专利名称：一种固相多肽合成蛋白溶菌素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白溶菌素的制备方法，具体涉及蛋白溶菌素的固相多肽合成制备方法。
背景技术：
中文名蛋白溶菌素
胃文名Protegrin, Iseganan 结构式
权利要求
1.本发明是一种固相多肽合成蛋白溶菌素的制备方法，包括如下步骤以Rink Amide MBHA树脂为起始原料，HBTU/HOBt为缩合剂，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，最后一个氨基酸使用Boc-Arg-OH · HC1，获得保护的十七肽树脂，然后加入切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀，获得还原型粗品；5-位和14-位Cys的-SH基用Trt保护，并在pH为8. 5 10. O的条件下用双氧水氧化；7-位和12-位Cys的-SH基用Acm保护，并在甲醇溶液中用碘氧化，获得双二硫键Cys5—14 Cys7-12粗品，最后采用高效液相C8柱进行分离纯化，获得目标产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，获得保护十七肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法，包括如下步骤(1)Fmoc-Arg (Pbf)-树脂的制备Rink Amide MBHA树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入六氢吡啶的DMF溶液， 22-24°C反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Arg (Pbf) -OH, HBTU, ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,将混合物 22_24°C接肽反应 70 分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的 Rink Amide MBHA 树脂取代量为0. 3-0. 6mmol/g ； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22- % ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(2)Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟； 抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU, HOBT, NMM，将混合物22_24°C接肽反应70分钟； 抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(3)Riioc-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟； 抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Val-OH，HBTU, HOBT, NMM，将混合物22_24°C接肽反应70分钟； 抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(4)Fmoc-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟； 抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Cys (Trt) -OH, HBTU, ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,将混合物 22_24°C 接肽反应 70 分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(5)Rnoc-Val-Cys CTrt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Val-OH，HBTU, HOBT, NMM，将混合物22_24°C反应接肽70分钟； 抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(6)Fmoc-Cys (Acm) -Val-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Cys (Acm) _0H、HBTU，ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,将混合物 22_24°C接肽反应 70 分抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(7)Fmoc-Phe-Cys (Acm) -Val-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg(Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Phe-OH，HBTU, HOBT, NMM，将混合物22_24°C接肽反应70分钟； 抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(8)Fmoc-Arg (Pbf) -Phe-Cys (Acm) -Val-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Arg(Pbf) -OH,HBTU,ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,将混合物 22_24°C接肽反应 70 分抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(9 ) Fmoc-Gly-Arg (Pbf) -Phe-Cys (Acm) -Val-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-树脂的制加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟； 抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU, HOBT, NMM，将混合物22_24°C接肽反应70分钟； 抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ；六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(10)Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf) -树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟； 抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Arg (Pbf) -OH, HBTU, ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,将混合物 22_24°C接肽反应 70 分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(11)Fmoc-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly -Arg (I^bf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟； 抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Cys (Acm) _0H、HBTU，ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,将混合物 22_24°C接肽反应 70 分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(12)Fmoc-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt )-Val-Gly- Arg (Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Tyr (tBu) -OH, HBTU, ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,将混合物 22_24°C 接肽反应 70 分钟；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(13)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Va I-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟；抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Cys (Trt) -OH, HBTU, HOBT, NMM,将混合物22_24°C接肽反应1小时；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(14)Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys (Acm) -Val- Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟； 抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Leu-OH、HBTU, HOBT, NMM,将混合物22_24°C接肽反应70分钟； 抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(15)Fmoc-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys (Acm) -Val -Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟； 抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU, HOBT, NMM，将混合物22_24°C接肽反应70分钟； 抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(16)Fmoc-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe -Cys (Acm) -Val -Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟； 抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU, HOBT, NMM，将混合物22_24°C接肽反应70分钟； 抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(17)Boc-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys (Acm) -Val-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-树脂的制备加入六氢吡啶的DMF溶液，22-24°C反应30分钟； 抽干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；加入溶于DMF的Boc-Arg-OH · HCl · H2O, DIC, Η0ΒΤ，将混合物20_22°C接肽反应11小时；抽干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，抽干；再用无水甲醇洗涤三次；抽干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护17肽树脂； 所说的六氢吡啶的DMF溶液的浓度为22-24% ； 六氢吡啶的反应温度为22-M°C ；(18)H-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(H)-Tyr-Cys(Acm)-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys(Acm)-Val-Cy s (H) -Val -Gly -Arg-NH2 的制备保护的十七肽树脂转移到切肽瓶中，冷却下，边搅拌边加入切肽试剂，15-18°C搅拌下进行切肽反应3. 5-4. 5小时；过滤，抽干，滤液加无水乙醚沉淀，得到还原型十七肽粗品；(19)
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(18)中，所说的切肽试剂为TFA/ TIS/EDT/H20 = 3600ml/160ml/100ml/40ml ；反应温度为15 18°C ；反应搅拌时间为 3. 5 4. 5小时。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(19)中，5-位和14-位Cys的-SH基用Trt保护，并在pH为8. 5 10. 0的条件下用双氧水氧化。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(20)中，7-位和12-位Cys的-SH基用Acm保护，并在甲醇溶液中用碘氧化；搅拌约30-90分钟，滴加10%硫代硫酸钠溶液终止反应；减压除去甲醇，用四氯化碳提取回收碘3-5次。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(21)中，所说的流动相中磷酸三乙胺水溶液的浓度为0. 08 0. 25mol/L ；磷酸三乙胺水溶液在乙腈中所占比例为14. 5 25. 0 ；检测波长为:260-280nm ；C8 填料为10μ，200Α。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)至步骤(16)中接肽反应温度为 20-22°C，接肽反应时间60-80分钟；步骤(17)中接肽反应温度为20_22°C，接肽反应时间 10-12小时。
全文摘要
本发明公开了一种固相多肽合成蛋白溶菌素的制备方法，本发明的技术方案包括以下步骤以RinkAmideMBHA树脂为起始原料，HBTU/HOBt为缩合剂，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，最后一个氨基酸使用Boc-Arg-OH·HCl，获得保护的十七肽树脂，然后加入切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀，获得还原型粗品。5-位和14-位Cys的-SH基用Trt保护，并在pH为8.5～10.0的条件下用双氧水氧化；7-位和12-位Cys的-SH基用Acm保护，并在甲醇溶液中用碘氧化，获得双二硫键Cys5-14Cys7-12粗品，最后采用C8高效液相柱进行分离纯化，获得目标产物，纯度为99.21％，总收率为23.68%。本发明的方法，生产成本低，工艺简单，环境污染低，产率高，便于工业化实施。
文档编号C07K1/20GK102336813SQ20111018331
公开日2012年2月1日 申请日期2011年7月1日 优先权日2011年7月1日
发明者周逸明, 崔颀, 蔡华成 申请人:上海苏豪逸明制药有限公司, 周逸明, 崔颀