Nocardia)多肽、巴氏杆菌属(Pasteurella)多肽、消化球菌属(Peptococcus)多肽、消化链球菌属(Peptostreptococcus)多肽、月市炎球菌属(Pneumococcus)多肽、变形杆菌属 (Proteus)多肽、假单胞菌属(I^seudomonas)多肽、立克次氏体属(Rickettsia)多肽、罗卡利马氏体属(Rochalimaea)多肽、沙门氏菌属(Salmonella)多肽、志贺氏菌属(Shigella) 多肽、葡萄球菌属Staphylococcus)多肽、链球菌属(Mr印tococcus)多肽(例如，化脓链球菌(S.pyogenes)M蛋白质)、密螺旋体属CTr印onema)多肽和耶尔森氏菌属(Yersinia) 多肽(例如，鼠疫耶尔森氏菌(Y. pestis)Fl和V抗原)。
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真菌抗原的实例包括但不限于犁头霉菌属(Absidia)多肽、枝顶孢属 (Acremonium)多肽、链格孢属(Alternaria)多肽、曲霉属(Aspergillus)多肽、蛙粪霉属 (Basidiobolus)多肽、蠕形菌属(Bipolaris)多肽、芽生菌属(Blastomyces)多肽、念珠菌属(Candida)多肽、球孢子菌属(Coccidioides)多肽、耳霉属(Conidiobolus)多肽、隐球菌属(Cryptococcus)多肽、弯孢菌属(Curvalaria)多肽、表皮癣菌属(Epidermophyton)多肽、外瓶霉属(Exophiala)多肽、地霉属(Geotrichum)多肽、组织胞浆菌属(Histoplasma) 多肽、马杜拉分支菌属(Madurella)多肽、马拉色菌属(Malassezia)多肽、小孢子菌属 (Microsporum)多肽、丛梗孢酵母属(Moniliella)多肽、接合菌属(Mortierella)多肽、毛霉属(Mucor)多肽、拟青霉属(Paecilomyces)多肽、青霉属(Penicillium)多肽、单孢瓶霉属(Phialemonium)多肽、瓶霉属(Phialophora)多肽、原壁菌属(Prototheca)多肽、波氏足月中菌属(Pseudallescheria)多月太、假小托菌属(Pseudomicrodochium)多月太、腐霄菌属 (Pythium)多肽、鼻孢子虫属(Iihinosporidium)多肽、根霉属(Iihizopus)多肽、齿梗孢属 (Scolecobasidium)多肽、分支孢菌属(Sporothrix)多肽、葡柄霉属(Stemphylium)多肽、 毛癣菌属(Trichophyton)多肽、毛孢子菌属(Trichosporon)多肽和木丝霉属(Xylohypha) 多肽。原生动物寄生虫抗原的实例包括但不限于巴倍虫属(Babesia)多肽、肠袋虫属 (Balantidium)多月太、贝诺虫属(Besnoitia)多月太、隐孢子虫属(Cryptosporidium)多肽、艾美虫属(Eimeria)多肽、脑炎微孢子虫属(Enc印halitozoon)多肽、内变形虫属 (Entamoeba)多肽、贾第虫属(Giardia)多肽、哈蒙德虫属(Hammondia)多肽、肝簇虫属 (Hepatozoon)多肽、等孢球虫属(Isospora)多肽、利什曼虫属(Leishmania)多肽、微孢子虫属(Microsporidia)多肽、新孢子虫属(Neospora)多肽、龙船草属(Nosema)多肽、 五鞭毛虫属(Pentatrichomonas)多肽、疟原虫属(Plasmodium)多肽(例如，恶性疟原虫 (P. falciparum)环子孢子(PfCSP)蛋白质、子孢子表面蛋白质2 (PfSSP2)、肝态抗原1的羧基末端(PfLSAI C-末端)和输出蛋白质I(PfExp-I))、肺囊虫属(Pneumocystis)多肽、肉孢子虫属(Sarcocystis)多肽、血吸虫属(Schistosoma)多肽、泰勒虫属(Theileria)多肽、弓形虫属CToxoplasma)多肽和锥虫属CTrypanosoma)多肽。蠕虫寄生虫抗原的实例包括但不限于棘唇线虫属(Acanthocheilonema)多肽、 猫圆线虫属(Aelurostrongylus)多肽、钩口线虫属(Ancylostoma)多肽、管圆线虫属 (Angiostrongylus)多肽、蛔虫属(Ascaris)多肽、布鲁格丝虫属(Brugia)多肽、仰口线虫属(Bunostomum)多肽、毛细线虫属(Capillaria)多肽、夏柏线虫属(Chabertia)多肽、古柏线虫属(Cooperia)多肽、环体线虫属(Crenosoma)多肽、网尾线虫属(Dictyocaulus) 多肽、肾膨结线虫属(Dioctophyme)多肽、双板线虫属(Dipetalonema)多肽、裂头绦虫属 (Diphyllobothrium)多肽、复孔绦虫属(Diplydium)多肽、恶丝虫属(Dirofilaria)多肽、龙线虫属(Dracunculus)多肽、蛲虫属(Enterobius)多肽、类丝虫属(Filaroides) 多肽、血矛线虫属(Haemonchus)多肽、兔唇蛔虫属(Lagochilascaris)多肽、罗阿丝虫属(Loa)多肽、曼森线虫属(Mansonella)多肽、缪勒线虫属(Muellerius)多肽、侏体吸虫属(Nanophyetus)多肽、板口线虫属(Necator)多肽、细颈线虫属(Nematodirus)多肽、结节线虫属(Oesophagostomum)多肽、盘尾丝虫属(Onchocerca)多肽、后睾吸虫属 (Opisthorchis)多肽、奥斯特线虫属(Ostertagia)多肽、副丝虫属(Parafilaria)多肽、并
28殖吸虫属(Paragonimus)多肽、副蛔虫属(Parascaris)多肽、泡翼线虫属(Physaloptera) 多肽、原圆线虫属(Protostrongylus)多肽、腹腔丝虫属(Setaria)多肽、旋尾线虫属 (Spirocerca)多肽、迭宫绦虫属(Spirometra)多肽、冠丝虫属Gtephanofilaria)多肽、 圆线虫属(Mrongyloides)多肽、圆线虫属(Strongylus)多肽、吸吮线虫属(Thelazia)多肽、弓蛔线虫属CToxascaris)多肽、弓形虫属(Toxocara)多肽、毛线虫属(Trichinella) 多肽、毛圆线虫属(Trichostrongylus)多肽、鞭虫属(Trichuris)多肽、钩虫属 (Uncinaria)多肽和吴策线虫属(Wuchereria)多肽。外寄生虫抗原的实例包括但不限于来自以下物种的多肽(包括保护性抗原以及过敏原)跳蚤；壁虱，包括硬壁虱和软壁虱；蝇类，诸如摇蚊、蚊子、沙蝇、黑蝇、马蝇、角蝇、 斑虻、采采蝇、厩蝇、引起蝇蛆病的蝇类和咬蚊；蚁类；蜘蛛类；虱子类；螨类；和蝽类昆虫， 诸如床虫和接吻虫。一旦已鉴别并选择抗原，鉴别编码所需抗原的序列。优选地，序列包含cDNA。病毒感染之后，通过靶树突状细胞来表达目标序列(例如，编码抗原的序列)。如果离体接触，那么随后(例如)通过注射将靶树突状细胞转移回患者，在患者体内，靶树突状细胞与能够对所需抗原产生免疫反应的免疫细胞相互作用。在优选的实施方案中，将重组病毒注射到患者体内，所述重组病毒将在患者体内原位转导靶树突状细胞。然后，树突状细胞表达与要治疗的疾病或病症相关的特定抗原，并且患者能够产生对所述疾病或病症的有效免疫反应。病毒载体基因组可含有编码一种以上抗原的多核苷酸序列，并且在靶树突状细胞的转导后，产生对众多递送至细胞的抗原的免疫反应。在一些实施方案中，抗原与单一疾病或病症相关。在其它实施方案中，抗原与多种疾病或病症相关。在一些病毒中，活化和/或刺激DC成熟的DC成熟因子连同目标序列一起递送。在替代方案中，在递送病毒之前，递送病毒同时或递送病毒之后，通过递送DC成熟因子来活化DC。DC成熟因子可独立地由病毒的施用提供。如本文所述，一个或多个免疫调节或DC成熟因子可由包含在病毒基因组中并在病毒感染树突状细胞之后表达的一个或多个序列来编码。编码免疫调节因子的序列也可提供于独立的载体中，所述载体与编码包装细胞系中的一个或多个抗原的病毒载体一起共同转染。本文所述的方法可用于患者体内的过继性免疫疗法。如上所述，鉴别出需要针对其的免疫反应的抗原。获得编码所需抗原的多核苷酸并将其包装在重组病毒中。从患者获得靶树突状细胞并用含有编码所需抗原的多核苷酸的重组病毒来转导。然后，将树突状细胞转移回患者体内。可体内注射病毒粒子，在体内，病毒粒子感染DC并递送通常编码抗原的目标序列。病毒粒子的量是至少3X IOfiIU并可为至少IX 107IU、至少3X 107IU、至少lXl(flU、至少3X108IU、至少IX IO9IU或至少3X109IU。以选定的时间间隔，来自受体淋巴器官的DC 可用以来测量表达，(例如)通过观测标记(诸如GFP或荧光素酶)表达来测量。核酸监测技术和逆转录酶(RT)活性的测量方法也可用来分析病毒粒子的生物分布。可测量来自慢病毒载体粒子治疗的受体的周围血液单核细胞、淋巴结、脾脏或恶性或靶病原体感染的组织的T细胞响应于抗原刺激的反应幅度和持久性。可分析诸如上皮细胞和淋巴样细胞的不同于DC的组织细胞的体内基因递送的特异性。
普遍认为，终结AIDS流行病(和其它病毒疾病)的最有效的可能方法是有效的预防性疫苗。迄今为止，对HIV的接种方法都没有成功地通过III期试验。因此，急需新的有效接种策略。一种策略就是DC的接种。在这种实施方案中，将编码病毒蛋白质的序列(诸如，上文所述的那些序列)克隆到病毒载体中。使患者由如本文所述来构建的病毒感染。 在一个动物模型中，分子克隆的HIV报告病毒(NFNSZ-r-HSAS、NL-r-HSAQ和临床分离物可用以通过尾部静脉注射激发动物。可随时间监测脾细胞、淋巴结和周围血液中的感染迹象。 用于HIV-gag蛋白质的PCR扩增和用于报告病毒中的HAS的流式细胞术可用以测试病毒整合和复制。产生性原位DC接种可增大对HIV激发的抗性。疫苗常常包括佐剂。本文所述的慢病毒载体粒子也可连同佐剂一起施用。佐剂可与重组病毒粒子一起施用，在重组病毒粒子之前施用或在重组病毒粒子之后施用。如果与病毒粒子一起施用，那么理想的佐剂不会显著地破坏病毒粒子的完整性，诸如不会破坏含有包膜糖蛋白的病毒膜。多种佐剂可与病毒组合使用以便引起对病毒载体基因组中编码的抗原的免疫反应。优选的佐剂增大对抗原的固有反应而不引起抗原的构型变化，所述构型变化影响反应的定性形式。优选的佐剂包括明矾、3 De-O-酰化单磷酰脂A(MPL)(参见GB 2220211)。QS21 是一种从南美洲发现的肥皂草皂树(Quillaja Saponaria Molina tree)的树皮中分离出的三萜葡萄糖苷或皂角苷(参见 Kensil 等，Vaccine Design :The Subunit and Adjuvant Approach (Powell 和 Newman 编，Plenum Press, NY, 1995)；美国专利第 5，057，540 号)。其它佐剂是水包油乳液(诸如角鲨烯或花生油)，其任选地与诸如单磷酰脂质A的免疫刺激剂组合(参见 Moute 等，N. Engl. J. Med. 336，86-91 (1997))。另一种佐剂是 CpG (Bioworld Today，Nov. 15，1998)。或者，Αβ可为与佐剂偶联。举例来说，如对乙型肝炎抗原接种的描述，Αβ的脂肽形式可通过将棕榈酸或其它脂质直接与Αβ的N-末端偶联来制备 (Livingston, J. Immunol. 159，1383-1392 (1997))。然而，此类偶联基本上不改变 A β 的构型以致影响对其的免疫反应的性质。佐剂可作为具有活性剂的治疗组合物的组分来施用， 或可独立地施用，在施用治疗剂之前施用，与施用治疗剂同时施用或在施用治疗剂之后施用。一类佐剂是铝盐(明矾)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝。此类佐剂可与或不与其它特定的免疫刺激剂一起使用，所述免疫刺激剂诸如MPL或3-DMP、QS21、聚合或单体氨基酸(诸如，聚谷氨酸或聚赖氨酸)。另一类佐剂是水包油乳液制剂。此类佐剂可与或不与其它特定的免疫刺激剂一起使用，所述免疫刺激剂诸如胞壁酰肽(例如，N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-降胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异亮氨酰基-L-丙氨酸-2-(1 ‘ -2' 二棕榈酰基-sn--甘油酸-3-羟基磷酰基氧基)_乙胺(MTP-PE)、N-乙酰基谷氨酰胺酰基-N-乙酰基胞壁酰基-L-AI-D-异谷氨酸-L-Ala- 二棕榈酰氧基丙酰胺(DTP-DPP) theramide. TM.)或其它细菌细胞壁组分。水包油乳液包含(a)MF59(W0 90/14837)，其含有5 %角鲨烯、0. 5 %吐温80和0. 5 % Span 85 (任选地含有各种量的 MTP-PE)，其是使用诸如110Y型微射流机的微射流机(Microf luidics，Newton Mass.)而配制成亚微粒子，(b)SAF，其含有10%角鲨烯、0.4%吐温80、5% pluronic嵌段共聚物L121 和thr-MDP，其被微射流成亚微乳液或涡旋以产生粒径较大的乳液，和(C)Ribi佐剂系统(RAS) (Ribi Immunochem，Hamilton, Mont.)，其含有 2%角鲨烯、0. 2% 吐温 80 和来自由单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)(优选MPL+CWS(Detox )) 组成的组的一种或多种细菌细胞壁组分。另一类优选佐剂是皂苷佐剂，诸如Stimulon. TM. (QS21, Aquila, Worcester, Mass.)，或由其产生的粒子，诸如ISC0M(免疫刺激复合物) 和ISC0MATRIX。其它佐剂包括弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)。其它佐剂包括细胞因子，诸如白细胞介素(IL-1、IL_2和IL-12)，巨噬细胞菌落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)。可与本文的组合物一起使用的另一佐剂由化学式(I)来鉴别
权利要求
1.一种慢病毒载体粒子，其包含(a)包膜，其包含SEQID NO 1的辛德毕斯病毒E2糖蛋白，其中160X不存在或为不同于谷氨酸的氨基酸，或SEQ ID NO :1的变体，所述变体与SEQ ID NO :1具有至少80%序列同一性并且其中160X不存在或为不同于谷氨酸的氨基酸，其能够感染树突状细胞；其中E2 不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的部分；和(b)慢病毒载体基因组，其包含目标序列。
2.根据权利要求1所述的慢病毒载体粒子，其中所述E2糖蛋白或变体与DC-SIGN结合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的慢病毒载体粒子，其中所述160X不存在或为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，诸如选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的慢病毒载体粒子，其中160X是甘氨酸。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的慢病毒载体粒子，其中所述E2糖蛋白变体的至少一个氨基酸改变以减少其净正电荷。
6.根据权利要求5所述的慢病毒载体粒子，其中所述改变的氨基酸选自由SEQID NO 1的赖氨酸70、赖氨酸76或赖氨酸159组成的组，并且所述取代任选独立地选自谷氨酸或天冬氨酸。
7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的慢病毒载体粒子，其中所述E2变体序列是SEQ ID No. 2、3或4 ；(变体1、2和幻，任选地包含一个或多个其它取代、插入或缺失。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的慢病毒载体粒子，其为一种变体，其中SEQ ID NO 1的残基71-75的序列无变化或具有不影响所述变体感染DC的能力的一个或两个取代，但不改变这个区内的氨基酸的数目。
9.根据前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体粒子，其中所述目标序列编码肿瘤特异性抗原或病毒衍生抗原，诸如HIV或SIV抗原。
10.根据前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体粒子，其中所述粒子的IU是至少 105/mL。
11.一种在包含辛德毕斯病毒E2糖蛋白变体的包膜中假型化的慢病毒载体基因组，所述基因组包含目标序列，其中所述E2糖蛋白变体促进树突状细胞由所述慢病毒载体粒子的感染；并且其中所述E2糖蛋白变体具有根据以上权利要求1至10所述中任一项的所定义的氨基酸序列。
12.一种用于制备假型化慢病毒载体粒子的慢病毒载体包装系统，其包含(i)第一核酸分子，其编码SEQ ID NO 1的辛德毕斯病毒E2糖蛋白，其中160X不存在或为不同于谷氨酸的氨基酸，或能够感染树突状细胞的辛德毕斯病毒E2糖蛋白的变体，所述变体与SEQ ID NO :1具有至少80%序列同一性并且其中160X不存在或为不同于谷氨酸的氨基酸；和( )第二核酸分子，其编码gag和pol蛋白质；(iii)第三核酸分子，其编码rev；和(iv)慢病毒载体基因组，其包含目标序列。
13.根据权利要求12所述的包装系统，其中所述E2糖蛋白具有根据以上权利要求1至 9中任一项所定义的氨基酸序列。
14.根据权利要求12或13所述的包装系统，其中所述pol蛋白质具有非功能性整合酶。
15.根据权利要求14所述的包装系统，其中所述非功能性整合酶具有D64V突变。
16.根据权利要求12、13、14或15所述的包装系统，其中所述第四核酸分子是非整合的慢病毒基因组。
17.根据权利要求12、13、14、15或16所述的包装系统，其中所制备的所述慢病毒载体粒子的效价为至少105IU/mL。
18.一种用根据权利要求12、13、14、15、16或17中任一项所述的第一核酸分子和第四核酸分子转染的细胞。
19.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一项所述的蛋白质，或任选地呈辛德毕斯E3/E2/6K/E1多聚蛋白形式的E3/E2糖蛋白，或其中所述 E3序列对应于SEQ ID NO :20的残基1-65的E3/E2糖蛋白，或其变体，所述变体与SEQ ID NO 20的残基1-65具有至少80%序列同一性，其中残基62-65是RSKR(SEQ ID NO 27)并且所述变体能够并入假型化病毒包膜中，任选进一步地，其中所述E2多聚蛋白的残基1是 Ser0
20.一种表达载体，其包含根据权利要求19所述的核酸分子。
21.一种宿主细胞，其包含根据权利要求20所述的表达载体。
22.—种制备根据权利要求1至11中任一项所述的慢病毒载体粒子的方法，其包括在细胞中表达(i)第一核酸分子，其编码SEQ ID NO 1的辛德毕斯病毒E2糖蛋白，其中160X不同于谷氨酸，或能够感染树突状细胞的辛德毕斯病毒E2糖蛋白的变体，所述变体与SEQ ID NO 1具有至少80%序列同一性并且其中160X不存在或为不同于谷氨酸的氨基酸；和( )第二核酸分子，其中可转录所述第二核酸分子并且可将转录物装配到假型化慢病毒载体粒子中。
23.一种根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11中任一项所述的慢病毒载体粒子， 其用于治疗人或动物受试者的方法中。
24.一种将慢病毒载体粒子体外递送至细胞的方法，其包括将所述细胞与根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11中任一项所述的慢病毒载体粒子混合。
25.一种治疗性或预防性疫苗，其包含根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11中任一项所述的慢病毒载体粒子和可药用的赋形剂。
全文摘要
本发明提供了慢病毒载体粒子，其包含辛德毕斯病毒E2糖蛋白变体和包含目标序列的慢病毒载体基因组。一种慢病毒载体粒子，其包含(a)包膜，其包含辛德毕斯病毒E2糖蛋白变体；和(b)慢病毒载体基因组，其包含目标序列；其中所述E2糖蛋白变体促进树突状细胞由慢病毒载体粒子的感染，并且其中与参考序列(HR菌株)相比，所述E2糖蛋白变体与硫酸乙酰肝素的结合降低。
文档编号C07K14/18GK102482329SQ201080040409
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月22日 优先权日2009年7月24日
发明者小汤玛士·W·杜班斯基, 霍芬 尼尔·S·凡, 德瑞克·D·史隆, 李金中, 詹姆士·M·艾伦 申请人:免疫设计公司