专利名称：一种由活体柞蚕蛹诱导与提取蚕抗菌素的方法
技术领域：
本发明涉及抗菌素提取工艺，具体地说，是一种由活体柞蚕蛹诱导与提取抗菌素的方法。
背景技术：
自1980年Boman首次在惜比古天蚕中分离出天蚕素以来，先后在许多昆虫中发现抗菌肽或抗菌素。柞蚕抗菌素的基础研究比较雄厚，应用研究领域广泛。发明人经文献检索，查阅了相关资料表明，国内外有关抗菌肽的研究报导较多。通常从动物、植物、微生物中研究与开发天然食品防腐剂。在植物中，许多研究者发现，毛桃和杏核中的芳香精油成分、大蒜、洋葱中的辛辣组分、白菜汁中的非辛辣组分以及绿茶、苹果、腰果中的风味成分均含有抗菌有效成分。王南舟等人分别研究了甘草制剂、 连翘制剂、藻类和大蒜汁的抑菌防腐作用，发现它们对多种常见食品腐败菌具有广泛的抑制作用。甘露聚糖是广泛存在于自然界的一种多糖。据日本最近的研究发现，甘露聚糖是一种高效、经济的天然食品防腐剂，可以从魔芋、椰子、海藻等天然产物中提取，可用于水果、 蔬菜、豆制品、蛋类以及鱼类等许多食品的防腐保鲜。如在豆制品中添加的甘露聚糖，在梅雨季节，保质期可长达4天，而对照组仅放2天就发霉变臭。在动物体内也含有丰富的抗菌物质。人们对柞蚕抗菌肽进行抗菌谱研究，认为它对食品防腐有作用。从蟹壳、虾壳中提取的脱乙酰甲壳质，又称壳聚糖也有很强的抑真菌作用，当浓度为0.4%时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抗菌性，对革兰氏阴性菌和阳性菌亦有抗菌作用。利用微生物发酵法生产和制备天然食品防腐剂备受研究者的重视和关注，取得了令人瞩目的成果。如由链霉菌发酵产生的纳他霉素，由白色链霉菌产生的聚赖氨酸，由乳酸链球菌产生的乳酸链球菌素等。但迄今为止，尚未见由活体柞蚕蛹诱导与提取抗菌素的方法提取高活性柞蚕抗菌素的报导。
发明内容
本发明是基于以下构思柞蚕抗菌素是以柞蚕蛹为原料提取的，尤其我国长白山脉有大面积自然生长的柞林是盛产柞蚕蛹的优良基地，产地天然无污染，柞蚕蛹已被国家列为新资源食品。柞蚕蛹营养丰富、药食兼用，可以为人们提供高蛋白、低脂肪、低胆固醇以及维生素和某些矿物质。同时，昆虫体内往往含有特殊的活性成分，对人类的健康具有独特的功能。是天然绿色的高级营养品。提取工艺过程无污染，不使用任何化学药品。柞蚕抗菌素可直接开发保健食品，也可应用于食品添加剂，即可防止食品腐败，延长保质期，人食用后可提高肌体的免疫力。柞蚕抗菌素具有广谱的杀菌活性，人食用后易被体内的蛋白酶水解消化，而无任何副作用。通过以上同类研究比较分析可以说明一、柞蚕抗菌素的提取工艺与同类研究类似，有报导认为提取柞蚕抗菌素在批量生产上存在活性低等、且设备要求严格，成本较高等，本项提取技术解决了上述存在问题，具有实用性。二、柞蚕抗菌素的应用研究较多，但作为食品添加剂的研究，特别是在牛奶、冷却肉等食品上的应用尚未见系统报导，添补了本领域空白。具有先进性。三、柞蚕抗菌素作为食品添加剂，是一种新型的生物防腐剂，防腐效果好、安全性高，应用前景广阔。四、各种不同的诱导源对柞蚕蛹的基因的诱导效应不尽相同，而合成的抗菌物质在数量上、活性上有一定的差异。由此看来柞蚕蛹体的抗菌物质诱导应答体系将是一种独特的低级的免疫体系。因此，在选择诱导源时，选择诱导抗菌活性高、菌物易于培养、成本低、蚕蛹腐败少的诱导源，对提高分离提取抗菌素的效率是重要一环。本发明的目的是，对现有技术进行实质性改进，提供一种由活体柞蚕蛹诱导与提取抗菌素的方法，其方法的步骤选取科学合理，诱导的抗菌素活性值高，柞蚕蛹腐败少、蛹血保持清澈透明，抗菌素收率高，成本低，易于工厂化生产。本发明的目的是由以下技术方案来实现的一种由活体柞蚕蛹诱导与提取蚕抗菌素的方法，其特征是，它包含以下步骤(1)柞蚕茧在0 3°C条件下保存，试验前置于室温18 22°C、60 70%相对湿度条件下保存12 Mh ；(2)去除茧壳取出滞育蛹，选择去除滞育蛹中的死蛹、发育蛹；(3)柞蚕蛹用清水洗净，用65 75%酒精进行体表消毒；(4)微生物诱导源，用大肠杆菌E. COliK12A1菌苗作诱导源，其LB培养基配方为 IL溶液中，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，培养Mh，用同样培养基转接，在培养的菌液中加入36%甲醛溶液使之成为3%福尔马林溶液，在4°C放置M 168h，离心2500rpm， 15min，弃去上清液，沉淀的菌体用0. 9%氯化钠溶液洗涤、2500rpm，15min反复离心3次，所得菌体在大肠杆菌E. ColiK12D31固体培养基上，37°C培养Mh，确认无菌落生长，证明是死菌后，贮于冰箱中备用，用时将菌苗浓度调至IO8 105cellS/ml ；(5)诱导，经液体培养的大肠杆菌E. ColiK12D31菌苗用昆虫生理盐水稀释成每ml 含IO8 105cells，浓度每头蛹注射40 60μ 1，用微量注射器自蛹体背部节间膜处注入， 处理后的蚕蛹置于22 25°C、相对湿度60 80%条件下保护72 120h ；(6)柞蚕抗菌素的提取，将诱导72 120h的柞蚕蛹，提取蛹血浆、离心15000rpm， 4 10°C，20min,去除血球和脂肪球，取上清液，再离心12000rpm，4 6°C，5min,除去可溶性固形物，再在温度70 90°C，3 IOmin加热去除蛋白质，离心4000rpm，IOmin得上清液即为柞蚕抗菌素水溶液成品。本发明的一种由活体柞蚕蛹诱导与提取蚕抗菌素的方法，其方法简单，步骤选取科学合理，容易实施，诱导的抗菌素活性值高，蚕蛹腐败少、蛹血保持清澈透明，抗菌素收率高，成本低，易于工厂化生产。提取的柞蚕抗菌素作为一种新型的天然防腐剂可应用于食品，具有杀菌谱广、食用后易被体内蛋白酶水解消化、无任何毒副作用的特点，根据柞蚕抗菌素的性质将其添加到饮料、豆制品、奶制品中，可以延长保质期，还可以抑制肠道有害细菌的繁殖，增强人体免疫力。
具体实施例方式下面利用实施例对本发明作进一步描述。实施例1 一种由活体柞蚕蛹诱导与提取蚕抗菌素的方法，其特征是，它包含以下步骤
(1)柞蚕茧在0 3°C条件下保存，试验前置于室温18°C、60%相对湿度条件下保存 24h ；(2)去除茧壳取出滞育蛹，选择去除滞育蛹中的死蛹、发育蛹；(3)柞蚕蛹用清水洗净，用65 75%酒精进行体表消毒；(4)微生物诱导源，用大肠杆菌E. COliK12A1菌苗作诱导源，其LB培养基配方为 IL溶液中，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，培养Mh，用同样培养基转接，在培养的菌液中加入36%甲醛溶液使之成为3%福尔马林溶液，在4°C放置Mh，离心2500rpm，15min，弃去上清液，沉淀的菌体用0. 9%氯化钠溶液洗涤、反复离心3次2500rpm，5min，所得菌体在大肠杆菌固体培养基上，37°C培养Mh，确认无菌落生长，证明是死菌后，贮于冰箱中备用，用时将菌苗浓度调至IO8 105cells/ml ；(5)诱导，经液体培养的大肠杆菌E. ColiK12D31菌苗用昆虫生理盐水稀释成每ml 含IO8 IO5ceIls,浓度每头蛹注射40 μ 1，用微量注射器自蛹体背部节间膜处注入，处理后的蚕蛹置于22°C、相对湿度60%条件下保护72h ；(6)柞蚕抗菌素的提取，将诱导7 的柞蚕蛹，提取蛹血浆、离心15000rpm，4°C， 20min,去除血球和脂肪球，取上清液，再离心12000rpm，4°C，5min,除去可溶性固形物，再在温度70°C，3min加热去除蛋白质，离心4000rpm，lOmin，得上清液即为柞蚕抗菌素水溶液成 实施例2 —种由活体柞蚕蛹诱导与提取蚕抗菌素的方法，其特征是，它包含以下步骤(1)柞蚕茧在O 3°C条件下保存，试验前置于室温20°C、65%相对湿度条件下保存 18h ；(2)去除茧壳取出滞育蛹，选择去除滞育蛹中的死蛹、发育蛹；(3)柞蚕蛹用清水洗净，用65 75%酒精进行体表消毒；(4)微生物诱导源，用大肠杆菌E. COliK12A1菌苗作诱导源，其LB培养基配方为 IL溶液中，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，培养Mh，用同样培养基转接，在培养的菌液中加入36%甲醛溶液使之成为3%福尔马林溶液，在4°C放置96h，离心2500rpm，15min，弃去上清液，沉淀的菌体用0.9%氯化钠溶液洗涤、反复离心3次2500rpm lOmin，所得菌体在大肠杆菌E. ColiK12D31固体培养基上，37°C培养Mh，确认无菌落生长，证明是死菌后，贮于冰箱中备用，用时将菌苗浓度调至IO8 105cellS/ml ；(5)诱导，经液体培养的大肠杆菌E. ColiK12D31菌苗用昆虫生理盐水稀释成每ml 含IO8 105cells，浓度每头蛹注射50 μ 1，用微量注射器自蛹体背部节间膜处注入，处理后的蚕蛹置于23. 5°C、相对湿度70%条件下保护96h ；(6)柞蚕抗菌素的提取，将诱导的柞蚕蛹，提取蛹血浆、离心15000rpm，7°C， 20min,去除血球和脂肪球，取上清液，再离心12000rpm，5°C，5min,除去可溶性固形物，再在温度80°C，6min加热去除蛋白质，离心4000rpm IOmin得上清液即为柞蚕抗菌素水溶液成 实施例3 —种由活体柞蚕蛹诱导与提取蚕抗菌素的方法，其特征是，它包含以下步骤(1)柞蚕茧在O 3°C条件下保存，试验前置于室温22°C、70%相对湿度条件下保存 12h ；(2)去除茧壳取出滞育蛹，选择去除滞育蛹中的死蛹、发育蛹；(3)柞蚕蛹用清水洗净，用65 75%酒精进行体表消毒；(4)微生物诱导源，用大肠杆菌E. COliK12A1菌苗作诱导源，其LB培养基配方为 IL溶液中，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，培养Mh，用同样培养基转接，在培养的菌液中加入36%甲醛溶液使之成为3%福尔马林溶液，在4°C放置168h，离心2500rpm，15min,弃去上清液，沉淀的菌体用0.9%氯化钠溶液洗涤、反复离心3次2500rpm lOmin，所得菌体在大肠杆菌E. ColiK12D31固体培养基上，37°C培养Mh，确认无菌落生长，证明是死菌后，贮于冰箱中备用，用时将菌苗浓度调至IO8 105cellS/ml ；(5)诱导，经液体培养的大肠杆菌E. ColiK12D31菌苗用昆虫生理盐水稀释成每ml 含IO8 105cells，浓度每头蛹注射60 μ 1，用微量注射器自蛹体背部节间膜处注入，处理后的蚕蛹置于25°C、相对湿度60 80%条件下保护120h ；(6)柞蚕抗菌素的提取，将诱导120h的柞蚕蛹，提取蛹血浆、离心15000rpm，10°C, 20min,去除血球和脂肪球，取上清液，再离心12000rpm，6°C，5min,除去可溶性固形物，再在温度90°C，IOmin加热去除蛋白质，离心2500rpm IOmin,得上清液即为柞蚕抗菌素水溶液成品。柞蚕抗菌素水溶液成品可以直接用于食品添加剂，也可以按常规方法制成口服液或进一步采用通用的冷冻干燥制成干粉供使用。本发明的一种由活体柞蚕蛹诱导与提取蚕抗菌素的方法的具体实施方式
并非穷举，本领域技术人员不经过创造性劳动的任何变换均属于本发明权利要求所保护的范围。
权利要求
1. 一种由活体柞蚕蛹诱导与提取蚕抗菌素的方法，其特征是，它包含以下步骤(1)柞蚕茧在0 3°C条件下保存，试验前置于室温18 22°C、60 70%相对湿度条件下保存12 Mh ；(2)去除茧壳取出滞育蛹，选择去除滞育蛹中的死蛹、发育蛹；(3)柞蚕蛹用清水洗净，用65 75%酒精进行体表消毒；(4)微生物诱导源，用大肠杆菌E.ColiK12D31菌苗作诱导源，其LB培养基配方为1L培养液中，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，培养Mh，用同样培养基转接，在培养的菌液中加入36%甲醛溶液使之成为3%福尔马林溶液，在4°C放置M 168h，离心2500rpm，15min, 弃去上清液，沉淀的菌体用0. 9%氯化钠溶液洗涤、2500rpm，15min条件下反复离心3次，所得菌体在大肠杆菌E. ColiK12D31固体培养基上，37°C培养Mh，确认无菌落生长，证明是死菌后，贮于冰箱中备用，用时将菌苗浓度调至IO8 105cellS/ml ；(5)诱导，经液体培养的大肠杆菌E.ColiK12D3I菌苗用昆虫生理盐水稀释成每ml含 IO8 105cells，浓度每头柞蚕蛹注射40 60 μ 1，用微量注射器自蛹体背部节间膜处注入， 处理后的柞蚕蛹置于22 25°C、相对湿度60 80%条件下保护72 120h ；(6)柞蚕抗菌素的提取，将诱导72 120h的柞蚕蛹，提取蛹血浆、离心15000rpm，4 IO0C，20min,去除血球和脂肪球，取上清液，再离心12000rpm，4 6°C，5min,除去可溶性固形物，再在温度70 90°C，3 IOmin加热去除蛋白质，离心2500 4000rpm lOmin，得上清液即为柞蚕抗菌素水溶液成品。
全文摘要
本发明是一种由活体柞蚕蛹诱导与提取蚕抗菌素的方法，其特点是，它包含有柞蚕茧保存，去除茧壳选择滞育蛹，柞蚕蛹清洗、体表消毒，大肠杆菌E.coliK12D31菌苗的培养，诱导，提取柞蚕抗菌素等步骤，其方法的步骤选取科学合理，诱导的抗菌素活性值高，蚕蛹腐败少、蛹血保持清澈透明，抗菌素收率高，成本低，易于工厂化生产。提取的柞蚕抗菌素作为一种新型的天然防腐剂可应用于食品，具有杀菌谱广、食用后易被体内蛋白酶水解消化、无任何毒副作用的特点，根据柞蚕抗菌素的性质将其添加到饮料、豆制品、奶制品中，可以延长保质期，还可以抑制肠道有害细菌的繁殖，增强人体免疫力。
文档编号C07K14/435GK102206263SQ20111007769
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月23日 优先权日2011年3月23日
发明者刘隽彦, 李金志 申请人:吉林省蚕业科学研究院