专利名称：一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法
技术领域：
本发明公开一种ELISA方法，尤其涉及一种基于Angiogenin检测的双抗夹心 ELISA方法，属于医药生物检测技术领域。
背景技术：
血管生长素(Angiogenin，ANG)是存在于正常血浆及实体肿瘤组织中的一种分子量为14. lkD.pl 9. 5的蛋白质，基因定位于染色体14qll。ANG是一种能有效促进新生血管形成的刺激因子，具有很强的促血管生成作用，ANG被认为是促血管生成最主要的细胞因子之一。ANG最初是于1985年从人结肠癌细胞株HT-29的培养液中分离而得，随后在人血浆和牛乳中检测到它的存在，它属于核糖核酸酶超家族成员，一级结构与人胰核糖核酸酶有 35 %相同，具有微弱的核糖核酸酶活性。ANG是通过与血管内皮细胞表面的受体结合，激活胞内的第二信使而发挥一系列生物学作用(如介导细胞粘连、诱导细胞入侵、组织新生管状结构的形成等)，从而达到促进新生血管形成的作用。ANG促进新生血管形成的研究意义主要体现在三个方面(1)改善局部微循环，特别是在血循环较差的半月板纤维软骨的修复以及梗塞或创伤、烧伤等损伤组织中的重建侧枝循环等过程中发挥着重要的作用。(2)实体肿瘤的生长依赖于肿瘤内部血管的快速生长， 因此可以通过抑制ANG的生物学活性，阻止新生血管的形成从而达到治疗肿瘤的目的。(3) 研究表明，胰腺癌、乳腺癌等患者的外周血血清中，ANG的水平明显升高，血清ANG的水平与这些肿瘤的发展及转移呈显著正相关。另外，研究还表明，胃癌、肺癌、大肠癌及乳腺癌患者血清中ANG水平较正常对照明显增高，因此，可以通过检测血清及肿瘤组织中ANG的水平来预测肿瘤的发生与发展情况。
发明内容
针对上述问题，本发明公开一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法检测 ANG含量，用于肿瘤、自身免疫疾病等Angiogenin相关疾病的临床辅助诊断。本发明的技术方案是这样的一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法， 首先构建ANG2基因制备ANG2蛋白，再表达并纯化ANG2蛋白，以ANG2蛋白为抗原制备高效价和高特异性抗人ANG2单克隆抗体和ANG2多克隆抗体，以抗人ANG2多克隆抗体为捕获抗体，以生物素标记的抗人ANG2单克隆抗体为检测抗体，建立检测可溶性ANG2含量的双抗夹心ELISA方法。上述的一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法，其中，所述的构建ANG2 基因制备ANG2蛋白应用RT-PCR技术钓取ANG2基因序列，构建pET28a/ANG2重组表达质粒， 并转入大肠杆菌BL21宿主菌株中，IPTG诱导表达His-ANG2融合蛋白，镍柱亲和层析纯化 ANG2蛋白，采用SDS-PAGE分析表达。上述的一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法，其中，所述的ANG2单克隆抗体的制备工艺采用纯化的His-ANG2融合蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠和骨髓瘤细胞进行细胞融合，以HAT培养基选择培养，间接ELISA法筛选阳性孔，将克隆后的杂交瘤细胞接种入小鼠腹腔产生腹水，收集腹水并进行纯化。上述的一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法，其中，所述的ANG2多克隆抗体的制备工艺，其特征在于，采用纯化的His-ANG2融合蛋白免疫家兔，制备并纯化多克隆抗体。与现有技术相比，本发明具有检测方法简单，灵敏度高，为肿瘤及自身免疫疾病等 Angiogenin相关疾病的诊断、疗效观察及预后判断提供了一种简便、经济的检测方法，为研究Angiogenin蛋白功能及在肿瘤筛查诊断等方面奠定基础。说明书附1为双抗夹心ELISA标准曲线；横坐标为不同稀释浓度的ANG2抗原标准品，纵坐标为相应的0D450nm吸光值。
具体实施例方式下面结合具体实施例，对本发明做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。一、ANG2基因的构建、表达及纯化1 方法1. 1ANG2基因的钓取ANG2 基因 cDNA 序列1 ATGTGGCAGA TTGTTTTCTT TACTCTGAGC TGTGATCTTG TCTTGGCCGCAGCCTATAAC AACTTTCGGA AGAGCATGGA CAGCATAGGA AAGAAGCAAT101 ATCAGGTCCA GCATGGGTCC TGCAGCTACA CTTTCCTCCT GCCAGAGATGGACAACTGCC GCTCTTCCTC CAGCCCCTAC GTGTCCAATG CTGTGCAGAG201 GGACGCGCCG CTCGAATACG ATGACTCGGT GCAGAGGCTG CAAGTGCTGGAGAACATCAT GGAAAACAAC ACTCAGTGGC TAATGAAGCT TGAGAATTAT301 ATCCAGGACA ACATGAAGAA AGAAATGGTA GAGATACAGC AGAATGCAGTAGAACCAG ACGGCTGTGA TGATAGAAAT AGGGACAAAC CTGTTGAACC401 AAACAGCGGA GCAAACGCGG AAGTTAACTG ATGTGGAAGC CCAAGTATTAAATCAGACCA CGAGACTTGA ACTTCAGCTC TTGGAACACT CCCTCTCGAC501 AAACAAATTG GAAAAACAGA TTTTGGACCA GACCAGTGAA ATAAACAAATTGCAAGATAA GAACAGTTTC CTAGAAAAGA AGGTGCTAGC TATGGAAGAC601 AAGCACATCA TCCAACTACA GTCAATAAAA GAAGAGAAAG ATCAGCTACAGGTGTTAGTA TCCAAGCAAA ATTCCATCAT TGAAGAACTA GAAAAAAAAA701 TAGTGACTGC CACGGTGAAT AATTCAGTTC TTCAGAAGCA GCAACATGATCTCATGGAGA CAGTTAATAA CTTACTGACT ATGATGTCCA CATCAAACTC801 AGCTAAGGAC CCCACTGTTG CTAAAGAAGA ACAAATCAGC TTCAGAGACTGTGCTGAAGT ATTCAAATCA GGACACACCA CGAATGGCAT CTACACGTTA901 ACATTCCCTA ATTCTACAGA AGAGATCAAG GCCTACTGTG ACATGGAAGCTGGAGGAGGC GGGTGGACAA TTATTCAGCG ACGTGAGGAT GGCAGCGTTG
1001 ATTTTCAGAG GACTTGGAAA GAATATAAAG TGGGATTTGG TAACCCTTCAGGAGAATATT GGCTGGGAAA TGAGTTTGTT TCGCAACTGA CTAATCAGCA1101 ACGCTATGTG CTTAAAATAC ACCTTAAAGA CTGGGAAGGG AATGAGGCTTACTCATTGTA TGAACATTTC TATCTCTCAA GTGAAGAACT CAATTATAGG1201 ATTCACCTTA AAGGACTTAC AGGGACAGCC GGCAAAATAA GCAGCATCAGCCAACCAGGA AATGATTTTA GCACAAAGGA TGGAGACAAC GACAAATGTA1301 TTTGCAAATG TTCACAAATG CTAACAGGAG GCTGGTGGTT TGATGCATGTGGTCCTTCCA ACTTGAACGG AATGTACTAT CCACAGAGGC AGAACACAAA1401 TAAGTTCAAC GGCATTAAAT GGTACTACTG GAAAGGCTCA GGCTATTCGCTCAAGGCCAC AACCATGATG ATCCGACCAG CAGATTTCTA A根据Genebank中所提供的人ANG2mRNA序列(Genebank登录号NM001147)，设计带有限制性内切酶酶切位点的特异性引物，引物序列如下ANG2-F :5，-gcTCTAGAGAATTCatgtggcagattgttttcttac-3，(带有 EcoR I 酶切位占)ANG2-R :5，-tccCCCGGGAAGCTTgaaatctgctggtcggatca-3，(带有 Hind III 酶切位占)PCR反应程序94"C 4min ICycle
权利要求
1.一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法，其特征在于，首先构建ANG2基因制备ANG2蛋白，再表达并纯化ANG2蛋白，以ANG2蛋白为抗原制备高效价和高特异性抗人ANG2单克隆抗体和ANG2多克隆抗体，以抗人ANG2多克隆抗体为捕获抗体，以生物素标记的抗人ANG2单克隆抗体为检测抗体，建立检测可溶性ANG2含量的双抗夹心ELISA方法。
2.根据权利要求1所述的一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法，其特征在于，所述的构建ANG2基因制备ANG2蛋白应用RT-PCR技术钓取ANG2基因序列，构建pET28a/ ANG2重组表达质粒，并转入大肠杆菌BL21宿主菌株中，IPTG诱导表达His_ANG2融合蛋白， 镍柱亲和层析纯化ANG2蛋白，采用SDS-PAGE分析表达。
3.根据权利要求1所述的一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法，其特征在于，所述的ANG2单克隆抗体的制备工艺采用纯化的His-ANG2融合蛋白作为抗原，免疫 BALB/c小鼠和骨髓瘤细胞进行细胞融合，以HAT培养基选择培养，间接ELISA法筛选阳性孔，将克隆后的杂交瘤细胞接种入小鼠腹腔产生腹水，收集腹水并进行纯化。
4.根据权利要求1所述的一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法，其特征在于，所述的ANG2多克隆抗体的制备工艺，其特征在于，采用纯化的His-ANG2融合蛋白免疫家兔，制备并纯化多克隆抗体。
全文摘要
一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法，旨在提供一种方法简单，灵敏度高的检测ANG2含量的方法；其技术要点是首先构建ANG2基因制备ANG2蛋白，再表达并纯化ANG2蛋白，以ANG2蛋白为抗原制备高效价和高特异性抗人ANG2单克隆抗体和ANG2多克隆抗体，以抗人ANG2多克隆抗体为捕获抗体，以生物素标记的抗人ANG2单克隆抗体为检测抗体，建立检测可溶性ANG2含量的双抗夹心ELISA方法；本发明属于医药生物检测技术领域；可用于肿瘤及自身免疫疾病等Angiogenin相关疾病的诊断、疗效观察及预后判断，为研究Angiogenin蛋白功能及在肿瘤筛查诊断等方面奠定基础。
文档编号C07K14/515GK102221615SQ20111008108
公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者孙奋勇, 康贤通, 马纪 申请人:广州华灿医药科技有限公司