专利名称：T细胞受体的制作方法
T细胞受体本发明涉及结合EVDPIGHLY肽(源自MAGE-3蛋白)的T细胞受体(TCR)，所述肽以肽-HLA-Al复合体形式存在，所述TCR相对天然MAGE-A3 TCRa和/或0可变结构域进行突变，且对所述复合体所具有的结合亲和力和/或结合半衰期至少两倍于參比MAGE-A3TCR。
背景技术：
所述EVDPIGHLY(SEQ ID No:1)肽对应已知MAGE-3蛋白的氨基酸残基168-176。所述MAGE-3蛋白在多种肿瘤类型中有表达，包括黑色素瘤，以及其他固体肿瘤如头颈部鳞状细胞癌、肺癌、膀胱癌、胃癌和食道癌。所述MAGE-3肽EVDPIGHLY (SEQ ID No:1)是鉴定最充分的MAGE-3表位。它由HLA-Al和HLA-B35限制性T细胞识别。它能诱发细胞毒性抵御肽冲击，HLA-Al阳性靶细胞和MAGE-3-表达型HLA-Al阳性黑色素瘤细胞系。所述肽用作疫苗已表明可在ー些患者中诱导肿瘤消退和诱发CTL反应。因此，所述EVDPIGHLY HLA-Al复合体提供了本发明所述TCR可靶向的癌症标志物。比如，本发明的TCR可以转入T细胞内使其可以破坏呈递该HLA复合体的肿瘤细胞，用于在称作过继治疗的治疗过程中施于患者。为此，需要所述TCR相比所述肽-HLA复合体的特异性天然TCR而言对该复合体具有更高的亲和カ和/或更低的解离速率。亲和カ显著增加伴有TCR基因修饰的⑶8T细胞丧失抗原特异性，这会导致非特异性激活这些TCR转染的CD8T细胞，因此过继治疗优选的TCR相比所述肽-HLA复合体的特异性天然TCR而言对该复合体的亲和カ稍高和/或解离速率稍低，而非对所述肽-HLA复合体的亲和カ显著高于和/或解离速率显著低于天然TCR (见Zhao等(2007) J Tmmuno1.179:5845-54; Robbins等(2008) J Immunol.180:6116-31 ;也可见已公开的 W02008/038002)。TCR采用国际免疫遗传学(IMGT) TCR命名法进行表述，并与TCR序列的IMGT公开数据库相链接。天然杂ニ聚体TCR 具有a链和0链。宽泛地，每个链包括可变区、连接区和恒定区，P链还通常在可变区和连接区之间含有短的多变区，不过该多变区常被视为连接区的一部分。每个可变区包括嵌于构架序列中的三个CDR(互补决定区)，ー个是名为CDR3的高变区。共有几种类型的a链可变区(Va )和几种类型的P链可变区(V3 )，通过它们的构架，⑶Rl和⑶R2序列，以及部分限定的⑶R3序列进行区分。V a类型在頂GT命名法中通过特有的TRAV数来定名。因此，“TRAV21”限定义的TCR Va区具有独特的构架、⑶Rl和⑶R2序列，以及部分由TCR相互之间保守的氨基酸序列限定但还包括TCR相互之间有变化的氨基酸序列的⑶R3序列。同样地，“TRBV5-1”限定的TCR 区具有独特的构架、⑶Rl和⑶R2序列，以及仅部分限定的⑶R3序列。所述TCR的连接区类似地由特有的頂GT TRAJ和TRBJ命名法限定，而恒定区由IMGT TRAC和TRBC命名法限定。P链多变区在頂GT命名法中由缩略语TRBD定名，并如提到的，连接好的TRBD/TRBJ区常一起被视为连接区。一般认为a P TCR的a和P链各自含有两个“结构域”，即可变和恒定结构域。可变结构域由可变区和连接区的连接体组成。因此，本发明说明书和权利要求中，术语“TCRa可变结构域”指TRAV和TRAJ区的连接体，而术语TCR α恒定结构域指胞外TRAC区，或指C端截短的TRAC序列。类似的，术语“TCRβ可变结构域”指TRBV和TRBD/TRBJ区的连接体，而术语TCR β恒定结构域指胞外TRBC区，或指C端截短的TRBC序列。由IMGT命名法限定的特有序列已为TCR领域相关人员熟知并可获取。例如，可在IMGT公共数据库中找到这些序列。“T cell Receptor Factsbook(《T细胞受体丛书》)” (2001)LeFranc 和 LeFranc,学术出版社(Acadamic Press), ISBN0-12-441352-8 也公开了由IMGT命名法定义的序列，不过因为它的发表日期和时间间隔，有时需要通过参考IMGT数据库来确认信息。
我们已证实天然的MAGE-3 TCR(来源于比利时布鲁塞尔B-1200，希波克拉底斯大道74号UCL7459，鲁汶大学细胞遗传学部门Pierre G.Coulie博士的克隆EB81-103 ;另见Karanikas 等(2003)"Monoclonal ant1-MAGE-3 CTL responses in me Ianoma patientsdisplaying tumor regression after vaccination with a recombinant canarypoxvirus.(黑色素瘤患者中单克隆抗MAGE-3 CTL响应接种重组金丝雀痘病毒后显示肿瘤消退)〃J.1mmunol.171(9):4898-904))具有如下α链和β链可变、连接和恒定基因用法:α 链-TRAV21*01/TRAJ28/TRAC(SEQ ID No: 2 给出天然 MAGE-A3 TCRa 链的胞外序列)。β 链-TRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2(SEQ ID No: 3 给出天然 MAGE-A3TCR^链的胞外序列)。(需注意，TRBV5-1序列有两个等位基因变体，IMGT命名法中分别称作TRBV5-1*01和*02，上面所指的天然MAGE-A3TCR克隆具有*01变异。同样地，TRBJ2-7序列有两个已知变体，上面所指的TCR克隆中存在*01序列。另注意，没有限定符意味着相关序列只有一个已知等位基因。)术语“野生型TCR”、“天然TCR”、“野生型MAGE-A3 TCR”和“天然MAGE-A3 TCR”在本文中同义使用，指天然产生的含有胞外α和β链SEQ ID Νο:2和3的TCR。
发明内容
本发明提供一种T细胞受体(TCR)，其具有EVDPIGHLY(SEQ ID No:1)HLA-Al复合体结合特性且包含TCR α可变结构域和TCRP可变结构域，其特征在于:所述TCR α可变结构域具有SEQ ID No:2从Kl到Pl 14的氨基酸序列，但存在至少一种以下突变:501 突变为 50V;51Q 突变为 51R;52S 突变为 52P;53S突变为53Y ;和/或所述TCRP可变结构域具有SEQ ID No:3从Kl到Tl 12的氨基酸序列，但存在至少一种以下突变:50F 突变为 50T;51S 突变为 51D;52E 突变为 52M;53T 突变为 53L ；
54Q 突变为 54L。本发明的TCR优选对EVDPIGHLY HLA-Al复合体的结合亲和力和/或结合半衰期至少两倍于參比MAGE-A3 TCR，所述參比MAGE-A3 TCR具有胞外a链序列SEQ ID No:6和胞外^链序列SEQ ID No:7。需注意，SEQ ID No:6是天然a链胞外序列ID No:2但用C162替换后者的T162(即TRAC的T48)。同样，SEQ ID No:7是天然P链胞外序列ID No:3但用C169替换后者的S169 (即TRBC2的S57)，用A187替换后者的C187以及用D201替换后者的N201。这些相对天然a和3链胞外序列的半胱氨酸取代使得能形成链间ニ硫键以稳定重折叠的可溶性TCR，即所述TCR经胞外a和0链重折叠形成。采用稳定的ニ硫键连接的可溶性TCR作为參比TCR能更便捷地评估结合亲和カ和结合半衰期。a链SEQ ID No:6和P链SEQID No: 7中相对天然a和0链SEQ ID No: 2和3的其他突变为“沉默型”，就是说这些突变不会影响相对于天然序列的结合亲和カ或结合半衰期。因此，若本发明的TCR对EVDPIGHLYHLA-Al复合体的结合亲和力和/或结合半衰期至少两倍于參比MAGE-A3 TCR,则意味着其相对于上面所指的天然MAGE-A3 TCR克隆也满足这些标准。“具有胞外a链序列SEQ ID No:6和胞外^链序列SEQ ID No: 7的參比MAGE-A3TCR”在下文中与“參比TCR”或“參比MAGE-A3 TCR”同义使用。结合亲和力(与平衡常数Kd成反比)和结合半衰期(表述为T1/2)可用任何适当的方法来确定。应了解，TCR亲和カ翻倍导致Kd减半。T1/2由ln2除以解离速率计算得到。因此T1/2翻倍使得U减半。TCR的Kd和U值通常针对可溶形式的TCR測定，即经截短以除去疏水性跨膜结构域残基的那些形式。因此可理解为，若给定TCR的可溶形式满足针对EVDPIGHLY HLA-Al复合体的结合亲和力和/或结合半衰期的要求，则该TCR即满足这些要求。优选使用相同检测方 法多次，例如3次或更多次，測量给定TCR的结合亲和力和半衰期并取结果的平均值。在优选实施方式中，这些测量采用本文实施例3的表面等离子体共振(BIAcore)法进行。用该方法测得參比MAGE-A3 TCR的Kd约为250 u M，koff约为0.2s—1 (即 T1/2 约为 3s)。本发明所述TCR对EVDPIGHLY HLA-Al复合体的结合亲和力和/或结合半衰期至少两倍于參比MAGE-A3 TCR，但保留可接受的EVDPIGHLY HLA-Al复合体特异性，例如与參比MAGE-A3 TCR相似。与參比MAGE-A3 TCR相比，过继治疗用T细胞转染所需的TCR对所述EVDPIGHLY HLA-Al复合体具有稍高的亲和カ和/或稍长的结合半衰期(尽管仍分别至少两倍于天然TCR)。例如，本发明所述TCR对所述复合体的Kd从约6 ii M到约70 y M，和/或对所述复合体的结合半衰期(T1/2)从约I秒到约11秒。为达本发明的目的，TCR为具有至少ー个TCRa和/或TCR P可变结构域的部分。它们一般包含TCRa可变结构域和TCRP可变结构域。它们可能是a ^杂ニ聚体或可能是单链形式。为了用于过继治疗，举例而言，a ^杂ニ聚体TCR可能以含胞质和跨膜结构域的全长链来进行转染。如果需要，相应恒定结构域之间可能存在引入的ニ硫键(參见如W02006/000830)。无论何种形式，相对具有胞外a和0链SEQ ID No: 2和3的天然MAGE-A3 TCR,本发明所述TCR在其a可变结构域(SEQ ID No: 2的Kl到Pl 14)和/或P可变结构域(SEQ ID No:3的Kl到T112)中有突变。天然MAGE-A3或参比MAGE-A3 TCR可用作模板，弓丨入能导致本发明所述TCR与EVDPIGHLY HLA-Al复合体之间相互作用的高亲和力和/或慢解离速率的多种突变。本发明的实施方式包括相对SEQ ID No:2的Kl到P114的α可变结构域和/或SEQ ID Νο:3的Kl到Τ112的β可变结构域在至少一个互补决定区(OTR)和/或其可变结构域构架区有突变的TCR。可采用任何适当方法进行突变，包括但不限于:基于聚合酶链式反应(PCR)、限制性酶基克隆，或不依赖连接反应的克隆(LIC)过程的那些方法。这些方法在许多标准分子生物学文本中有详细描述。关于聚合酶链式反应(PCR)诱变和限制性酶基克隆的进一步细节见Sambrook和Russell, (2001)Molecular Cloning-A Laboratory Manual (《分子克隆一实验室手册》)(第三版)CSHL出版社。LIC过程的进一步信息可参见(Rashtchian，(1995)Curr Opin Biotechnol6(I):30-6)。产生本发明的高亲和性MAGE-3 TCR的一种方法是从W02004/044004公开的展示此类TCR的噬菌体颗粒的多样库中进行挑选。需注意的是，包含与天然MAGE-A3 TCR或参比MAGE-3 TCR相似的Va和νβ基因用法并因而具有相似的可变结构域氨基酸序列的任何a PTCR可作为便捷的模板TCR。随后可以向编码模板α β TCR的一个或两个可变结构域的DNA中引入产生本发明的突变TCR所需的变化。对于本领域技术人员显而易见地，必要的突变可用多种方法引入，如定点诱变。在一些实施方式中，本发明所述TCR具有SEQ ID Νο:2的Kl到Ρ114的α链可变结构域，但该序列中501，51Q，52S或53S —个或多个位点的氨基酸残基发生突变，和/或具有SEQ ID No:3的Kl到T112的β链可变结构域，但该序列中50F，51S，52Ε，53Τ或54Q —个或多个位点的氨基酸残基发生突变。例如，本发明所述TCR可能具有按SEQ ID Νο:2中所示编号的α链可变结构域氨基酸 残基50V，51R，52P或53Y中的一个或多个，和/或按SEQID No:3中所示编号的β链可变结构域氨基酸残基501'，510，5211，531^或5礼中的一个或多个。本发明的特定TCR包括含有α链可变结构域氨基酸序列SEQ ID No:8和9之一，和/或β链可变结构域氨基酸序列SEQ ID No: 10和11之一的那些TCR。因此具有野生型α链的可变结构域序列(SEQ ID No:2的Kl到P114)的TCR可能与具有SEQ ID NoilO和11之一的β链关联。替代地，具有SEQ ID Νο:8和9之一的α链可能与野生型β链的可变结构域序列(SEQ ID Νο:3的Kl到Τ112)关联。替代地，具有SEQ ID Νο:8和9之一的α链可能与具有SEQ ID No: 10和11之一的β链关联。如上所述的TCR的表型沉默变体也是本发明的一部分。术语“表型沉默变体”是指与本发明所述TCR序列一致但在恒定和/或可变结构域掺有不会改变与肽一 HLA复合体相互作用的亲和力和/或解离速率的变化。此类变体的一种示例是本发明的TCR，所述TCR中TCRa恒定结构域中按SEQ ID No:2中所示编号的135丝氨酸(S)氨基酸残基替换成苯丙氨酸(F)氨基酸残基。如上所述，本发明的α β杂二聚体TCR可在其恒定结构域之间含有引入的二硫键。这种类型的优选TCR包括具有TRAC恒定结构域序列和TRBCl或TRBC2恒定结构域序列但TRAC的Thr48和TRBCl或TRBC2的Ser57被替换成半胱氨酸残基的TCR，所述半胱氨酸在TCR的TRAC恒定结构域序列和TRBCl或TRBC2恒定结构域序列之间形成ニ硫键。无论有或没有上段中提到的引入的链间键，本发明的a ^杂ニ聚体TCR可具有TRAC恒定结构域序列和TRBCl或TRBC2恒定结构域序列，且TCR的TRAC恒定结构域序列和TRBCl或TRBC2恒定结构域序列可通过TRAC外显子2的Cys4和TRBCl或TRBC2外显子2的Cys2之间的天然ニ硫键连接。本发明的a ^杂ニ聚体TCR可用于过继治疗，因此本发明包括呈递本发明所述TCR的分离细胞，特别是T细胞。许多方法适用于将编码本发明所述TCR的DNA或RNA转染入T细胞。(參见例如Robbins等，(2008) J.1mmunol.180:6116-6131)。表达本发明所述TCR的T细胞适用于基于过继治疗的MAGE-3+HLA-A1+癌症治疗。本领域技术人员已知过继治疗可得以进行的许多合适方法。(參见例如Rosenberg等，(2008) Nat RevCancer8 (4):299-308)。
为了用于过继治疗，本发明还包括携帯TCR表达载体的细胞，所述表达载体包含位于单ー开放读码框内或两个不同开放读码框内的编码本发明所述TCR的核酸。本发明范围内还包括携帯第一表达载体和第二表达载体的细胞，其第一表达载体包含编码本发明所述TCR的a链的核酸，其第二表达载体包含编码本发明所述TCR的P链的核酸。欲用于过继治疗的本发明TCR由经转染的T细胞表达时是糖基化的。已熟知，转染的TCR的糖基化模式可以通过所转染基因的突变而改变。为了施用于患者，本发明所述TCR转染的T细胞可以在药物组合物中与药学可接受载体一同提供。本发明所述的细胞通常作为无菌药物组合物的一部分进行供应，所述组合物一般包括药学可接受的载体。该药物组合物可为任何合适的形式(取决于将其施用于患者所需的方法)。其可按单位剂型提供，通常在密闭容器中提供，并可作为试剂盒的一部分来提供。此类试剂盒通常(但并非必须)包括使用说明。其可包括多种所述单位剂型。所述药物组合物可适于通过静脉内途径来施用。此类组合物可通过制药领域任何已知方法制备，如将活性组分与载体或赋形剂在无菌状态下混合。本发明所述物质的剂量可大范围变动，取决于所治疗的疾病或症状，待治疗个体的年龄和状况等，医师可最終决定适当的使用剂量。
实施例通过以下实施例进ー步说明本发明，其中涉及以下附图。
图1A和 2A分别显示具有TRAV21*01/TRAJ28/TRAC基因的天然MAGE-A3 TCRa 链，和具有 TRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2 基因的天然 MAGE-A3 TCRP 链(分别为 SEQID No:2和3)的胞外氨基酸序列。图1B和2B分别显示编码可溶性野生型MAGE-A3 TCRa和0链即參比MAGE-A3TCRa和0链的DNA序列。这些序列包括形成非天然ニ硫键的附加半胱氨酸残基。编码附加半胱氨酸残基的经突变密码子为粗体。NdeI和HindIII限制性酶识别序列带下划线。图1C和2C分别显示由图1B和2B的DNA序列分别生成的可溶性野生型MAGE-A3TCR或參比MAGE-A3 TCR的a和0链胞外的氨基酸序列(分别为SEQ ID No:6和7)，不过不含用于细菌内有效表达而插入的前导甲硫氨酸。所引入的半胱氨酸为粗体并带下划线。图3A-B显示本发明所述MAGE-A3 TCR变体的a链可变结构域氨基酸序列。突变的残基为粗体并带下划线。图4A-B显示本发明所述MAGE-A3 TCR变体的β链可变结构域氨基酸序列。突变的残基为粗体并带下划线。图5Α显示用于转导T细胞的野生型MAGE-A3-特异性TCR基因的DNA序列(WT α链-2A-WTi3链构建体，猪捷申病毒-12A序列为粗体并带下划线)。图5B显示由图5的DNA序列生成的用于T细胞转导的野生型MAGE-A3-特异性TCR的氨基酸序列。猪捷申病毒-12A序列为粗体并带下划线。图6显示ELISP0T试验中酶联免疫斑点检测中MAGE-A3 TCR转导的T细胞响应一系列靶细胞的IFN-Y释放。这些图显示较高亲和力MAGE-A3 TCR转导的T细胞相比天然MAGE-A3 TCR转导的T细胞具有增强的特异性激活。图7显示的细胞毒性试验检测由MAGE-A3 TCR转导的T细胞杀死肿瘤细胞系。实施例1克隆参比MAGE-A3TCRa和β链可变区序列至PGMT7表达质粒中从提取自MAGE-3 T细胞克隆(来源于比利时鲁汶大学Pierre Coulie的克隆ΕΒ81-103)的总cDNA中PCR扩增得到参比MAGE-A3 TCR可变α和TCR可变β结构域。就α链而言，利用α链可变区序列特异性寡核苷酸Al (ggaattccatatgaaacaagaagttactcaaattcc SEQ ID No: 14),和 α 链恒定区序列特异性寡核苷酸 Α2 (ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg SEQ ID No: 15)扩增α链可变区,其中Al编码限制性位点NdeI和用于有效启动细菌内表达而引入的甲硫氨酸，而Α2编码限制性位点Sail。就β链而言，利用β 链可变区序列特异 性寡核苷酸 BI (gaattccatatgaaagctggagttactcaaactccaag SEQ IDNo: 16),和 β 链恒定区序列特异性寡核苷酸 Β2 (tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc SEQID No: 17)扩增β链可变区，其中BI编码限制性位点NdeI和用于有效启动细菌内表达而引入的甲硫氨酸，而Β2编码限制性位点AgeI。米用Sambrook 和 Russell 的 Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克隆实验室手册》)第三版中描述的标准方法，将α和β可变区克隆到含有Ca或Ci3的pGMT7表达质粒中。利用应用生物系统公司(Applied Biosystems)的3730x1 DNA分析仪对质粒进行测序。将经NdeI和SalI酶切的编码TCR α链的DNA序列接入经NdeI和XhoI酶切的PGMT7+C α载体中。将经NdeI和AgeI酶切的编码TCR β链的DNA序列接入同样经NdeI和AgeI酶切的另一 pGMT7+CP载体中。连接将已连接的质粒转入大肠杆菌(E.coli)XLl_蓝色细胞中，接种至含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB/琼脂平板上。37° C培养过夜后，挑取单菌落并在含100 μ g/ml氨苄青霉素的IOml LB中37° C振荡生长过夜。利用Minipr印试剂盒(凯杰公司)纯化克隆质粒，并利用应用生物系统3730x1 DNA分析仪对质粒进行测序。图1C和2C分别显示由图1B和2B的DNA序列分别生成的可溶性二硫键连接的参比MAGE-A3 TCRa和β链胞外氨基酸序列(分别为SEQ ID Νο:6和7)，不过不含用于细菌内有效表达而插入的前导甲硫氨酸。注意，α和β链的恒定区中有半胱氨酸替换，以在重折叠形成杂二聚体TCR时提供人工链间二硫键。所引入的半胱氨酸为粗体并带下划线。图1B和2Β的DNA序列中的限制性酶识别序列带下划线。
实施例2表达、重折叠和纯化可溶性參比MAGE-A3 TCR将实施例1中制备的分别含TCRa链和P链的表达质粒各自转入大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)pLysS中，氨节青霉素抗性的单菌落于TYP(氨节青霉素IOOii g/ml)培养基中37° C生长至OD6tltl约为0.6-0.8后用0.5mM IPTG诱导蛋白表达。诱导3小时后于贝克曼(Beckman)J-6B中4000rpm离心30分钟收集细胞。在MgCl2和DNA酶I存在下用25ml BugBuster (诺瓦基公司(NovaGen))裂解细胞团块。在贝克曼J2-21离心机中13000rpm离心30分钟回收包涵体团块。然后进行三次洗涤剂洗涤以去除细胞碎片和膜组分。每次将包涵体团块于曲通(Triton)缓冲液(50mM Tris-HCI pH8.0，0.5% 曲通-X100, 200mM NaCl, IOmMNaEDTA)中匀浆后，4000rpm离心15分钟得团块。用如下缓冲液:50mMTris_HCl pH8.0, ImMNaEDTA，pH8.0，通过类似的洗涤除去洗涤剂和盐。最后，将包涵体分成30mg等份并-70° C冷冻。用6M盐酸胍溶解并在日立(Hitachi)U-2001分光光度计上测定OD来定量包涵体蛋白质得率。由消光系数计算得到蛋白浓度。从冻存备料解冻出 约15mg TCRP链和15mg TCRa链的已溶解包涵体，稀释至IOml胍溶液(6M盐酸胍，50mM Tris HCl pH8.1, IOOmM NaCl, IOmM EDTA, IOmMニ硫苏糖醇)稀释以确保链完全变性。接着将含完全还原和变性的TCR链的胍溶液注射到0.5L如下重折叠缓冲液中=IOOmM Tris pH8.1, 400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M尿素。先加入氧化还原对(半胱胺盐酸盐和胱胺ニ盐酸盐)至终浓度分别为6.6mM和3.7mM,约5分钟后加入变性的TCR链。溶液静置约30分钟。将重折叠TCR用纤维素膜透析管(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，产品号D9402)在IOL水中于5° C±3° C透析18-20小时。随后将透析缓冲液两次换成新鲜的IOmM Tris pH8.1 (IOL)并于5° C±3° C继续透析约8小时。将经透析的重折叠液上载到POROS 50HQ阴离子交换柱上，利用Akta纯化仪(GE医疗集团(GE Healthcare))用IOmM Tris pH8.1以跨6倍柱体积的0_500mM NaCl梯度洗脱结合的蛋白，从而将可溶性TCR与错误折叠物、降解产物和杂质分离。将峰组分于4° C保存并用考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析后，汇集并浓缩。最后，利用经PBS缓冲液(西格玛公司)预平衡的GE医疗集团Superdex 75HR凝胶过滤柱纯化和鉴定可溶性TCR。汇集和浓缩相对分子量约为50kDa处洗脱的峰，然后采用BIAcore表面等离子体共振分析进行鉴定。实施例3结合特征BIAcore 分析表面等离子体共振生物感应器(BIAcore 3000 )可用于分析可溶性TCR与其肽-MHC配体的结合。这受益于可溶性生物素化的肽-HLA (“pHLA”)复合体的生成，该复合体可固定化到包被有链霉亲和素的结合表面(感应器芯片)。所述感应器芯片包括四个独立的流动池，可以同时测量T细胞受体与四个不同pHLA复合体的结合。手动注射pHLA复合体使得固定化I类分子的精密水平易于操控。通过含有组成亚基蛋白和合成肽的细菌表达的包涵体的体外重折叠，再经过纯化和体外酶促生物素化得到生物素化I类HLA-A*01分子(O’ Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266:9-15)。HLA_A*01重链表达时带有C端生物素化标签，该标签以适当构建体中替代该蛋白的跨膜和胞质结构域。所得包涵体表达水平约为75mg/L细菌培养物。在大肠杆菌中也由适当构建体将MHC轻链或￠2-微球蛋白(0 2m)表达为包涵体，表达水平约为500mg/L细菌培养物。 裂解大肠杆菌细胞并纯化包涵体至约80%纯度。将合成肽(MAGE-A3EVDPIGHLY)溶解于DMSO中至终浓度4mg/ml。β 2m和重链的包涵体分别于6M盐酸胍，50mM Tris pH8.1，IOOmM NaCl，IOmM 二硫苏糖醇，IOmM EDTA中变性。制备的重折叠缓冲液含有0.4M L-精氨酸，IOOmM Tris pH8.1，3.7mM胱胺二盐酸盐，6.6mM半胱胺盐酸盐，并冷藏至低于5° C。优选先将所述肽加入重折叠缓冲液中，然后加入变性的β 2m，再加入变性的重链。将MAGE-A3EVDPIGHLY肽加入重折叠缓冲液中至4mg/L (终浓度)。然后加入30mg/L β 2m,再是30mg/L重链(终浓度)。4° C重折叠至少I小时使其进行完全。用10倍体积的IOmM Tris pH8.1透析以置换缓冲液。需要换两次缓冲液以充分降低溶液的离子强度。此后，蛋白溶液经1.5 μ m醋酸纤维素滤器过滤后上载到POROS 50HQ阴离子交换柱(8ml柱床体积)。利用Akta纯化仪(GE医疗集团)用含Tris pH8.1以线性的0-500mM NaCl梯度 洗脱蛋白。HLA_A*01-肽复合体约在250mM NaCl处洗脱，收集峰组分，加入蛋白酶抑制剂混合物(卡巴开公司(Calbiochem))，并将组分于冰上冷却。将生物素标记的pHLA分子经缓冲液置换入IOmM Tris pH8.1, 5mM NaCl，所述置换利用平衡于同一缓冲液的GE医疗集团快速脱盐柱。洗脱后立即将含蛋白的部分于冰上冷却并加入蛋白酶抑制剂混合物(卡巴开公司)。然后加入生物素化试剂:lmM生物素，5mM ATP(缓冲至 ρΗ8)，7.5mM MgCl2 和 5 μ g/ml BirA 酶(按 0’Callaghan 等(1999) Anal.Biochem.266:9-15所述进行纯化)。然后将混合液于室温孵育过夜。利用凝胶过滤层析纯化所述生物素化pHLA_A*01分子。将GE医疗集团的Superdex75 HR10/30柱用经过滤PBS预平衡，上载Iml生物素化的反应混合液，并将柱用Akta纯化仪(GE医疗集团)用PBS以0.5ml/min展开。生物素化pHLA_A*01分子在约15ml时以单一峰洗脱。汇集含蛋白的部分，冰上冷却并加入蛋白酶抑制剂混合物。利用考马斯结合试验(PerBio)测定蛋白浓度，将等份的生物素化pHLA_A*01分子于-20° C冷冻保藏。这样固定化的复合体能结合T细胞受体和共受体⑶8 α α，两者均可注入可溶相。可溶性TCR在可溶或固定相中使用时，所观察到的pHLA结合特性在定性和定量上均相似。这是对可溶物的部分活性的重要对照，也暗示了生物素化PHLA复合体与非生物素化复合体生物活性一样。BIAcore3000 表面等离子体共振(SPR)生物感应器测量小流动池内感应器表面附近的折射率的变化，以响应单位(RU)表示，此原理可用于检测受体配体相互作用和用于分析它们的亲和力和动力学参数。BIAcore实验于25° C下进行，使用PBS缓冲液(西格玛公司，PH7.1-7.5)作为电泳缓冲液和用于制备蛋白样品的稀释液。采用标准胺类偶合法将链霉亲和素固定于流动池。PHLA复合体经生物素标签固定。然后通过将可溶性TCR以恒定流速通过不同流动池的表面进行试验，从而测量SPR响应。平衡结合常数上述BIAcore分析方法用于确定平衡结合常数。制备二硫键连接的可溶性杂二聚体形式的参比MAGE-A3TCR的连续稀释液，以5微升/分钟恒定流速注射流过两个不同的流动池；一个包被有约1000RU的特异性EVDPIGHLYHLA-A*01复合体，第二个包被有约1000RU的非特异性HLA-A2-肽(KIFGSLAFL (SEQ ID No:18))复合体。用对照池的测量来标准化每个浓度的响应。将标准化的数据响应对TCR样品浓度作图，拟合至非线性曲线拟合模型，用以计算平衡结合常数 Kd。(Price 和 Dwek, Principles and Problems in PhysicalChemistry for Biochemists (《针对生物化学家的物理化学原理和方法》,第二版)1979,Clarendon出版社，牛津)。ニ硫键连接的可溶形式的參比MAGE_A3TCR(实施例2)的Kd约为250 UM0相同BIAcore数据得到T1/2约为3s。动力学參数上述BIAcore分析方法还用于确定平衡结合常数和解离速率。通过实验測量解离速率常数I^ff和结合速率常数匕确定TCR(见下述实施例4)的Kd。平衡常数Kd计算为kf/1^。TCR注射流过两个不同的池，ー个包被有约300RU的特异性EVDPIGHLY HLA_A*01复合体，第二个包被有约300RU的非特异性HLA-Al-肽复合体。流速设定为50 u 1/min。通常注射250 u I浓度相当于约10倍Kd的TCR。然后，缓冲液流过直至响应回到基线或耗时大于2小时为止。利用BIAevaluation软件计算动力学參数。将解离相拟合成可计算半衰期的一次指数衰减方程。实施例4产生參比MAGE-A3 TCR的变体噬菌体展示是ー种手段，藉此产生MAGE-A3 TCR变体库用以鉴定亲和カ较高的突变体。可对实施例 2 的 MAGE-A3 TCR 施用(Li 等(2005) Nature Biotech23 (3): 349-354)中描述的TCR曬菌体展不和筛选方法。鉴定出亲和カ和/或亲和半衰期至少两倍于參比MAGE-A3 TCR(因此意味着至少两倍于天然TCR)的TCR，它们含有按SEQ ID No:2中所示编号的a链可变结构域氨基酸残基50V，51R，52P或53Y中的ー个或多个，和/或按SEQ ID No:3中所示编号的P链可变结构域氨基酸残基50T，51D，52M，53L或54L中的ー个或多个。
图3A-B和4A-B分别显示较高亲和力TCR的a链(SEQ ID No:8和9)和@链(SEQ ID No: 10和11)的可变区氨基酸序列的特定示例。这些a链在⑶R2中突变，@链在CDR2中突变。利用上文实施例2的方法重折叠TCR杂ニ聚体(包括在恒定区引入半胱氨酸以提供人工的链间ニ硫键)。按该方式制备包括TCR，其组成为:(a)參比TCRP链与含有可变结构域SEQ ID No:8和9的a链；(b)參比TCRa链与含有可变结构域SEQ ID No: 10和11的P链；以及(C)含有突变可变结构域的P和a链的多种组合。利用上述BIAcore方法分析这些可溶性ニ硫键连接的MAGE-A3 TCR与EVDPIGHLYHLA-A*01复合体之间的相互作用，结合数据如表I所示。表I
权利要求
1.一种T细胞受体(TCR)，其具有结合EVDPIGHLY(SEQ ID No:1) HLA-Al复合体的特性且包括TCR a可变结构域和TCRP可变结构域，其特征在于: 所述TCRa可变结构域具有SEQ ID No:2从Kl到Pl 14的氨基酸序列，但存在至少一种以下突变: 501突变为50V ； 51Q突变为51R ； 52S突变为52P ； 53S突变为53Y ;和/或 所述TCRP可变结构域具有SEQ ID No:3从Kl到Tl 12的氨基酸序列，但存在至少一种以下突变: 50F突变为50T ； 51S突变为51D ； 52E突变为52M ； 53T突变为53L ； 54Q突变为54L。
2.按权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含a链可变结构域氨基酸序列SEQ ID No:8和9中 的一个。
3.按权利要求1或2所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含P链可变结构域氨基酸序列SEQ ID No: 10和11中的一个。前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR还具有a链TRAC恒定结构域和P链TRBCl或TRBC2恒定结构域，或具有经截短或替换修饰的a链TRAC和3链TRBCl或TRBC2恒定结构域，所述修饰用以去除TRAC外显子2的Cys4和TRBCl或TRBC2外显子2的Cys2之间的天然二硫键。
4.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR为a^杂二聚体TCR，且具有a和P链恒定结构域序列，其中TRAC的Thr48和TRBCl或TRBC2的Ser57被替换成半胱氨酸残基，所述半胱氨酸在TCR的a和P恒定结构域之间形成二硫键。
5.码前述权利要求中任一项所述的TCR的核酸。
6.带TCR表达载体的细胞，所述载体包含位于单一开放读码框或两个不同开放读码框中的如权利要求5所述的核酸。
7.带第一表达载体和第二表达载体的细胞，所述第一表达载体包含编码权利要求1至4中任一项所述的TCR的a链的核酸，所述第二表达载体包含编码权利要求1至4中任一项所述的TCR的P链的核酸。
8.一种细胞，所述细胞在其表面展示权利要求1至4中任一项所述的TCR。
9 权利要求8所述的细胞，所述细胞呈递具有SEQID No:8所示a链可变结构域和SEQ ID No:3所示P链的TCR。
10 权利要求8所述的细胞，所述细胞呈递具有SEQID No:9所示a链可变结构域和SEQ ID No:3所示P链的TCR。
11 权利要求8所述的细胞，所述细胞呈递具有SEQID No:2所示a链和SEQ IDNo: 10所示P链可变结构域的TCR。
12
13 略
14.按权利要求8所述的细胞，所述细胞呈递具有SEQID No:2所示a链和SEQ IDNo: 11所示P链可变结构域的TCR。
15.一种药物组合物，其包括多种如权 利要求6至14中任一项所述的细胞和一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。
全文摘要
一种T细胞受体(TCR)，其具有EVDPIGHLY HLA-A1复合体结合特性并包含特定的野生型T细胞受体(TCR)，所述TCR在TCRα可变结构域和/或TCRβ可变结构域具有特定突变以增强亲和力。所述TCR可用于过继治疗。
文档编号C07K14/705GK103097407SQ201080068257
公开日2013年5月8日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者B·K·雅各布森, N·R·利迪 申请人:英美偌科有限公司