专利名称：一种柑桔黄单胞菌的快速检测胶体金试纸条的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫检测技术领域及纳米金示踪技术领域，具体涉及一种用于快速检测柑桔黄单胞菌的胶体金免疫层析试纸条。
背景技术：
柑桔溃荡病(Citrus bacterial canker disease, CBCD)是一种由柑桔黄单胞菌 iXanthomonas citri subsp.ciiri, Icc)所引起的，危害全世界柑桔种植业最严重的检疫性细菌病害[1]。该病能侵染绝大多数多种芸香科植物，包括柑桔属的绝大多数商品化栽培品种[2]。该病主要随带病种苗等繁殖材料远距离传播，发病严重时往往导致树势衰退，枯枝落叶、布满病斑、果实品质恶劣甚至未熟先落，严重影响柑桔的产量和质量[3]。由于抗病品种和特效药剂的匮乏，针对发病的植株仍然采用挖除病树集中烧毁的铲除方式M[5]。目前对该病的防控措施主要依靠加强植物检疫检测，早期诊断病害，切断传播源头。随着我国经济快速发展，柑桔产品的调运和交易更加频繁，人为传播的危险性急剧加大，在这样的形势下迫切需要更多更好的检测技术手段，特别是快速简便、可用于现场诊断的方法。胶体金溶液分散相中的金原子直径在广150nm之间，随着颗粒的大小不同溶胶颜色呈现由红到紫的变化。胶体金免疫技术(ICG)是以胶体金颗粒作为显色物质或示踪标记物[8]，标记于抗原或抗体上，直观反映抗原抗体之间相互作用的新型免疫标记技术·1(1]。胶体金颗粒本身无毒，能够迅速而稳定地吸附于所有生物大分子上，但不改变大分子的生物活性，因此作为一种安全的探针它可以进行切片定位及日常诊断技术[11]。其优点是快速、 灵敏、特异性强、稳定性好，且操作简便、无需任何仪器设备，结果判断直观可靠、易被基层人员掌握。
发明内容
本发明的目的是为了弥补当前检测技术的不足，提供一种快速、简便、灵敏、特异、 经济的柑桔黄单胞菌快速诊断胶体金试纸条。本发明提筛选高灵敏度抗体(ELISA效价达到1 :256，000倍)，研发出的单抗介导胶体金速测卡易于携带、使用方便，结果直观、保存简单，从制样到结果全过程仅需要10分钟，检测下限为lX103~4c/i//mL。目前为止荧光定量qPCR方法最为灵敏(IXlOlYfizAiL), 速测卡与qPCR法的结果符合率能达到95. 15%以上。在基层现场检疫时能够提供一定的帮助，仅需要对个别疑似样品进一步诊断，避免了大规模的送样检测，节省人力物力。研制的胶体金速测卡用于检测柑桔溃疡病，节约耗材，操作简单，灵敏度高，稳定性好，对基层实地检测起到极大帮助，具有极大的推广和实用价值。有益效果本发明具有的突出优点和实用性①特异性强；②稳定性好，批间/批内差异小，易于质量控制；③无毒无害，使用安全；④操作简便，无需仪器设备；⑤符号显示结果，自带质控对照，结果易于判断；⑥易于运输储藏。发明内容包括(1)筛选优质的单克隆抗体1、2。(2)制备大小为5 40nm纳米金颗粒。(3)各类缓冲液、层析材料的预处理液的配方。具体制作过程如下 (1)单克隆抗体的制备
用柑桔黄单胞菌Cfcc)全菌悬液免疫小白鼠，通过ELISA方法测定小鼠抗血清效价达到规定要求后，取免疫小鼠的淋巴组织(脾细胞)分离抗体分泌细胞在培养液中混悬加入96 孔板，在CO2培养箱中培养，将提前复苏的骨髓瘤细胞与脾细胞按1 :10或1 :5的比例混合在一起，在离心管中用不完全培养液洗涤，30s内缓慢滴加预热的PEG，静置90-120S后补加完全培养液，将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，CO2培养箱中培养，数天后镜下观察克隆细胞。ELISA方法检测筛选出能够稳定分泌Zcc单克隆抗体的阳性克隆细胞株1、2并进行扩大培养，方法是对小鼠腹腔接种降植烷或液体石蜡，7-10天后腹腔接种用 PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，数天后无菌注射器吸取腹水，对腹水进行纯化既得到单克隆抗体1、2。单克隆抗体1、2是针对抗原上不同的抗原决定簇，因此不会彼此结合， 并测定单抗的效价、特异性、稳定性。(2)胶体金标记单克隆抗体1的制备方法
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒并测定金颗粒大小约为5 40nm，15000rpm离心，制备储液。用K2CO3调节胶体金溶液至最适合pH8-10，搅拌并滴加Zcc单抗1 ；加入 5-15% BSA溶液封闭；加入0. 5 2 % PEG20000稳定；金标抗体4°C 15000rpm离心30min ；收集管底可流动的暗红色沉淀于保存液中(pH9. 8PBS+0. 5 1%PVA + 3 5%蔗糖+2 5%甘油+ Γ2% Tween20)[21]，4°C保存。(3)金标结合垫的制备
用预处理液(pH9. 8PBS+广2. 5%Tween20+0. θΓθ. 2%PVA+广2%casein)对金标垫进行预处理。将金标抗体喷涂于40mm X 5mm金标垫上。
(4)硝酸纤维素膜的处理
硝酸纤维素膜AE99用pH9. 8PBS浸泡后晾干，在距NC膜下端广1. 2cm处固定Zcc单抗 2作为检测线，距NC膜上端0. 5^0. 7cm处固定羊抗鼠抗体作为质控线，晾干后采用封闭液 (1 2%Tween20+l 2%Casein+l 2%BSA)封闭。
(5)胶体金试纸条的装配
试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬组成。分为4个部分加样区、标记物结合区、对比检测区、吸水区。用胶体金标记^fcc单抗1包被于标记物结合区， Ic单抗2包被于对比检测区的检测带上，羊抗鼠多抗平行包被于检测带后端作为质控线。 该试纸条利用免疫层析技术和双抗夹心法原理，通过对比检测区上检测线和质控线的颜色深浅，判断待测样品中浓度的高低，浓度越高检测线颜色比质控线越深。PVC塑料板便于检测时使用者握取，保持试纸条的洁净，整个过程要求避免其他污染物沾染。试纸条用铝箔袋密封，加入硅胶颗粒干燥剂，4°C可长期保持备用。(6)速测卡特异性测定
选择抗原菌以及其他11种植物致病菌、柑桔叶围附生菌及常见菌种作为供试菌种蜡质芽孢杆菌UaciB^s cerem)、大肠埃希氏菌(fecAericAia co/i)、水稻白叶枯病袁、Xanthomonas oryzae pv. oryzae)^^M'MM'MM ( Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)、苏云金芽抱杆菌{Bacillus thuringiensis)、枯草芽抱杆菌 {Bacillus subtil islif iXanthomonas campestris pv. campes tris Wtt
病菌solanacearum) 4种柑桔组织中分离的伴生菌(鉴定为黄单胞属其他种)， 均稀释成约为IXlO8个菌)的菌悬液，分别滴加70μ 到速测卡加样区，5min内观察结果。仅有测试Ic的速测卡C线和T线均出现呈阳性，其余11张速测卡仅出现C线呈阴性。说明速测卡对有很好的特异性，对其他11种供试菌种无明显交叉反应。如图3 所示图3中速测卡测试Zcc以及其他11种常见菌种。(7)速测卡灵敏度测定
将Ic菌悬液从1 X IQsCfufmL稀释到1 X Wcfu/mL,分别滴加70μ 到速测卡加样区， 5min内观察结果。根据结果，免疫金层析速测卡能够检测1X103~4浓度的Ic菌悬液。如图4所示
从右到左依次是Icc菌悬液1 X IQ9Cfu/mL到1 X IQ1CfufmL0
图1为本发明的结构示意图； 图2为图1的右视图3为柑桔黄单胞菌胶体金免疫层析速测卡测试Zcc和11种常见细菌菌株测定图； 图4为柑桔黄单胞菌胶体金免疫层析速测卡检测灵敏度测定图； 图5为本发明阴性结果检测图； 图6为本发明阳性结果检测图； 图7为本发明有待进一步检查的检测图； 图8为本发明无效结果的检测图。
具体实施例方式如图1、2所示，一种柑桔黄单胞菌的快速检测胶体金试纸条，PVC底板1表面上由下到上依次贴有加样垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，所述加样垫2上端搭接在结合垫3上；该结合垫3上端搭接在硝酸纤维素膜4上；所述吸水垫5下端也搭接在硝酸纤维素膜4上。其中所述结合垫3上包被柑桔黄单胞菌单克隆抗体1，所述硝酸纤维素膜4 上设置有检测线7和质控线6，所述检测线7包被柑桔黄单胞菌单克隆抗体2，所述质控线6 包被羊抗鼠抗体。柑桔黄单胞菌单克隆抗体1、2是用柑桔黄单胞菌免疫小白鼠，取免疫小鼠的脾细胞与小白鼠骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌柑桔黄单胞菌单克隆抗体的细胞株制得。实施例1 无病斑柑桔样品检测 (1)样品制备
5将疑似植物组织放入离心管中，加入无菌水，浸泡30min，为缩短浸泡时间可加以震荡， 静置数分钟吸取上清液离心，留管底少量残液滴加到速测卡加样区，5min内观察显色结果。(2)样品检测
在检测前将试纸条包装拿出，室温放置5分钟左右。取出试纸水平放置，将各待测样液用简易滴管分别吸取并滴加4滴于加样区圆形孔槽。5分钟内即可肉眼观察结果。(3)结果判定
如果检测线没有看到红色条带而质控线出现红色条带，说明检测结果呈阴性，待测样液不含1c，试纸条质量完好(如附图5所示)；如检测线和质控线都出现红色条带，或检测线颜色较质控线更深，则待测液中含有Ic且浓度高于lX103_4cfu/ml (如附图6所示);如果检测线颜色明显浅于质控线颜色，则待测液中可能存在浓度低近lX103_4cfu/ml的1c， 应作进一步检测验证(如附图7所示)；如果检测线出现红色条带而质控线没有条带出现说明试纸条效果失效，结果不可靠(如附图8所示)。实施例2
带疑似病斑的柑桔样品检测 (1)样品制备
将带有病斑的疑似植物组织选取少量放入小离心管中加无菌水浸泡并研磨。(2)样品检测
静置数分钟后吸取上清直接滴加到速测卡加样区，5min内观察显色结果。(3)结果判定
如果检测线没有看到红色条带而质控线出现红色条带，说明检测结果呈阴性，待测样液不含1c，试纸条质量完好(如附图5所示)；如检测线和质控线都出现红色条带，或检测线颜色较质控线更深，则待测液中含有Ic且浓度高于lX103_4cfu/ml (如附图6所示);如果检测线颜色明显浅于质控线颜色，则待测液中可能存在浓度低近lX103_4cfu/ml的1c， 应作进一步检测验证(如附图7所示)；如果检测线出现红色条带而质控线没有条带出现说明试纸条效果失效，结果不可靠(如附图8所示)。
权利要求
1.一种柑桔黄单胞菌的快速检测胶体金试纸条，包括PVC底板(1)，其特征在于所述 PVC底板(1)表面由下至上依次贴有加样垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，其中所述结合垫(3)上包被柑桔黄单胞菌单克隆抗体1，所述硝酸纤维素膜(4)上设置有检测线(7)和质控线(6)，所述检测线(7)包被柑桔黄单胞菌单克隆抗体2，所述质控线(6)包被羊抗鼠抗体。
2.根据权利要求1所述一种柑桔黄单胞菌的快速检测胶体金试纸条，其特征在于所述柑桔黄单胞菌单克隆抗体1、2是用柑桔黄单胞菌全菌免疫小白鼠，取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌柑桔黄单胞菌单克隆抗体的细胞株制得。
3.根据权利要求1所述一种柑桔黄单胞菌的快速检测胶体金试纸条，其特征在于所述加样垫(2)上端搭接在结合垫(3)上；该结合垫(3)上端搭接在硝酸纤维素膜(4)上；所述吸水垫(5)下端也搭接在硝酸纤维素膜(4)上。
全文摘要
本发明公开了一种柑桔黄单胞菌的快速检测胶体金试纸条，包括PVC底板(1)，其特征在于所述PVC底板(1)表面上由下到上依次贴有加样垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，其中所述结合垫(3)上包被柑桔黄单胞菌单克隆抗体1，所述硝酸纤维素膜(4)上设置有检测线(7)和质控线(6)，所述检测线(7)包被柑桔黄单胞菌单克隆抗体2，所述质控线(6)包被羊抗鼠抗体。本发明具有的突出优点和实用性①特异性强；②稳定性好，批间∕批内差异小，易于质量控制；③无毒无害，使用安全；④操作简便，无需仪器设备；⑤符号显示结果，自带质控对照，结果易于判断；⑥易于运输储藏。
文档编号C07K16/12GK102243239SQ20111010367
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月25日 优先权日2011年4月25日
发明者吴渝佳, 殷幼平, 王中康 申请人:重庆大学